10液相色谱串联质谱联用技术实验指导许煊炜.docx
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10液相色谱串联质谱联用技术实验指导许煊炜
10-液相色谱串联质谱联用技术-实验指导（许煊炜）
液相色谱串联质谱联用仪检测技术
实验指导
（2014、2015级）
课程内容（一个实验8学时）：
（1）ABSciexQtrap4500三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。
（2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。
吉林农业大学农业部参茸质检中心
2017.03
实验一ABSciexQtrap4500三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用
一.实验目的和意义
通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。
培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。
（一）检测仪器
1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。
型号：
4500QTRAP（美国AppliedBiosystems公司）。
2、仪器组成液相色谱部分：
岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分：
QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱。
3、主要性能指标离子化方式：
ESI电离质量范围：
（5~1700）amu分辨率：
>6900质量稳定性：
0.1amu/12h灵敏度：
1pgreserpine,ESI+,MRM扫描（m/z:
609/195），信噪比S/N>120:
1扫描速度：
4000amu/sec质量准确度：
<0.01%（全质量数范围）
4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。
在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。
4500QTRAP的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成。
Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。
各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。
4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。
整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成。
（二）样品
1、样品要求本仪器适合分子量在5~1700amu范围内的有机样品的定性及定量分析。
待测样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中。
若样品或配制的样品溶液发生沉淀、挥发、变质等异常现象时，应重新取样或重新配制溶液。
2、试剂要求所有的试剂均选用色谱纯级，所用水的电导率应大于18KΩ。
流动相必须用0.2µm或0.45µm滤膜过滤后方可使用。
3、分离条件要求在液相色谱仪上确定分离条件，使待测组分能完全分离，且该色谱条件中流动相不应含有不挥发性盐，如磷酸盐。
（三）、操作步骤实施检测操作的人员，必须熟悉该仪器的操作规程，仪器的工作状态、包括检测灵敏度和分辨率，必须满足检测项目的要求。
1、开机前准备开机前应检查仪器室内电、气的供应情况及空调机的工作状态是否稳定，检查真空机械泵泵油是否需要更换。
只有当UPS工作正常，Gas1/Gas2、CurtainGas和ExhaustGas的压力分别稳定在0.35、0.35和0.7Mpa，环境温度为10~30℃，相对湿度小于70%时才能开机。
2、开机1）打开真空机械泵上的电源开关。
2）真空机械泵继续工作至少15分钟后，打开MS电源主开关。
3）等真空度达到2×10-5Torr（绿色指示灯不闪）后，打开PC计算机电源
3、仪器调谐
（四）、方法建立
1.在Analyst软件Tools菜单中选择Project→CreateProject。
在Projectname项下输入新建的Project名称。
注意，不要点选窗口中的其他按钮！
点击OK，确认新建Project。
2.在Analyst软件界面下，双击导航栏内HardwareConfiguration。
在弹出窗口中选择MassOnly，点击ActivateProfile，激活MassOnly（只联接质谱主机）。
3.在导航栏内单击TuneandCalibrate，进入调谐模式。
点击上方工具条中的T钮。
此时，应注意到主机有“扑”声音，表明进入调谐状态。
此时右下角质谱状态显示绿色。
双击ManualTuning，进入质谱参数设置及运行窗口。
4.使用1mL玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。
点击MSMethod下拉菜单，选择SyringePumpMethod，设定针泵流速FlowRate为10μL/min。
5.点击StartSyringePump按钮开针泵进样。
6.返回MSMethod，选择扫描模式ScanType为Q1MS，设定扫描速度ScanRate为10Da/s，设定扫描范围Start——Stop设定为50——化合物分子量。
