学年高中生物第章现代生物技术聚合酶链式反应技术同步备课教学案.docx

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学年高中生物第章现代生物技术聚合酶链式反应技术同步备课教学案

专题课件

第15课时　聚合酶链式反应技术

[学习导航]　1.阅读教材P77～78内容，掌握PCR技术原理。

2.结合教材P79～80内容，了解PCR技术的基本操作过程，讨论PCR技术的影响因素。

[重难点击]　1.简述PCR的原理。

2.了解PCR技术的基本操作过程并讨论PCR技术的影响因素。

一、PCR的原理

聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的，请结合已学习的DNA分子结构和复制的相关知识，分析PCR的原理。

1.DNA的平面结构示意图

（1）写出各个标号的名称①胞嘧啶；②腺嘌呤；③鸟嘌呤核糖；④胸腺嘧啶；⑤脱氧核糖；⑥磷酸基团；⑦胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；⑧氢键；⑨碱基对；⑩一条脱氧核糖核苷酸链。

（2）DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA链的方向，通常将羟基末端称为3′端；将磷酸基团的末端称为5′端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。

答案　左链上5′端，下3′端；右链上3′端，下5′端。

2.细胞内DNA复制条件分析

条件

组分

作用

模板

DNA的两条单链

提供复制的模板

原料

四种脱氧核糖核苷酸

合成DNA子链的原料

酶

解旋酶

打开DNA双螺旋

DNA聚合酶

催化合成DNA子链

能量

ATP

为解螺旋和合成子链供能

引物

RNA

为DNA聚合酶提供合成的3′端起点

3.PCR原理与反应过程

（1）PCR概念：

是一种体外酶促合成特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。

（2）条件及作用

条件

作用

待扩增的目的DNA片段

作为复制的模板

两种人工合成的单链DNA片段

合成DNA时所需要的特异引物

四种三磷酸脱氧核苷酸

原料

耐热TaqDNA聚合酶

酶促作用

缓冲溶液

反应介质

（3）反应过程

①变性

温度上升到94～98℃时，目的DNA双链变性解旋为单链模板。

②复性

温度下降到40～60℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

③延伸

温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核糖核苷酸在耐热的TaqDNA聚合酶的作用下。

根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

④循环：

继续上述的3个过程，DNA片段被不断的扩增。

若开始加入了N个DNA模板片段，理论上，循环n次后能获得N·2n个DNA片段。

1.PCR原理

PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？

请分析原因。

答案　不相同。

体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工合成的单链DNA片段。

2.PCR反应过程

（1）PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？

若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？

答案　PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。

由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高温。

（2）PCR的每次循环中应如何控制温度？

请分析原因。

答案　每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于TaqDNA聚合酶发挥作用。

（3）结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？

答案　DNA的羟基（—OH）末端为3′端，磷酸基团的末端为5′端。

当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

归纳总结　PCR扩增与DNA复制的异同

项目

DNA复制

PCR扩增

不同点

时期

有丝分裂间期或减数分裂Ⅰ前的间期

任何时期

场所

活细胞内

细胞外

酶

解旋酶、DNA聚合酶

耐高温的TaqDNA聚合酶

引物

有转录，产生RNA作引物，无需人工加入

无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物

特点

边解旋边复制

先全部解旋后开始复制

缓冲液

不需缓冲液

配制缓冲液代替细胞核液

设备

无

控制温度变化的温控设备

相同点

原理

严格遵循碱基互补配对原则

引物

都需要分别与两条模板链相结合的两种引物

模板

DNA的两条链为模板

特点

半保留复制

原料

游离的四种脱氧核苷酸

1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是（　　）

A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链

B.DNA复制不需要引物

C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

D.PCR扩增的对象是氨基酸序列

答案　C

解析　DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物；DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，而不能从5′端延伸DNA链；引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合；PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。

