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甜瓜基因研究进展

吉林农业科技学院

选修课论文

生物技术专题

论文题目:

甜瓜基因工程研究进展

学生姓名:

赵愉快

专业年级:

08经管国际经济与贸易一班

指导教师:

李鹏

2009年6月11日

目录

题目……………………………………………………………………………………………Ⅰ

摘要及关键词…………………………………………………………………………………Ⅱ

1□前言…………………………………………………………………………………………3

2□甜瓜组织培养研究进展……………………………………………………………………4

2.1□外植体基因型……………………………………………………………………………4

2.2□外植体部位及苗龄………………………………………………………………………4

2.3□培养基……………………………………………………………………………………5

2.4□激素………………………………………………………………………………………5

2.5□其他因素…………………………………………………………………………………6

3□甜瓜遗传转化研究进展……………………………………………………………………6

3.1□甜瓜转基因技术…………………………………………………………………………6

3.2□甜瓜转基因研究…………………………………………………………………………7

3.2.1□抗病基因的转入………………………………………………………………………7

3.2.2□抗虫基因的转入………………………………………………………………………8

3.2.3□耐贮藏基因的转入……………………………………………………………………8

3.2.4□抗逆性基因的转入……………………………………………………………………9

4□结论…………………………………………………………………………………………9

4.1□……………………………………………………………………………………………9

4.1.1□…………………………………………………………………………………………9

4.2□……………………………………………………………………………………………9

参考文献………………………………………………………………………………………9

致谢……………………………………………………………………………………………10

附录……………………………………………………………………………………………10

甜瓜基因研究进展

学生:

赵愉快

专业:

国贸一班

学号：

0804602132

指导老师：

李鹏

摘要：

概述了甜瓜组织培养的研究现状以及甜瓜遗传转化的研究进展。

同时展望了甜瓜遗传转化的前景。

关键词：

甜瓜组织培养遗传转化

Progressingeneticresearchmelon

Name:

chenhuayu

Major:

InternationalEconomicsandTrade

No.Studies:

0804602204

Abstract：

Melontissuecultureprovidesanoverviewofresearchandstudyofgenetictransformationofmelonprogress.Lookingatthesametimetheprospectsforgenetictransformationofmelon

Keywords:

MelonTissueCultureGeneticTransformation

1前言：

甜瓜（CucumismeloL.）是世界上的重要水果，其栽培面积和总产量均在世界十大水果之列。

甜瓜也是我国广大城乡人民普遍喜欢吃的夏季鲜食水果。

除青藏高原由于海拔高、气温低、有效积温不足而不能露地种植外，全国各地均可露地种植。

全球通过传统的育种方法选育了不少优良甜瓜品种，如美国的抗白粉病甜瓜品种西域1号等。

但是，由于传统育种需要时间长、工作量大、不能超越种间和基因水平的不相容性，从而未能获得理想的甜瓜品种。

随着植物分子生物学的不断发展和深入，人们将会有目的地培育出一大批高产、稳产、抗病和优质等特性集于一身的甜瓜的基因工程新品种。

不久的将来，转基因技术必然成为甜瓜育种的重要手段。

甜瓜作为葫芦科植物中的一种重要的园艺作物，是全世界普遍栽培的重要水果，具有较高的商品价值和经济价值。

随着植物细胞工程和基因工程技术的迅速发展，应用组织培养、基因转化等技术手段进行甜瓜品质改良、提高抗逆性、创造新种质，已成为甜瓜育种快速有效的新方法。

甜瓜基因工程是利用分子克隆技术，分离、提取或人工合成具有抗病、抗虫、提高品质等某一特性的基因片段，并利用根癌农杆菌介导或基因枪等技术转入甜瓜植株，可获得前所未有的甜瓜新种质，这是进行甜瓜遗传育种、品种改良，拓宽种质资源范围的一条有效途径。

