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高级生物化学

华东理工大学2014-2015学年第一学期

《高级生物化学》课程论文

班级：

生物化学与分子生物学学生姓名：

孙婉菊学号：

010140133

开课学院：

生物工程学院任课教师：

魏东芝成绩：

论文题目：

合成生物技术在甾体药物生产中的应用

论文要求：

根据所选文献，自拟方向，写一篇综述，综述文字内容（宋体小四）不少于4页，可以配合图表说明（图表不计入字符数）。

论文结构包括：

题目、摘要、关键词、正文、参考文献（文中所引用的已公开发表的文献书目，集中顺序列表于文末）。

教师评语：

教师签字：

年月日

合成生物技术在甾体药物生产中的应用

摘　要：

甾体类药物是销售额仅次于抗生素的世界第二大类药物，多种甾体药物均由甾体激素中间体衍生而来。

甾体激素中间体的传统生产方法有植物提取皂素法和化学全合成法，后者由于其对环境有害，反应产物结构不单一且成本较高，不利于工业化生产。

目前主要采用微生物对特殊原料进行转化的半合成法，但存在微生物转化率低、发酵周期长等问题。

合成生物学的出现为构建利用糖为唯一碳源生产甾体激素药物的人工细胞提供了理论上的可行性和可靠的技术支持。

文章重点综述了甾体转化菌株的选育改良、分子改造及合成生物技术在甾体中间药物生产中的应用，以有利于工业发酵的酿酒酵母、分枝杆菌等为底盘细胞，通过引入外源合成功能模块，实现胆甾醇、雄烯二酮等甾体激素中间体的生物合成，以期推动甾体类药物生物制造技术的进步。

关键词：

甾体药物；化学全合成法；半合成法；合成生物技术

甾体类药物是指分子结构中含有环戊烷多氢菲母核结构的激素类药物，如泼尼松、倍他米松、氢化可的松等，具有很强的抗过敏、抗感染、抗病毒等药理活性，已被广泛应用于治疗内分泌失调、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、皮肤病、风湿病、老年性疾病等[1-2]。

目前，已知的甾体药物有300多种，其数量还在持续增长，被列为最具有市场价值的药物，同时也是世界上仅次于抗生素的第二大类药物[3]。

随着各国经济发展和居民生活水平提高，人们对甾体类药物的需求将不断增加，甾体激素中间体的市场空间广阔。

甾体生物转化为新型甾体类药物、有效的甾体药物原材料及关键中间体的合成提供了一条新途径。

目前，甾体药物的合成主要集中在以甾体母核结构的天然产物为原料、采用化学合成法和微生物催化半合成法相结合的方式来合成甾体药物。

甾体生物转化即利用微生物酶对甾体底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物。

综合国内外研究，生物转化技术在甾体药物生产中的应用主要有两类:

①将天然原料转化为生产甾体化合物的普通中间体，如利用微生物降解植物甾醇（豆甾醇、谷甾醇、菜油固醇）边链生成甾体医药中间体，主要有雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）及雄甾-1,4二烯-3,17-二酮（ADD）；②对甾体药物的特定位点进行修饰，生成具有生物活性但通过化学法难以合成的化合物，如9α、11α、11β、7α、15α等位点的羟化，Δ1脱氢及A环的芳香化等[4]。

甾体生物转化反应的多样性，不仅解决了化学合成法步骤多、效率低、成本高和污染大的缺点，而且为甾体药物的合成提供了更多的途径。

因此，生物转化技术作为甾体药物合成工艺中的补充替代途径，将成为甾体医药工业的关键生产技术。

然而，在甾体类化合物的生物转化过程中，底物甾醇的溶解性差、培养基传质效率低、底物产物的反馈抑制和全细胞生物催化副产物多，菌株的转化能力低和甾体的整体转化效率偏低，是甾体生物转化技术实现工业化的主要瓶颈。

