动植物疫病防制高技术原理与方法.docx

动植物疫病防制高技术原理与方法.docx

《动植物疫病防制高技术原理与方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动植物疫病防制高技术原理与方法.docx（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

动植物疫病防制高技术原理与方法

动（植）物疫病防制高技术原理与方法

免疫胶体金技术的应用及展望

摘要:

免疫胶体金技术是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。

免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物,应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。

近年来,该技术在医学、动植

物检疫、食品安全监督等各领域得到了日益广泛的应用。

从胶体金技术的基本原理、制备方法、标记技术、应用现状及其优点等方面作一简要综述,并对该技术的发展前景作了展望。

关键词:

免疫胶体金技术应用展望

ProspectandApplicationofImmuneColloidalGoldTechnique

Abstract：

Immunecolloidalgoldtechniqueisasolidimmunediagnostictechniquedevelopedinthebaseofthreelabeltechnique（Luciferin,radioactiveisotopeandenzyme）,anditisanewimmunelabeltechniqueappliedtothedetectionofantibodyandantigen.Lately,thetechniqueiswidelyappliedtothescopes,suchasmedical,animalandplantquarantineandthesurveillanceoffoodsafety.Thearticlesummarizedthebasicprinciple,producingmethod,labeltechniqueandadvantageofimmunecolloidalgoldtechniqueanddiscussedtheexistentproblemsandthefuturedevelopmentaltrendofthetechnology.

Keywords:

ImmunecolloidalgoldtechniqueApplicationProspect

免疫胶体金技术（Immunecolloidalgoldtechnique,ICG）是一种常见的标记技术,它是以胶体金为标记物,利用特异性抗原抗体反应,在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术,是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术。

胶体金最早由法拉第发现于1857年,他用还原法从氯金酸水溶液中制备胶体金,并发现在其中加入少量电解质后,可使胶体金由红色变为蓝色,最终凝集成无色,而加入明胶或其他大分子物质便可阻止这种变化,他的重大发现奠定了胶体金制备和应用的科学基础。

1971年Faulk和Taylon[1]首次用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合、制备成金标抗体检测细菌表面抗原的分布。

1974年,Romano等[2]用胶体金标记抗球蛋白抗体,建立间接免疫金染色法。

此后,胶体金作为一种新型免疫标记技术得到很快发展。

1980年,Geoghegan[3]应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原,建立了光镜水平的免疫金技术（immunogoldstaining,IGS）。

Danscher[4]在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜金颗粒可见性的免疫金染色法（immunogoldstaining,IGSS）。

Holgate[5]又对上法加以改进,将免疫金染色与银显影技术相结合,建立免疫金银染色法（immunogoldsilverstaining,IGSS）。

近年来,研究人员根据胶体金的物化性质进一步拓展了基于胶体金标记的生物检测技术及胶体金在其他生物学方面的应用。

目前已广泛应用于被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、流式细胞术、液相免疫测定、斑点金免疫渗滤及免疫层析等,其中在医学检验中的应用主要是免疫层析法（immuno-chromatographicassay,ICA）和快速免疫金渗滤法（Do-timmunogoldfiltrationassay,DIGFA）。

免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,因其快速简便、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点已在人医的临床检验和其它领域取得广泛的应用,如妊娠试验、传染病病原抗体的检测、蛋白质的检测和药物测定等,该技术在兽医临床上的应用也益广泛。

1.胶体金技术的基本原理

氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液,由于静电作用而成为稳定的胶体体系,故称胶体金。

胶体金颗粒散在,直径从几纳米到几十纳米不等,由于不同直径的胶体金的光散射各异,所以其溶胶颜色的深浅相应发生显著的变化,这就是胶体金用于被动凝集试验的基础。

胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程,吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。

用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒,这种球形的粒子对蛋白质有很强

的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多种物质非共价结合,从而使其成为免疫反应的优良标记物。

免疫胶体金颗粒具有高电子高密度的特性,在显微镜下金标蛋白结合处,可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而可用于定性或半定量的快速免疫检测,而且金颗粒还可催化银离子还原成金属银,因此在胶

体金免疫测定时加入银染色液,能放大反应信号,大大增加测定的灵敏度。

2.免疫胶体金的制备

2.1胶体金的制备

胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。

其原理是利用还原剂将氯金酸溶液中的金离子还原成金原子，根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备5—150nm不等的胶体金，一般还原剂用量越大制备的胶体金颗粒越小。

最常用的制备方法为柠檬酸钠还原法。

操作过程如下：

取100ml0.01%的氯金酸（HAuCl）水溶液用水浴磁力搅拌锅加热至沸腾，在磁力搅拌器以一定转速不断搅拌下迅速加入所需的1%柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热约15min至溶液颜色稳定不变。