目前，转基因甜瓜研究主要集中在抗病、抗虫与提高果实品质和控制果实成热等方面，现就上述研究做一综述。

2甜瓜组织培养研究进展

随着基因工程技术在农作物育种中的研究与应用，甜瓜组织培养技术的开展为分子育种奠定了良好的基础。

建立高效的甜瓜再生体系是甜瓜基因工程中的关键性基础工作。

甜瓜组织培养工作起步较晚，自唐定台等首次报道了植物激素在甜瓜再生过程起作用之后，有关甜瓜的组织培养的报道相继出现。

Dirks等通过真叶、侯喜林等通过下胚轴、马国斌等通过生长点、尹俊等通过胚、钟俐等通过子叶节、于喜艳等通过子叶等多种外植体方式获得甜瓜再生植株。

甜瓜组织培养过程中受到的影响因素很多，主要如下。

2.1外植体基因型

基因型对甜瓜不定芽发生和植株再生具有决定性作用，选择不同甜瓜品种进行组织培养研究，外植体基因型差异对再生率影响明显，繁殖系数差异较大。

主要表现在不同品种间不定芽的发生和植株再生能力的不同。

于为常等研究证明，S-24和网纹香两甜瓜品种各种外植体中内源IAA含量很高，超过一般植物的数倍，并以胚轴中含量最高而且愈伤组织中的IAA的含量超过各种外植体，这可能是导致不同品种甜瓜外植体不定芽诱导效果不同及愈伤组织不易分化的缘故。

根据资料显示，甜瓜组织培养过程中不定芽发生能力是一种受基因型控制的数量性状，并有可能存在基因间的互补作用。

蔡润等对引进杂交种和农家品种进行的子叶培养结果表明，杂交种的不定芽诱导率高于当地品种。

于喜艳等研究表明，薄皮甜瓜较厚皮甜瓜再生能力强。

由此可见，基因型对甜瓜再生影响很大。

2.2外植体部位及苗龄

在甜瓜外植体诱导不定芽的过程中，除材料基因型的显著影响外，外植体本身是一个重要影响因素，不同基因型品种的幼嫩子叶都可得到较高频率的再生不定芽，而真叶、胚轴、茎尖等部位再生频率很低，甚至不能再生。

邓向东等研究了S-24和网纹香品种不定芽诱导率由高到低的顺序为子叶柄>子叶>茎尖>真叶，而胚轴和胚根不能诱导不定芽。

马国斌等研究认为未成熟子叶是甜瓜离体培养的最佳外植体，不仅再生能力强，不定芽分化率高，而且对培养基适应性也较强。

幼态的幼苗子叶和真叶也是离体培养的适宜外植体。

Leshem、Compton等均认为同一外植体的不同部位组织的再生能力表现出很大差异，即表现出明显的极性现象，甜瓜子叶的近轴端和远轴端在诱导过程中的表现不同，不定芽的出现总在近轴端切口部位产生。

另外，无菌苗子叶的苗龄也是其能否分化诱导成功的决定因素，苗龄决定着外植体的生理不同状态，对不同甜瓜品种的子叶进行分化诱导时，选择的苗龄不完全一致。

王春霞等报道，培养2日龄无菌苗子叶出芽率最高，当苗龄增加时，芽的分化率迅速降低，任春梅认为苗龄超过10d的子叶几乎不能诱导不定芽分化。

在甜瓜子叶的培养中，一般采用培养4～5日龄无菌苗子叶作为外植体。

2.3培养基

诱导甜瓜不定芽时，各研究者所采用的基本培养基有所不同。

MS被大多数的研究者采用。

唐定台等、赵家英等使用Miller培养基，Niedz等、Adelberg等和Fang等人使用改良后的MS培养基；Fassuliotis等则用MS+B5有机培养基。

2.4激素

生长调节剂种类及其配比是影响植物细胞脱分化和再分化的关键因素之一，植物激素种类及其配合在不同的研究报道中，其组培效应不尽相符，大多数学者认为一定浓度的6-BA是诱导甜瓜外植体分化的关键，Zarka认为附加低浓度的生长素则有利于这种分化的发生。

邓向东等试验证明，6-BA诱导效果最好，其最适浓度为0.5mg/L，低于0.1mg/L和高于1.Omg/L时均不能产生不定芽。

陶兴林等认为在6-BA2.0mg/L、1.Omg/L的分化培养基上培养，不定芽诱导率均为100%，随6-BA浓度提高，外植体玻璃化、褐化程度加重。

大量研究表明，6-BA对甜瓜不定芽的诱导分化具有重要作用，但由于基因型差异的影响，对不同甜瓜品种进行离体诱导分化时，应设置不同的浓度梯度，筛选适宜的浓度范围，与生长素进行配比，提高再生率。