2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：

（1）体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是_________。

（2）此过程需要一种TaqDNA聚合酶，该酶是从____________________中分离的。

（3）与普通DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶具有的特性是______________。

（4）与体内DNA复制相比较，PCR反应要在______________中才能进行，并且要严格控制________条件。

（5）PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是____________________________。

答案　

（1）DNA的热变性原理　

（2）水生耐热细菌Taq　（3）耐高温　（4）一定的缓冲溶液　温度　（5）2　作为DNA复制的起点

解析　

（1）PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。

（2）TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。

（3）与普通DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶在90℃以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。

（4）PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。

（5）PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。

PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。

一题多变

细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？

若需要，是如何实现的？

答案　需要。

细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。

易错提醒

　与PCR原理有关的三个易错点

（1）酶的作用位点：

解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。

不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。

（2）DNA聚合酶和DNA连接酶：

DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

（3）PCR中的解旋过程：

PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。

二、DNA片段的PCR扩增和产物检测

DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。

阅读教材，完善下列内容：

1.DNA片段的PCR扩增

准备：

按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上

↓

移液：

用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分

↓

混合：

盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁

↓

离心：

将微量离心管放在离心机上，离心约10s，目的是使反应液集中在离心管底部

↓

反应：

将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应

（1）加入离心管中的物质应包括：

模板DNA、TaqDNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核苷酸、2种引物、缓冲液。

（2）离心管中要加入少量石蜡油，目的是防止反应溶液的挥发。

（3）热循环仪的反应程序应设定为：

（4）影响因素：

在PCR实验中，需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中温延伸的时间越长；引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择，如果引物越短，A、T含量越多，复性温度就越低，反之引物越长，G、C含量越多，复性温度就越高，这是因为G、C之间是由3个氢键连接，A、T之间是由2个氢键连接。

（5）PCR过程中，循环次数是不是越多越好？

答案　不是。

TaqDNA聚合酶在PCR扩增过程中存在1×10－5的出错几率，而且随着循环次数的增加，其活性也会逐渐降低。

因此，PCR过程中，循环次数并非越多越好，一般控制在25～35个循环。

2.扩增产物的检测

（1）原理：

琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔，带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。

DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小，因此大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。

（2）过程

配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，制作成电泳胶板

　　　　　↓

在DNA样品中加入0.2倍体积的载样缓冲液混匀

　　　　　↓

取20μL加入样品孔内

　　　　　↓

80V稳压电泳20～40min

　　　　　↓

当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部时，切断电源

　　　　　↓

将胶板浸入溴化乙锭溶液染色5～10min

　　　　　↓

在紫外透射仪上观察电泳条带

1.实验过程分析

（1）离心的目的是什么？

在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？

答案　离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。

微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。

（2）在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？

答案　离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。

（3）PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？

还有哪些操作与此目的相同？

答案　为避免外源DNA等的污染。

在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

2.结果检测

（1）实验中为什么要测定DNA的含量？

答案　实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。

（2）如何判断DNA扩增成功？

答案　①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。

②电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

（3）PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？

答案　样品产物少，或产生新的DNA。

归纳总结　PCR扩增DNA片段的操作要点

（1）避免外源DNA的干扰，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌。

（2）缓冲液、酶、DNA引物和DNA模板等如果长期保存，需要在－20℃冰箱内保存。

其中，DNA引物和DNA模板要避免反复冻融，否则容易造成DNA的降解。

（3）在用微量移液管混合PCR反应体系的各种成分时，一定注意避免各种溶液之间的相互污染，需遵循每吸取一种溶液就要更换一个枪头的原则。

（4）为防止DNA引物与模板DNA在室温非特异性结合进行PCR反应，需在冰盒上混合PCR扩增体系的各种组分。

（5）为避免反应过程中高温使EP管中的水蒸气溢出管外而导致PCR过程中各种成分的浓度发生变化，须在PCR反应过程中加入无菌的石蜡油防止溶液的挥发。