DP预输入60。
7.点击start开始采集数据。
运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值在约E4以下。
点击stop，选择第一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子。
点击右键，选择DeletePane。
8.设定Scantype为产物离子扫描ProductIon（Ms2），扫描速度200Da/s，选择扫描正/负离子，输入母离子（productof），设定扫描范围start——stop为50——MW+20，覆盖可能的子离子质量范围，点击compoud标签，设定（DP）60，（CE）5。
9.点击start，开始采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现。
手动调节CE，以5eV为步长，逐渐增加。
每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。
选择平稳的一段，双击，选择子离子。
10.选择ScanType为MRM。
设定参数表格中的Q1对应的母离子，Q3对应的子离子，time（ms）为50，ID值设为名称1（定量），名称2（定性）。
11.点击EditRamp，在Parameter下选择CollisionEnergy，点击OK。
点击start开始采集数据，记录每个MRM通道的最佳CE电压。
在MRM参数设定表中，右键点击。
选择CollisionEnergyCE，调出表格中的CE列，输入每个MRM通道的最佳CE电压值，精确到个位数。
重复以上步骤，在Parameter项下选择DeclusteringPotential，优化并保存DP。
完成后选择菜单File/Save保存采样方法，[文件名].dam。
（五）LCMS方法的建立：
1、连接仪器：
打开HPLC质谱电源，将HPLC系统接上柱子，将6号出口管线与离子源连好。
调离子源喷雾针位置到2mm处，双击HardwareConfigure，在硬件配置菜单下单击LCMS（液相与质谱联用），单击Activateprofile激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器已经连接上。
2、确认液质同步：
选择项目（之前优化方法的时候已经建立的项目）；双击Buildacquisitionmethod新建方法，弹出新建方法模板。
在模板左侧点击acquisitionmethod，模板右边显示对应的参数，确认synchronizationmode选择LCSync,表示液质同步。
3、设置MRM参数：
点击方法模板左侧的MRM,在模板右侧ScanType下选择MRM；在polarity下选择化合物极性：
Positive（正离子）、Negative（负离子）；Duration为15min（与液相分离相同的时间）；表格中Q1：
母离子分子量，Q3（Da）：
子离子分子量，Time（msec）：
50，ID栏：
化合物名称（离子对名称后空格加1为定量，空格加2为定性），在表格中右键分别单击DP、CE，点击工具栏的OPEN打开之前优化的方法参数，调出DP,CE值，选中整行，Ctrl+c（复制）参数，关闭窗口，再Ctrl+v（粘贴）参数）；最后点击Editparameter设置离子源参数：
Source/Gas项用以下推荐值：
CUR35，IS:
5500（正离子）或-4500（负离子），TEM600，GS160，GS270，点击OK。
4、设置液相参数：
点击模板左边的shimadzuLCsystem，①在右边的pumps栏下，设置stoptime（运行时间）为15min，flow流速为1mL/min，A为水相设为95%，B为有机相设为5%（设置时改B，A自动），泵最大压力为50；点击timeprogram设置液相梯度：
例咪唑类梯度设置：
Time（min）
A
B
---
95%
5%
5
5%
95%
10
5%
95%
10.1
95%
5%
15
95%
5%
②接着在右边的Autosampler栏下，设置清洗时间，在Rinsemode下选择Beforeandafter（前后都洗），并设置清洗时间为5s，清洗液用50%甲醇水。
最后点击保存按钮,在保存窗口输入该方法的名称。
（五）数据处理
双击打开Multiquilt，选择项目，点击File下的荧光棒型图标，点击sample，选择需要的标准品和样品数据，点击next，createnewmethod，为方法命名，点击next，选择一个有代表性的样品（一般选择浓度较大的标品数据），设置分组（同一物质定量离子和定性离子设置为一组），并指定内标，next，对每个物质进行积分。
设置积分参数：
CausianSmoth（平滑）：
一般是0，如有毛刺可改成1或2；
ExpecetedTime（保留时间）:
一般不动
Expectedtime范围：
一般30s，表示在保留时间±15s范围
最小峰宽
最小峰高
背景噪音扣除：
可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。
分峰因子：
峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为2，峰分叉不能大于2
单位：
设置单位，勾选Applyunitstoall可将此单位用于所有化合物
点击next，点击finish。
在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度。
查看各化合物积分是否正常，点击第三个图标查看标准曲线。