而生长素类物质的需求，一些研究者认为培养基中加入IAA等生长素类激素会促进不定芽的形成，而Niedz、Dong则认为加入IAA、NAA等加重了外植体上的愈伤化程度而不利于不定芽的形成，这可能由于刮瓜本身的内源生长素的含量比较高，而不需要人为添加，如果添加，就会引起愈伤组织的发生，不利于不定芽的诱导，也可能与甜瓜各品种中IAA含量不同有一定的关系。

2.5其他因素

甜瓜离体培养过程影响因素很多，Zamora等认为光照条件下诱导率最高；choi等认为每天16h的光照，对于不定芽的诱导是必须的；Compton则认为幼苗事先进行暗处理可以提高子叶外植体不定芽的诱导率，但对于不同品种效果不同。

另外，外植体大小、种子纯度、切取放置方向、继代时间间隔等均可影响到诱导分化率。

3甜瓜遗传转化研究进展

经过长期育种工作和生产实践，甜瓜育种学家已培育出适合不同地区种植的各具特色的优良品种或类型。

而目前，甜瓜育种的一个主要目标是一方面要求甜瓜品种具有优良的农艺性状，另一方面也要求它同时具有抗多种病虫害和单性结实等特殊性状。

但是，由于种间和属间水平的严格的生殖障碍限制了常规育种手段的应用，近20年来，随着植物转基因技术的迅速发展，为克服天然遗传屏障快速培育甜瓜新品种展示了美好前景。

3.1甜瓜转基因技术

植物遗传转化是植物基因工程的重要环节之一。

经过近20年的研究，目前已建立了10余种基因转化方法，其中农杆菌介导法是研究最清楚、应用最成功的一种。

在已经获得成功的200多种转基因植物中，约有80%是农杆菌介导转化的。

农杆菌转化方法有着明显的优势：

成功率高，效果好；转移的外源基因常为单拷贝整合，很少发生甲基化和转基因沉默，遗传稳定，而且多数符合孟德尔遗传定律；费用低，方法简单，易操作。

农杆菌介导法已应用于甜瓜遗传转化的研究，并建立了甜瓜子叶农杆菌介导法的遗传转化体系。

此外，基因枪转化技术也有许多成功的报道，基因枪法是1987年美国康奈尔大学Sanford等人最先提出的基因遗传转化技术，它的转化原理是借高速运动的金属微粒将附着于表面的核酸分子引入到受体细胞的一种遗传物质导入技术，由于外源基因可被导入到任何微弹能穿透的细胞或组织，因此，凡具备再生能力的细胞或组织都可作为遗传转化的受体。

迄今，除上述两种遗传转化方法外还发展了多种DNA直接转化法，如原生质体电击穿孔法、PEG法和微孔注射法、超声波导入技术、激光导入技术、病毒介导转化法、花粉管通道法、脂质体介导转化法以及低能等离子束法等。

3.2甜瓜转基因研究

1983年世界上第一例转基因烟草问世，揭开了转基因植物的序幕。

利用基因工程进行甜瓜性状改良工作起步较晚，研究开始于20世纪80年代末90年代初。

目从1990年Michigan州立大学的Fang和Grumet首次报道了利用根癌农杆菌成功地将NPTII基因（抗卡那霉素基因）导入甜瓜品种以来，基因工程技术已成为甜瓜遗传改良的一个重要而有效的技术手段，到目前为止，基因导入到甜瓜品种，转基因甜瓜研究主要集中在抗病、抗虫与提高果实品质和控制果实成热等方面。

3.2.1抗病基因的转入

在自然条件下，至少有25种病毒引起甜瓜的病害。

其中，黄瓜花叶病毒（CMV），西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）和西瓜花叶病毒2（WMV2）分布最广泛。