胶体金准备过程要求所用玻璃容器必须绝对清洁，玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，产生凝集颗粒，因此玻璃器皿用前要经过泡酸、超声洗涤处理，并用蒸馏水、超纯水依次冲洗浸泡，然后烘干备用。

2.2胶体金的标记

由于胶体金颗粒在电解质中不稳定，制备后应立即用大分子（如蛋白质）进行标记。

胶体金颗粒对蛋白质的吸附作用取决于pH值。

在pH值=pI值时，蛋白质溶解度最小，最容易吸附到疏水的金颗粒表面，但在实际操作中，一般胶体金溶液的pH值调到稍高于标记用蛋白质的pI值，这样蛋白质带正电，结合更稳定，可用0.1mol∕L

或是0.1mol∕LHCl调节胶体金溶液的pH至选定的值，但是通常最适反应pH往往需经过多次试验才能确定，在调节pH值时，胶体金会阻塞pH计的电极，因此可用普通pH试纸先调节到目标pH值附近再换用精密pH试纸调节[6]，也可以用胶体金专业pH计调节pH。

标记应在磁力搅拌下，逐滴加入待标记蛋白质溶液，混匀30min后继续在磁力搅拌下加入10%BSA,使其终浓度为0.5%,搅拌混匀15min再加入5%PEG20000至终浓度为0.1%，再持续搅拌混匀15min最后4℃静置过夜。

由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子浓度的双蒸馏水透析去盐，并通过离心及微孔滤膜过滤以除去细小颗粒，然后通过系列稀释法找出能使胶体金稳定的待标记蛋白质的最低浓，这一浓度再加10%即为最佳标记蛋白质量。

标记好的胶体金还应加入终浓度为0.05%-0.1%的PEG6000或PEG20000作为稳定剂[7]。

多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂,PEG和BSA是最常用的稳定剂。

稳定剂有两大作用,一为保护胶体金的稳定性,使之便于长期保存;二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。

稳定剂的合理选择十分重要,不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。

2.3胶体金标记后的纯化

标记好的胶体金中往往还含有未结合的蛋白质、未充分标记的胶体金以及标记过程终形成的各种聚合物。

因此标记好的胶体金还需经过纯化才能使用,一般纯化方法有离心法和凝胶过滤法等。

采用离心法时,一般颗粒10nm以上的胶体金可高速离心,颗粒小于10nm的胶体金要用超速离心,在4℃离心15min至1h不等,弃上清,沉淀用原体积的0.02mol/LTBSpH8.2（含1%BSA,0.05%叠氮钠）溶解,重复离心2-3次,沉淀溶于原体积的1/10PBS溶液中,4℃保存备用。

凝胶过滤法为纯化免疫胶体金的最好方法,过滤的胶体金颗粒比较均匀,不容易凝集,而离心法转速高,时间长,胶体金颗粒沉淀后容易凝集,用凝胶过滤法克服了这一弱点。

将浓缩好的免疫胶体金先以1500r/min离心除去大的聚合物,取上清液过柱。

可用Sephacryls-400或Sepharose-4B（或6B）装柱,0.02mol/LTBSpH8.2平衡和洗脱[6]。

３　免疫胶体金技术

3.１　免疫渗滤试验（ＤＩＦＡ）技术［8］

其基本原理是以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛细管虹吸作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物（或其

他）指示剂之反应形成红色的可见结果。

3.２　免疫层析［9］（ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）试验技术

其原理是将特异的抗体或抗原先固定于硝酸纤维素（ＮＣ）膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品尿液或血清后，由于毛细作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体或抗原的区域时，样品中相应的抗原或抗体即与该抗体或抗原发生特异性结合，再通过标记技术使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

胶体金免疫层析（ＧＩＣＡ）就是利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术诊断特异性的待测物。

同样是层析法的金标纸条，根据胶体金标记的东西不同可以分成间接法、竞争法和双抗原夹心法等不同种类。

４免疫胶体金的应用

４．1免疫胶体金标记技术在植物方面的研究应用

4.１．１　植物病害超微病理的研究［10］

利用免疫电镜技术研究植物病害的超微病理，其原理是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨率相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析。

特异性抗体用铁蛋白、胶体金或过氧化物酶标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物的所在位置，即为抗原抗体的反应部位。

２００２年，李红叶［11］等利用免疫胶体金标记技术检测寄主体内的葡萄扇叶病毒（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ　ｆａｎｌｅａｆ　ｖｉｒｕｓ　ＧＦＬＶ）移动蛋白，进一步证实了ＧＦＬＶ是通过管状结构实现细胞问移动的。

彭日荷［12］等同样利用此技术研究了甜菜多粘菌传带甜菜坏死黄脉病毒的部位。

4.１.２　植物病害的快速检测

利用胶体金免疫层析法和斑点渗滤法可准确、灵敏、快速地检测植物病害，并具有操作简便的特点，克服了传统鉴定