本文结合近些年生物转化法在合成甾体药物领域的突出成果，从甾体药物合成所需的原料、甾体转化菌种的选育及改良及合成生物技术在甾体药物生产中的应用等方面进行综述。

1微生物转化法生产甾体药物所用原料

1.1以植物皂素为原料

从植物中提取的皂角苷配基、薯蓣皂苷配基是甾体药物生产的主要原料来源，其中以薯蓣皂素为主，薯蓣皂素经六步Marker降解，裂解E环并去掉F环，生成C21的双烯醇酮醋酸酯（简称双烯）等中间体，再经繁复的化学反应和微生物转化反应，生成环氧黄体酮、霉菌氧化物、17羟黄体酮等中间体，最终以极低的收率获得甾体药物或其它甾体[5-6]。

然而，通过化学法转化皂角苷配基合成合成甾体药物具有明显的弊端：

生产工艺复杂，合成步骤多，周期长，成本高，收率低，污染严重，环保压力大，浪费土地资源[7]。

尽管如此，在很多国家，皂角苷配基、薯蓣皂苷配基还是甾体药物工业生产中所用的主要原料[8]。

目前全国的种植面积已达120万亩以上，薯蓣皂苷配基的产量达到5000吨/年。

黄姜除了提取薯蓣皂素和甾体总皂苷外，几无它用，这就意味着仅为了生产甾体，我国耗用了大量的土地资源。

多年来，薯蓣皂素的价格一直居高不下，原料的高价格势必造成甾体药物生产制造的高成本。

因此，需要积极努力开发新型甾体原料资源，研究收率高、成本低、环境污染小的绿色工艺，迎头赶上世界先进水平，成为甾体激素药物产业的强国。

1.2以动植物甾醇为原料

来源于豆类植物或油脂加工等过程的副产物的植物甾醇和胆固醇，β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等3β位含有羟基，5,6位含有双键及17位含有脂肪族链的甾醇类，常用于甾体药物的合成。

利用分枝杆菌等微生物，通过降解转化甾醇得到雄甾烯酮等不同结构的C19或C22甾体化合物，再经复杂的化学和微生物转化反应制得AD、ADD或9α-OH-AD等甾体药物中间体或甾体药物[9]。

微生物选择性降解边链技术使得植物甾醇得以有效利用，成为薯蓣皂素的替补资源，且能有效解决水解黄姜所带来的环境污染问题。

胆固醇是近些年另外一种比较受关注的甾体药物新资源，主要是从猪、牛、鱼等动物的脂肪和油中提取。

胆固醇的边链降解与植物甾醇类似，在C17位断裂氧化形成17-甾酮[10]。

在所有的天然甾醇中，β-谷甾醇和胆固醇是最适合生产17-甾酮类产品的，但胆固醇比β-谷甾醇的生物利用程度低，因此由胆固醇生产17-甾酮的成本较高。

其他甾醇原料，如存在于酵母及真菌中的麦角甾醇，又称麦角固醇，是一种重要的医药化工原料，可用于氢化可的松、黄体酮等药物的生产[11]。

羊毛固醇及其衍生物经分枝杆菌Mycobacteriumsp．NRRLB3805降解边链、脱氢作用后均能形成甾体药物的前体物质。

近年来，有研究运用合成生物技术构建用于合成甾体药物的甾体骨架原料[12]。

用于合成甾体药物的原料来源虽然广泛，但这些物质C17位上基本都有一个侧链，需要复杂的边链降解反应才能形成药物中间体，因此寻找新型、有效的甾体药物前体原料仍甾体生物转化方向的热点之一。

2甾体生物转化涉及的反应类型

2.1羟基化

微生物可以在甾体母核或侧链上的任意位置引入至少一个羟基基团，使甾体分子具有药用活性。

微生物转化是一种解决在化学方法中不活跃碳原子羟基化难题的最有效的途径。

甾体的羟基化对于甾体的功能性是一种最重要的反应。

相比弱极性的非羟基化的甾体物质，羟基化的甾体具备的生理活性更高。

2.2还原反应

C17位的氧化还原反应是一类重要的甾体还原反应。

不同的微生物都具有催化甾体C17β-还原反应的能力。

然而，只有棉豆旋胞腔菌m118中的C17β-羟甾体脱氢酶是仅有的完全定性的真菌17β-羟基还原酶[13]。

2.3脱氢反应

目前在甾体药物及中间体的生产过程中，一个非常重要的生物转化反应类型是甾体母核上的A环的C1位和C2位之间的脱氢反应，作用于这一步脱氢反应的微生物主要有节杆菌属、假单胞菌属、分枝杆菌属、芽孢杆菌属、红球菌属以及诺卡氏菌属等。

