营养盐对细菌降解石油烃的影响.docx
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营养盐对细菌降解石油烃的影响
营养盐对细菌降解石油烃的影响
摘要：
通过向培养体系中添加不同浓度的石油烃和营养盐对细菌进行周期培养，分别测定了石油烃的浓度和细菌的密度，考察了营养盐对细菌降解石油烃的作用。
Abstract:
Petroleumhydrocarbonandnutrientsareaddedintothecultivation,bacteriaiscultivatedregularly,theconcentrationofPetroleumhydrocarbonandthedensityofbacteriaaremeasured.Theeffectsofnutrientsonthedegradationofpetroleumhydrocarbonbybacteriaareanalyzed.
海洋烃细菌大量存在于海洋环境中，能降解石油烃及其衍生物，净化海水。
细菌对石油污染物的降解作用受很多因素的影响：
细菌的种类和活性、细菌的数量、pH值、营养物质的供给情况、氧的供给情况等等。
其中营养物质是细菌进行新陈代谢和一切生命活动赖以正常进行的物质基础。
很多研究表明，作为生物修复的措施，添加营养盐能促进海水中细菌的生长繁殖，提高溢油的生物降解速率。
[1]~[3]但由于海洋环境的复杂多变，潮汐、波浪等因素影响该措施的效果。
[4]
细菌细胞的化学组成和营养类型决定了细胞的营养需求。
细菌细胞的化学组成主要是碳、氢、氧、氮和各种矿质元素。
石油污染物提供的主要是碳、氢元素，海洋中氮、磷的缺乏最可能成为细菌降解石油的限制因素。
为了研究细菌降解石油烃所需的营养条件，我们进行了营养盐对细菌降解石油烃影响的研究。
1实验方法
1.1细菌的培养实验
每个培养瓶中分别添加2L灭菌海水（经0.45μm醋酸纤维滤膜过滤后，120度高压灭菌），向其中按5‰的比例接种（经GF/F滤膜过滤后的海水），然后分别添加不同浓度的石油烃以及不同浓度的营养盐，暗处室温培养，每隔一天（即第0，2，4，6，8天）取一次样，共取五次。
石油烃和营养盐的具体添加浓度详见下表所示：
表1培养液中石油烃、NaNO3、KH2PO4浓度的设定
试验号
石油烃
（mg/L）
NaNO3
（μmol/L）
KH2PO4
（μmol/L）
1#
2#
3#
4#
0.1
0.1
0.1
0.1
0
0
18
36
3
6
0
0
5#
0.1
18
3
6#
0.1
36
6
7#
0.1
18
6
8#
0.1
36
3
9#
0.5
0
3
10#
0.5
0
6
11#
0.5
18
0
12#
0.5
36
0
13#
0.5
18
3
14#
0.5
36
6
15#
0.5
18
6
16#
0.5
36
3
17#
0.1
0
0
18#
0.5
0
0
19#
0
0
0
20#
0
0
3
21#
0
0
6
22#
0
18
0
23#
0
36
0
24#
0
18
3
25#
0
36
3
26#
0
18
6
27#
0
36
6
[注]：
0代表不添加N，P，本底海水中N=4.96,P=0.046μmol/L；其它均为添加后溶液中的N，P浓度
1.2测定方法
细菌的测定方法如下：
定时取样，染色后在荧光显微镜下给细菌计数。
具体方法是：
8ml水样+40%的甲醛约1.2ml（相当于5%的甲醛），记为样1，冰箱冷藏；移取5ml样1至塑料瓶中+0.25mlDAPI（染色剂），摇匀，暗处保存；30min后取出，记为样2；铝箔包住滤器上方（放滤膜处，避光），放上25mm的0.2μm的WhatmanNucleporeTrack-EtchMembrane（上下各放一张），milli-Q水冲刷一下，将5ml样2经此滤膜过滤（手动施压，限制在2个格以内），milli-Q水再次冲刷一遍，待抽干为止；取下上层滤膜放在载玻片上（事先滴1d香柏油在上面），再滴1d香柏油，盖上盖玻片，铝箔包好，冰箱内冷冻（注意：
整个过程要迅速，尽量避光）；荧光显微镜下拍下细菌的照片；然后根据公式：
个数*3.14/0.00034639765（个/ml）计算出细菌的总数。
石油烃的测定方法如下：
定时取样（48h间隔），立即用环己烷萃取，萃取液用荧光分光光度计（二维）进行测定。
首先先要判断环己烷的质量是否符合测定要求：
在激发和发射波长分别为Ex=310nm,Em=365nm的条件下，测定环己烷的荧光强度，经测定，最大瑞利散射：
6464，环己烷（色谱纯）：
125.9，环己烷（分析纯）：
218.2。
125.9/6464=0.019<2%（符合要求），218.2/6464>2%（不符合要求）。
因此，我们最终选择色谱纯的环己烷作为萃取剂。
绘制标准曲线：
移取2.5ml油标准储备液（1.00g/L）于盛有少量环己烷（色谱纯）的25mL容量瓶中，环己烷稀释至标线，混匀。
此溶液即为油标准使用液（100mg/L）。
分别取0，0.25，0.5，0.75，1，1.25ml油标准使用液于6个10ml小玻璃管中，加环己烷稀释至标线，混匀（C：
0，2.5，5，7.5，10，12.5mg/L）。
从低浓度向高浓度依次移入1cm石英测定池中，环己烷作参比，测定λ＝365nm处的相对荧光强度I0和Ii，绘制标准曲线。
此外，我们还需要做一个条件实验，以此来选取最佳的萃取方法：
用石油烃母液配制三个浓度：
0.05，0.1，0.5mg/L；取250ml水样，经5ml，5ml环己烷萃取（A组），分别取500ml水样，经10ml，10ml环己烷萃取（B组），各双样。
测定比较A，B两组萃取方法。
表2萃取实验条件的选取
A组（250ml,5ml）
B组（500ml,10ml）
C油（mg/L）
0.05
0.1
0.5
0.05
0.1
0.5
1.25
2.5
12.5
1.25
2.5
12.5
Ⅰ实测值
2045.2
3862
18990
2000.2
3762
18880
Ⅰ理论值
2045.22
3863
18992
2045.22
3863
18992
最终，我们通过条件实验，确定使用A组萃取方法。