这些病毒的侵染影响檀株发育，导致畸形果，甚至不结果。

传统的育种技术可选育甜瓜抗性植株，但目前可作商业用抗性品种很少。

用栽培措施或喷施杀虫剂或矿物油的方法控制昆虫介体效果甚微。

利用病毒外壳蛋白基因转入植物，获得抗病毒材料，是当前转基因甜瓜研究与利用中，应用较早和技术较为成熟的方法，也被认为是最有应用潜力的途径之一。

在抗病毒方面比较成功的报道主要有：

Yoshioka等首次报道了利用根癌农杆菌将黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因（CMV－CP）成功地转入甜瓜；Fang等将西葫芦花叶病毒（ZYMV）CP基因用农杆菌介导法转入甜瓜后，其转基因植株表现出对ZYMV的抗性；Gonsalves等利用根癌农杆菌和基因枪成功地将黄瓜花叶病毒白叶株系（CMV-WL）的外壳蛋白基因转入甜瓜品种，其转基因植株表现出对CMV-FNY株系病毒的抗性；孙严等用农杆菌介导法将CMV-CP基因导入新疆甜瓜“新红心脆"等5个品种，并获得了转基因植株的果实，对R1代植株进行抗病性鉴定，表明转基因植株对CMV具有较强的抗性；薛宝娣等报道用农杆菌介导法将CMV-CP基因导入美国甜瓜HalesBestJumbo品种中，获得了抗病毒植株；王慧中等利用甜瓜组织培养和农杆菌转化技术相结合将西瓜花叶病毒1号外壳蛋白基因（WMV-1CP）和西瓜花叶病毒2号外壳蛋白基因（WMV-2CP）分别转入甜瓜，获得了转基因甜瓜植株，攻毒试验表明，转基因植株可以推迟发病时间，减轻发病程度，表现出对WMV-CP具有较强的抗性。

3.2.2抗虫基因的转入

目前用于蔬菜抗虫性改良的主要有微生物源的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因（Bt基因）和植物源的昆虫蛋白酶抑制剂（PI）的基因以及植物凝集素基因。

研究表明，多种植物凝集素具有抗虫活性。

GNA能特异性抑制蚜虫一类的吸汁性害虫，对咀嚼式害虫（如鳞翅目和双翅目害虫）有中等毒杀性，对刺吸式口器的吸汁性害虫，如蚜虫、褐飞虱、叶蝉等同翅目害虫以及线虫有明显抗虫性。

钟俐获得的GNA再生转化甜瓜植株表现出一定的抗蚜特性。

姜瑛获得的ACA基因转化甜瓜植株中，对蚜虫密度有明显的抑制作用。

3.2.3耐贮藏基因的转入

甜瓜果实不耐贮运，货架期相对较短，使得其商品性和贮运性大大降低。

增加耐贮性、延长货架期是目前植物基因工程的热点研究领域。

研究表明，果实成熟与乙烯密切相关。

ACC氧化酶（ACO）、ACC合成酶（ACS）和ACC脱氨酶是调控乙烯生物合成的3个主要位点，抑制ACO、ACS的活性或促进.ACC脱氨酶的活性可以有效抑制乙烯的生物合成，从而达到果实延熟和耐贮藏的目的。

Ayub等首次将反义ACC氧化酶基因转入Charentais甜瓜，果实采前和采后乙烯产生仅为对照的1%、证实乙烯的产生被阻断，延长了货架期和改善了品质；李天然等将番茄ACC合成酶基因转入河套蜜瓜，获得转化的植株经分子杂交证明，目的基因已整合入河套蜜瓜基因组中；张智俊等利用农杆菌介导法将ACC脱氨酶基因转入哈蜜瓜和白兰都获得了转基因植株，经过检测证明，ACC脱氨酶基因已经整合入哈蜜瓜和白兰瓜的基因组中；Nunez-Pale-nius等在“Galia”甜瓜中转入了反义ACC氧化酶基因后，果肉中ACC氧化酶活性和果肉乙烯合成量显著降低，其中ACC氧化酶活性降低了187倍，乙烯含量较对照降低了99%；内蒙古大学的哈斯阿古拉应用花粉管通道法转基因技术，分别将ACC合成酶反义基因和.ACC氧化酶反义基因导入河套蜜瓜，经过多年多代选育，获得转基因耐贮藏河套蜜瓜高代新品系，该品系的果实在常温下可贮藏60d以上，为普通品种的6倍以上，果实发育期比普通品种显著延长。