这些菌株对甾体的生物转化不同于一般的微生物次级代谢过程，它是利用微生物的一种酶或多种酶组成的酶系发挥作用。

在甾体母核上的A环的C1位和C2位之间的脱氢反应是由甾体甾酮C1,2-脱氢酶（KstD）[14,15]催化的。

甾酮C1,2-脱氢酶的辅酶（黄素蛋白），一般位于细菌的细胞膜上，能在甾酮化合物的C1位和C2位之间发生脱氢反应产生双键，提高甾体药物的抗炎能力，在甾体药物的生产及药效上有重要作用。

2.4甾体母核氧化

甾醇的生物转化是从3β-羟-5烯化合物到3β-酮-4烯化合物的转化开始的。

胆固醇氧化酶（3β-羟基-甾体氧化酶）在这个过程中的作用已被阐明。

有研究指出胆固醇氧化酶（ChoD）在快速生长的AD产生菌分枝杆菌VKMAc-1815D甾醇的分解代谢过程并不具有决定性作用的，而且胆固醇的氧化酶（ChoD）敲除后，甾醇A环的氧化依然能够进行[16]。

在红球菌CECT3014中，胆固醇的氧化酶（ChoG）是一类主要的可诱导胞外胆固醇氧化酶，但是这种酶的破坏不会影响细胞在胆固醇中的生长[17]。

在戈登氏菌CECT7408T中，两种胆固醇氧化酶（ChoOx-2）目标基因的失活使这类突变菌不能利用甾体生长[18]。

在新金分枝杆菌中，胆固醇氧化酶（ChoM1和ChoM2）对该菌利用植物甾醇作为碳源起很重要的作用。

2.5侧链降解

通常情况下，微生物对甾体边链的降解反应在甾体化合物生成后并没有结束，还常伴有甾体母核的降解反应。

Sih等[19]已基本研究清楚微生物降解胆固醇的一般反应途径：

甾醇首先被氧化成3-酮-△4化合物，由于所用微生物的不同，该化合物由C-1,2脱氢和9α位羟化得到中间化合物，此化合物再经A环芳香化与B环开裂，最终把甾体母核降解。

3甾体微生物转化菌种的选育与改良

目前，微生物转化法生成的甾药中间体主要有C19甾体：

雄甾-4-烯-3,17-二酮（4AD）、雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）、9α-OH-AD、睾酮和去氢睾酮；C21甾体药物中间体：

孕烯醇酮；C22甾体：

20-羧基-孕酮，20-羟甲基-孕酮及其9α羟基衍生物等。

AD和ADD是最具有市场价值的甾体药物中间体，对其活性部位进行结构改造，可用于合成多种皮质类固醇，如盐皮质甾醇、口服避孕药等其他甾体药物[20]。

放线菌常用于睾酮的生产。

由植物甾醇获得去氢睾酮包括两步微生物催化反应，即通过放线菌获得AD，再经镰刀菌对AD的1,2位碳脱氢。

最近有研究发现通过单级微生物作用，由3位取代的麦角固醇合成雄甾-5,7-二烯-17-酮，此中间体是合成维生素衍生物的重要前体。

除了C19甾体，微生物还能转化甾醇生成C23、C24甾体物质，这些物质是糖皮质激素合成的重要前体。

例如，通过氧化脱羧作用，9α羟基化的C22甾体很容易转化为C21糖皮质激素。

节杆菌属、短杆菌属、假单胞菌属和红球菌属等许多微生物菌种被用作甾醇转化的催化剂，生成甾体药物或活性药物成分。

虽然微生物转化植物甾醇生成C19、C22甾体有很多优点：

反应步骤少、环境友好、成本低等。

但是仍有不足，一方面，底物甾体类物质通常具有较强的疏水性，使得其难以扩散进入细胞与转化酶进行有效接触，从而甾体转化率低；另一方面，菌株的催化能力低且选择性差，在一定程度上限制了甾体药物的生产[21]。