2结果与讨论
2.1N、P对细菌生长的影响
图1N对细菌生长的影响
图2P对细菌生长的影响
图3N/P对细菌生长的影响
以上三组曲线显示，随着氮或磷浓度的增加，细菌的增长随之加快，即细菌的生长与N、P的浓度成正相关性。
同时我们还可以看出，只添加氮的要比只添加磷的更能促进细菌的增长；氮磷同时添加的对细菌生长的促进作用最大，并且有一个最佳的添加比例，即氮磷比为6：
1时，细菌的生长最好，N/P=3：
1和12：
1时，细菌的生长相差不大。
也就是说，细菌的生长既需要氮源同时也需要磷的参与，而且所需的最佳氮磷比为6：
1，在这种营养环境中生长最快，当氮磷比相对增加或减少时，细菌的增长反而会得到抑制。
2.2N对细菌降解石油烃的影响
图4不添加磷时石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线（石油烃浓度为0.1mg/L）
图5培养液中磷的浓度为3μmol/L时，石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线
（石油烃浓度为0.1mg/L）
图6培养液中磷的浓度为6μmol/L时，石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线
（石油烃浓度为0.1mg/L）
图7不添加磷时石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线（石油烃浓度为0.5mg/L）
图8培养液中磷的浓度为3μmol/L时，石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线
（石油烃浓度为0.5mg/L）
图9培养液中磷的浓度为6μmol/L时，石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线
（石油烃浓度为0.5mg/L）
由以上六组图中的结果，我们可以很明显的看出，当磷和石油烃浓度固定时，随着氮浓度的增加，细菌的增长程度增大，溶液中石油烃浓度的减少趋势明显随之增大。
也就是说，氮的增加能够促进细菌的生长，从而增强了细菌对石油烃的降解程度。
2.3P对细菌降解石油烃的影响
图10不添加氮时石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线
（石油烃浓度为0.1mg/L）
图11培养液中氮的浓度为18μmol/L时，石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线
（石油烃浓度为0.1mg/L）
图12培养液中氮的浓度为36μmol/L时，石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线
（石油烃浓度为0.1mg/L）
图13不添加氮时石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线（石油烃浓度为0.5mg/L）
图14培养液中氮的浓度为18μmol/L时，石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线
（石油烃浓度为0.5mg/L）
图15培养液中氮的浓度为36μmol/L时，石油烃浓度的变化以及细菌的生长曲线
（石油烃浓度为0.5mg/L）
与氮对细菌降解石油烃的影响类似，我们发现当氮和石油烃的浓度固定时，随着磷浓度的增加，细菌的增长程度增大，溶液中石油烃浓度的减少趋势也随之增大。
即磷的增加能够促进细菌的生长，从而增强了细菌对石油烃的降解程度。
除此以外，我们还发现，当氮磷比为6：
1时，细菌对石油烃的降解最好，细菌的生长最快，石油烃的浓度减少最明显，而氮磷比为3：
1和12：
1时，降解程度明显下降。
综上所述，实验结果表明，N、P营养物质的缺乏是影响海洋石油污染物生物降解的一个主要原因。
仅仅接种细菌而不添加N、P营养盐对降解过程几乎不能起到强化作用相比较而言，细菌对N源的供给更敏感，但同时添加N、P营养盐才能取得更好的降解效果。
本次实验显示，氮磷比为6：
1时，细菌生长最好，它对石油烃的降解效果也最好。
3结论
由本次实验我们可以得出如下几个结论：
⑴培养液中石油烃的浓度在培养初期迅速减少，随后基本趋于平台。
表明细菌对它的降解主要在初期比较明显。
⑵氮磷共同存在时，细菌对石油烃的降解程度最大；在缺氮或缺磷时，细菌对石油烃的降解程度减弱。
由此可见，细菌降解石油烃过程需要氮磷源，只有单一的营养源（缺氮或缺磷）均不能很好地满足细菌对石油烃降解的营养需求。
本次实验的结果显示，氮磷比为6：
1时细菌对石油烃的降解效果最好。
⑶溶液中石油烃浓度的减少与细菌密度的增长呈正相关。
表明营养盐对细菌降解石油烃的影响主要是由于氮磷的添加促进了细菌的增长，从而促进了它对石油烃的降解。
参考文献：
[1]SUGAI．S．F,LINDSTROM．J．E，BRADDOCK．J．F，EnvironmentalinfluencesonthemicrobialdegradationofExxonValdezoilontheshorelinesofPrinceWilliamSound，Alaska[J]．EnvironSciTechnol，1997，31：
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[2]OH．Y．S，SIM．D．S，KIM．S．J．Effectofnutrientsoncrude0iIbiodegradationintheUpperIntertidalZone[J]．MarinePoilutionBulletin，2001，42（12）：
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[3]MAKIH，HIRAYAMAN，HIWATARIT．Crudeoilbioremediationfield
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