实验二利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量
1 实验目的：
1.1 让学生了解利用液相色谱质谱联用仪测定食品、农产品中农药残留等有害化合物的分析流程。
1.2 利用前2节课所学内容实际处理样品，增强学生实践能力。
1.3 进一步加强液相色谱质谱联用仪的操作和数据处理。
2 试剂或材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的二级水。
2.1 乙腈（C2H3N）：
色谱纯。
2.2 氯化钠（NaCl）：
140℃干燥4h。
2.3 氨基固相萃取小柱：
500mg/6mL（或性能相当的其它固相萃取柱）。
2.4 二氯甲烷-甲醇混合液:
二氯甲烷+甲醇（体积比）=95+5。
2.5 标准品：
见表1。
2.6 农药标准溶液配制
2.6.1 标准储备溶液
分别准确称取一定量（精确至0.1mg）农药标准品，用甲醇溶解，逐一配成1000mg/L的单一农药标准储备液，密封贮存在-18℃冰箱中，使用期为6个月。
表1 9种农药标准品
农药名称
纯度（%）
多菌灵
≥98
吡虫啉
≥98
啶虫脒
≥98
辛硫磷
≥98
阿维菌素
≥98
克百威
≥98
嘧霉胺
≥98
2.6.2 混合农药标准溶液
分别准确吸取一定体积的9种农药标准储备溶液（4.8.1）注入同一容量瓶中，用甲醇稀释至刻度配制成100mg/L的混合标准储备液，-18℃冰箱中密封闭光保存，使用期为3个月。
2.6.3 混合标准工作液
吸取一定体积的混合农药标准储备液，用甲醇配制成0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L的7种农药混合标准工作液，贮于4℃以下冰箱中，需现用现配。
3 仪器设备
3.1 电子天平：
感量0.01g；
3.2 破壁食物料理机：
不低于20000r/min；
3.3 均质机：
不低于20000r/min；
3.4 恒温水浴锅；
3.5 旋转蒸发仪；
3.6 氮吹仪。
4 试验步骤
4.1 样品制备
4.1.1 鲜人参
取不少于500g水果于破壁食物料理机中，以不低于20000r/min的转速将样品制成糊浆状，充分混匀后装入样品密封盒中直接测定或-18℃保存，备用。
4.2 样品预处理
4.2.1 提取
称取25g水果样品（水果品种当季待定），精确至0.01g，于100mL具塞离心管中，加入50mL乙腈，于匀质机中高速匀质1min，过滤至装有7g氯化钠的比色管中，振荡200下，静止分层，吸取10mL上层有机相于50mL浓缩管中，60℃水浴中氮气吹至近干，用2mL二氯甲烷－甲醇混合液溶解残渣，待净化。
4.2.2 净化
氨基柱用5mL二氯甲烷－甲醇混合液溶解进行预处理，当溶剂液面达上层筛板表面时，再倒入上述浓缩管中待净化溶液，用浓缩瓶接收，待液面下降至上层筛板表面，用8mL二氯甲烷－甲醇混合液溶解分2次冲洗浓缩管并洗脱小柱，将浓缩瓶中洗脱液于40℃水浴中旋转浓缩至尽干，氮气吹干后用2.5mL甲醇和2.5mL水定容，过0.22µm滤膜待测。
4.3 仪器参考条件
4.3.1 液相色谱串联质谱联用仪:
Qtrap4500三重四级杆/离子阱质谱仪（配岛津30A超高效液相色谱仪），电喷雾离子源,美国ABSCIEX公司。
4.3.2 色谱柱：
KinetexXB-C18，2.1mm×150mm×2.6μm
4.3.3 流动相及流速见表1
4.3.4 色谱柱箱温度：
40℃
4.3.5 进样体积：
5.0μL
表1流动相梯度及流速
步骤
总时间/min
流速/（μl/min）
0.1%甲酸铵水溶液/（%）
甲醇/（%）
1
0.0
400
90
10
2
6
400
20
80
3
6.1
400
5
95
4
8
400
5
95
5
9
400
90
10
6
11
400
90
10
4.4 质谱条件：
4.4.1 扫描方式：
正离子扫描，多反应监测MRM；
4.4.2 离子源温度（TEM）：
550℃
4.4.3 电离方式：
电喷雾ESI；
4.4.4 电喷雾电压：
5500V；
4.4.5 雾化气压力：
60PSI；
4.4.6 气帘气压力：
30PSI；
4.4.7 辅助加热气压力：
70PSI；
4.4.8 标准曲线的绘制
分别吸取1.0µL0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L混合标准工作液按照仪器参考条件，由低浓度到高浓度依次进行测定。
分别以9种农药的质量浓度（mg/L）为横坐标，以9种农药的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
4.5 定性分析
根据样液中被测物含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和待测农药的响应值均在仪器检测的线性范围内。
标准工作溶液与样液等体积参差进样测定。
4.6 定量计算
试料中7种农药的残留量以质量分数ω计,数值以毫克每千克（mg/kg）表示,结果保留3位有效数字，按公式
（1）计算：
…………………………………………………
（1）
式中:
ρ—标准曲线校正后所测定该种农药的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V1—提取液中有机溶剂总体积，单位为毫升（mL）；
V2—吸取出用于检测的提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；
V3—样品溶液定容体积,单位为毫升（mL）；
m—称取试料的质量，单位为克（g）。
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