因此，需要大规模从自然界筛选特定功能的催化剂，或对原有的催化剂进行改造来选育高产菌株。

目前在高产菌株的选育中，采用单孢子或原生质体诱变并结合特定的筛选方法进行筛选仍然是普遍应用并十分有效的方法。

随着基因工程技术的日益完备，采用分子生物学手段对菌种的分子改造，以及运用合成生物学技术构建甾体转化新元件及功能模块，在甾体药物生产中的应用也日益广泛。

3.1传统分离筛选与诱变选育法

菌株的筛选、分离在甾体药物生产中一直维持着重要的竞争优势。

用来生产AD、ADD的菌种大都是从环境中筛选而来的。

Malaviya[22]等通过传统的筛选方法获得产AD的菌株AspergillusoryzaeNCIM634。

Lin[23]等从土壤中分离到的Fusariummoniliforme能转化玉米粉和黄豆粉中的植物甾醇生成AD。

Liu[24]等从美洲豹Neofelisnebulosa的粪便中分离得到能有效转化胆固醇生产ADD的菌株GordonianeofelifaecisNRRLB-59395。

另外，诱变育种方法一直是优化菌种获得增强活性和侧链降解效率的新菌株的有效方法。

传统的诱变育种方法得到了如分枝杆菌NRRLB-3805以及分枝杆菌NRRLB-3683等经典菌株，它们可以利用甾醇产AD或ADD。

3.2菌株的分子改造

将基因工程成熟的技术手段应用甾体微生物转化，如采用基因工程技术敲除某些旁路酶基因，解决产物进一步降解及其他副产物的问题。

例如Brzostek等[25]在研究Mycobacterium降解植物甾醇时，敲除羟化酶基因后能部分抑制母核的降解，这可能是因为9α-羟化酶具有同工酶，或者编码9α-羟化酶的是一个基因簇，9α羟化是这些酶共同作用的结果。

魏巍等[26]从新金分枝杆菌NwIB-01中克隆出影响AD与ADD相互转化合成的关键酶基因：

3-甾酮-△1-脱氢酶（KsdD）及3-甾酮-9α-羟化酶（KSH）基因，运用基因工程技术对这两个关键酶基因进行敲除、强化等操作，构建出能有效积累ADD的基因工程菌。

绍名龙等[27]将来自新金分枝杆菌MycobacteriumneoaurumJC-12的胆固醇氧化酶基因choM1、choM2在Bacillussubtilis中重组表达，胆固醇氧化酶ChoM1、ChoM2的活力较原分枝杆菌分别提高了5.2倍和7.3倍。

通过分子生物学手段，获得某个或某些关键酶的基因并在合适的宿主中表达，提高甾体羟基化反应的效率。

研究者们将甾体P450酶在工程菌中进行异源表达。

例如，将能够催化甾体17α羟化和C17,20裂解酶反应的全功能人的基因P45017α（CYP17）在毕赤酵母GS115中表达，表达的酶能够催化黄体酮生成17α羟基孕酮和16-羟基孕酮[28]。

羟化反应的效率也可以通过P450氧化酶与辅酶共表达来实现。

Pertric等[29]将来源于米根霉的11α-羟化酶（CYP509C12）与依赖于NAD（P）H的P450还原酶在分泌型表达的酵母宿主中共表达，与仅表达11α羟化酶（CYP509C12）相比，11α羟化反应的速率提高了7倍。

人线粒体CYP11B1与肾上腺皮质的铁氧还蛋白（Adx）和肾上腺皮质的铁氧还蛋白（AdR）在小米啤酒裂殖酵母NCYC2036共表达后可以进行11-脱氧皮质醇的11β羟基化反应[30]。