3.2.4抗逆性基因的转入

在甜瓜生长发育过程中可能遇到各种类型的逆境，如高盐、干旱、涝渍、高温、冷害和冻害等等，对其产量和品种的影响很大。

因此提高对逆境的抵抗能力具有非常重要的意义。

西班牙的Bordas等将从酵母菌中获得的HAL1耐盐基因转入到甜瓜品种中，并获得了转化植株，转化植株较对照表现出一定的耐盐性。

综上所述，随着甜瓜转基因研究的发展，创造了许多基因型，显示了基因工程在蔬菜品种改良应用的广阔前景。

4结论

甜瓜具有较高的经济价值，利用基因工程方法改良甜瓜品质是甜瓜育种的新生长点。

随着甜瓜遗传转化体系的建立和完善，甜瓜有益农艺性状基因的不断发现和克隆，在抗病育种、种质创新与抗病品种选育上，利用常规育种为主结合分子育种为辅，采用外源DNA直接导入技术可打破远缘物种间的遗传隔离，将抗病基因转育到甜瓜上来。

随着研究者的不懈探索努力和分子生物学的发展，植物基因工程技术必将为甜瓜遗传育种开辟一条崭新的途径，取得更好的成果，这也符合人类日益认识到其迫切性与重要性的环保的要求。

4.1综上所述，甜瓜转基因研究已取得一定进展，但转入的多为单性状基因，对于复合性基因片段的转入研究尚少。

目前的研究多停留在实验室获得转化植株阶段，距离实际种质资源和育种应用还有一定距离。

我国学者已经着手进行了相关研究，并在基因片段克隆、转化载体构建、遗传转化、转基因植株获得与检测等方面已取得一定进展，为甜瓜转基因深入研究打下基础，随着转基因工程技术的日渐成熟和人们对转基因食品认识的逐渐深入，转基因甜瓜将在甜瓜资源创新与品种改良上显示出较大的潜力。

参考文献

［1］姜瑛.苋菜凝集素基因（ACA）转入甜瓜及其在转基因植物中的表达[D]东北农业大学,2001

［2］钟俐.根癌农杆菌介导的雪花莲凝集素基因转入新疆甜瓜的研究[D]新疆农业大学,2001

［3］哈斯阿古拉.甜瓜耐贮藏基因工程研究[D]内蒙古大学,2004

［4］陶兴林,黄永红,陆璐,赵长增.2个甜瓜品种高效再生体系的建立[J]西北植物学报,2005,（04）

［5］于喜艳,何启伟,孔庆国.甜瓜子叶组织培养的研究[J]山东农业科学,2002,（02）

［6］马国斌,王鸣,郑学勤.西瓜和甜瓜组织培养中外植体的极性现象和敏感部位[J]果树学报,1999,（03）

［7］侯喜林.网纹甜瓜生长点、子叶、下胚轴、离体培养初试[J]江苏农业科学,1989,（07）

［8］张智俊,罗淑萍,廖康.抗生素对甜瓜植株再生的影响[J]中国西瓜甜瓜,2002,（01）

［9］Dirks,R.VanBuggenum,M.InvitroplantregenerationfromleafandcotyledonexplantsofCucumismeloL.plantCell.REP,1989,7,7:

626-627.

［10］LeshemB.Polarityandresponsiveregionsforregenerationinculturedmeloncotyledon.JournalofPlantPhysiology,1989,1352,135

（2）:

237-239

致谢

这次论文能够得以顺利完成，是所有曾经指导过我的老师，帮助过我的同学，一直支持着我的家人对我的教诲、帮助和鼓励的结果。

我要在这里对他们表示深深的谢意。

 首先要特别感谢我的指导老师——李鹏老师。

李老师在我毕业论文的撰写过程中，给我提供了极大的帮助和指导。

从开始选题到中期修正再到最终定稿，李老师给我提供了许多宝贵的见议。

 其还要感谢专业任课的老师的教导。