3.3合成生物学技术在甾体药物生产中的应用

将基因元件（启动子、转录调控区域、核糖体结合位点、开放阅读框、终止子等）依据工程化目标需要，有机重构和连接起来，便形成了功能基因模块。

通过对已有生物网络加以利用，同时引入新的功能基因模块，实现甾体化合物和甾体激素药物的形成或转化。

3.3.1甾体转化重组菌的构建

运用合成生物学手段，将合成甾体化合物的整个代谢途径打通，实现了单一微生物的多步转化。

一个最为典型的例子就是，Transgene公司和Aventis公司研究员通过引入哺乳动物蛋白CYP11A1、matADX、matADR、线粒体靶向的ADX、CYP11B1、3β-HSD、CYP17A1、CYP21A1，在酿酒酵母中异源表达，使得原本仅产生麦角甾醇的酵母菌能在利用糖和醇的培养条件下产生氢化可的松，首次实现了酿酒酵母中氢化可的松的全生物合成；并对路径进行了优化，包括对NCP1、ARH1两个线粒体系统的调控以及敲除基因ATF2、GCY1、YPR1以抑制副产物的生成，最终使氢化可的松的产量提高23倍，达到11.5mg/L，占总固醇的70%[31]。

该工作证明了由高级真核微生物的复杂代谢途径转移到低等微生物中的可行性。

但重组菌种以20g/L葡萄糖转化时，最高获得氢化可的松的质量浓度仅为（11.5±0.3）mg/L。

3.3.2甾体转化的底盘细胞构建

德国柏林工业大学的ChristineLang课题组对酿酒酵母内源固醇生物合成途径中的关键调控基因进行了研究，通过酵母生产非酵母的甾醇，通过上调基因tHMGR的表达，敲除ERG5和ERG6基因，引入脊椎动物来源的甾醇C24-还原酶DHCR24，成功在酵母中生产7-脱氢胆甾醇。

进一步地将脊椎动物胆固醇C25-羟化酶与7-脱氢胆甾醇和麦角固醇结合，获得了生产25-羟基-7-脱氢胆甾醇和25-羟基麦角固醇的酵母菌株[32]。

2011年，瑞士日内瓦大学与奥地利格拉茨工业大学合作研究，通过敲除固醇C-24甲基转移酶基因ERG6和固醇C-22脱氢酶基因ERG5，分别引入非洲爪产蟾、人源、鱼源的固醇C-7还原酶、固醇C-24还原酶，构建得到稳定生产胆固醇的酵母菌株RH6829，且鱼源的基因表达效果最佳，胆固醇产量约为1mg/L细胞湿重[33]。

3.3.3用于生产甾体激素中间体的功能模块的构建

在已经优化构建的酿酒酵母底盘细胞中，以外源固醇分子为底物，合理搭配元件，构建人工合成功能模块，可实现不同甾体激素中间体的合成。

1998年，法国国家科学研究所分子遗传学中心的DenisPompon与Transgene公司合作研究，敲除酵母内源基因固醇C-22脱氢酶，同时引入拟南芥C-7还原酶，共表达牛细胞侧链降解细胞色素P450、ADX、ADR，实现了从单一碳源到孕烯醇酮的生物合成，产量达到60mg/L；该研究组进一步引入人源3β-羟基类固醇脱氢酶，将孕烯醇酮转化为孕酮[34]。

Kolar等将能够催化甾体17α羟化和C17,20裂解酶反应的全功能人的细胞色素P45017α（CYP17）基因在毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115中表达，表达的酶能够催化黄体酮生成17α-羟基孕酮和16α-羟基孕酮[35]。

4结语

近年来，生物转化技术显示出化学合成技术所无法取代的优势，吸引了大批国内外研究者对甾体生物转化技术进行研究和改进。

在人工合成生物体系、人类健康、能源等领域的重大需求牵引下，合成生物技术将不断发展。

在菌种的选育及改良、高效的甾体激素生物合成平台及产品的设计构建等方面取得了显著的成果。

为了解决药物需求与环境、植物资源的突出矛盾，需要实现重要的植物源医药产品的从碳源合成出发，以人工细胞合成替代天然提取，为国民经济带来巨大效益的同时，也为资源环境的合理利用、科技进步、产业调整、经济增长方式的转型提供巨大推动力，从而提升我国的战略国际地位和综合国力。

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