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分子生物学

分子生物学

第一章遗传的物质基础-DNA（基础章节，都要看）

第一节遗传的物质基础-DNA

1.DNA是遗传物质：

携带负责蛋白质、氨基酸合成的组成信息

携带关于基因选择性表达的信息

2.遗传物质的发现与证明:

（实验理解）

转化：

R型肺炎链球菌因为没有荚膜多糖而失去致病能力

S型细菌加热杀死后，与活的R型菌混合，能够使小鼠感染

转化原理：

OswaldAvery等用去垢剂裂解加热灭活的S型细菌，得到保留了转化能力的溶菌液。

分别向溶菌液中加入SIII（除去荚膜多糖），蛋白酶和RNA酶，转化能力不受影响。

向溶菌液中加入DNA酶，转化能力丧失。

证明DNA是遗传物质。

第二节DNA的一级结构

1．结构单位:

核苷酸

1.碱基:

指嘌啉或嘧啶环。

通过嘧啶的N1或嘌啉的N9位糖苷键与戊糖的1位相连；

每种核酸包含4种碱基。

DNA包括A、G、C、T，而RNA包括A、G、C、U

稀有碱基

2.核苷：

戊糖与碱基以N－糖苷键连接组成核苷。

核苷中碱基与糖环平面互相垂直

戊糖包括核糖与脱氧核糖，均为呋喃型环状结构

糖环中碳原子的标号右上角加撇,碱基中原子的标号不加撇

3.核苷酸：

核苷的戊糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸。

二、DNA的一级结构：

通常指核酸的核苷酸序列；

核酸中的核苷酸以3’，5’-磷酸二酯键连接而成。

三、DNA物理结构的不均一性

1.反向重复序列

2.回文序列：

富含A/T序列

A/T对只有两条H键，此处双链容易解开。

对于复制和转录的起始很重要。

第三节DNA的二级结构（重点掌握）

1.右手双螺旋模型要点:

（掌握）

主链:

两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕，两条链均为右手螺旋；

脱氧核糖与磷酸通过3’，5’－磷酸二酯键交互连接，成为螺旋的骨架

碱基对:

嘌啉与嘧啶位于双螺旋的内侧，碱基平面与纵轴垂直；

碱基互补配对原则

螺距为3.4nm,包含10个核苷酸;直径2nm

大沟和小沟:

蛋白因子的识别和结合部位

二、决定双螺旋结构状态的因素：

（掌握）

H键

碱基堆积力

v疏水作用力

v范德华力

磷酸基团的静电斥力

碱基分子内能

三、DNA的变性、复性和杂交（下面两个概念掌握）

增色效应:

变性DNA在260nm处光吸收的增加。

熔点（Tm）：

是A260值升高达到极大值一半时的温度

四、DNA二级结构的多形性

A-DNA

Z-DNA

B-DNA

螺旋方向

右手

左手

右手

Bp数/匝

11

12

10

螺距

2.8

4.5

3.4

大沟

细、深

平伏

宽和中等深

小沟

宽、浅

很窄、很深

窄和中等深

第四节DNA超螺旋和拓扑异构

正超螺旋和负超螺旋的定义：

（掌握）

L=T+W（理解）

L为连接数（linkingnumber），是指环形DNA分子两条链间交叉的次数。

只要不发生链的断裂，L是个常量。

T为双螺旋的盘绕数（twistingnumber）,即初级螺旋的圈数。

W为超螺旋数（writhingnumber），它们是变量。

所有的DNA超螺旋都由DNA拓扑异构酶

第五节染色体的结构

一、核小体（Nucleosomes）是DNA在真核细胞内的存在形式

⏹一个核小体约缔合200bp的DNA

⏹组蛋白分为5种:

H1,H2a,H2b,H3,H4

⏹（H2a,H2b,H3,H4）×2组成组蛋白八聚体，约146bp的DNA以左手螺旋管的形式缠绕于八聚体上，其余DNA以接头DNA形式存在

⏹H1在核小体的外面，位于DNA进入和离开核小体的位置

⏹组蛋白特点:

带正电荷，富含精氨酸和赖氨酸，是自然界最保守的蛋白质之一。

第二章DNA的复制

第一节DNA复制概貌（掌握）

一、DNA复制的半保留性

二、复制过程中的顺序性

复制从原点开始

边解链边复制

三、DNA的半不连续复制

DNA只能从5′到3′方向合成，不能从两端同时复制

第二节DNA的复制酶和相关蛋白

（重点掌握：

有哪些DNA复制酶和蛋白质参与及其作用）

一、DNA聚合酶

种类：

DNA聚合酶I：

1956年，Kornberg

具有聚合酶、3′-5′外切核酸酶、5′-3′外切核酸酶活性

主要生理功能：

主要的DNA修复酶，并参与半保留复制

DNA聚合酶II：

没有5′-3′外切核酸酶活性，次要的DNA修复酶

DNA聚合酶III：

是真正的DNA复制酶

多亚基

多层次组装

DNA聚合酶IV和V：

参与SOS修复

二．解螺旋酶

使复制叉前面的双螺旋DNA解旋

三．引发酶

合成RNA引物

四、旋转酶（gyrase）：

复制叉前进带来扭曲张力

拓扑异构酶II：

引入负超螺旋

五、DNA连接酶

共价连接切口（3′-5′磷酸二酯键）

六、SSB蛋白（单链结合蛋白）：

与单链DNA结合

防止单链复性

维持单链刚性状态

避免单链降解

第三节DNA的复制过程

一、原核生物的复制（E.coli）（理解）

（一）复制的起始：

1.复制原点：

OriC，含两个系列的重复单位，3个13bp重复序列（富含AT），和4个9bp重复序列（识别位点）

2.起始过程：

TheoriginisinitiallyrecognizedbyDnaAthatformsalargecomplexwithDNA.AshortregionofA·T-richDNAismelted.

DnaBisboundtothecomplexandcreatesthereplicationfork.

Thefirstnucleotidesofthenewchainaresynthesizedintotheprimer

（二）复制的延伸：

1.复制体：

酶和相关蛋白在复制叉形成的超分子复合物

2.先导链和后随链的同时复制

Laggingtemplatestrand通过复制体形成一个环状结构，primase已经合成一条引物＃2

随着冈崎片段的合成，环逐渐变大，直到＃2片段末端接近前一冈崎片段的引物

复制体释放环，primase合成一个新的引物

（三）、复制的终止：

1.环形DNA：

单向复制：

复制终点＝复制起点

双向复制：

无固定终点,两个生长点简单碰撞

有固定终点,如E.Coli

2.线性DNA：

环化，如λDNA

形成连环分子，如T7DNA

二、真核生物的复制

真核生物复制特点：

（掌握）

复制速度慢

基因组较大，有多个复制起点

在全部复制完成以前，起点不开始新一轮复制

3.复制过程中的核小体

复制叉前进是核小体解离为H32·H42四聚体和H2A·H2B二聚体

新合成的组蛋白也被组装成H32·H42四聚体和H2A·H2B二聚体

旧的和新的四聚体、二聚体，在CAF-1因子的帮助下，随机地被组装到复制叉后新形成的核小体中。

4.端粒的复制：

（端粒和端粒酶的定义）

端粒（Telomere）

端粒是真核染色体的末端序列，富含G。

主要由一串十分简单和串联重复的序列组成

如四膜虫：

GGGGTT

端粒功能：

操持染色体的稳定性

端粒酶（Telomerase）：

一种含RNA的蛋白复合物，能使端粒延伸。

酶所含的RNA长约150bp，是合成端粒的模板。

端粒酶实际上是一种逆转录酶。

复制过程：

a）除去子代链5’端引物

b）2.在母链3’末端添加端粒序列

c）3.以新合成的端粒序列为模板合成DNA

d）4.除去步骤3中所使用的引物，缺口被保留，但未丢失DNA

第三章突变和修复

第一节突变概述

一、突变的定义：

可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变，称为突变。

相关概念：

突变体:

携带突变的生物个体、群体或株系

突变基因－野生型基因（没有发生突变的基因）

突变剂:

引起突变的物理化学因素

二、突变的分类（概念掌握）

颠换transversion：

嘌呤被嘧啶替换或嘧啶被嘌呤替换的突变。

转换transition：

嘌呤被另一个嘌呤替换，或嘧啶被另一个嘧啶替换的突变。

同义突变：

点突变没有改变基因产物的氨基酸序列。

错义突变：

点突变有改变基因产物的氨基酸序列。

无义突变：

碱基发生改变，成为终止密码子。

错义突变包括

中性突变：

不影响蛋白活性，不表现明显性状变化

渗透突变：

产物仍有部分活性的错义突变

致死突变：

基因的突变将严重影响蛋白质活性甚至甚至完全无活性，引起生物死亡。

二、转座成分的致突变作用：

Insertionsarethemostcommontypeofmutation（转座致突变是最常见的突变类型）

三、增变基因（mutatorgene）：

（定义掌握）

增变基因的突变引起整个基因组突变率的明显上升。

如编码DNA聚合酶的各个基因，和修复相关酶的基因。

四、紫外线和高能射线的致突变作用（理解）

紫外线可以使胸腺嘧啶联会成二聚体

电离辐射对生物分子损伤与自由基生成密切相关

五、突变热点：

（理解）

Ahotspotisasiteinthegenomeatwhichthefrequencyofmutation（orrecombination）isverymuchincreased,usuallybyatleastanorderofmagnituderelativetoneighboringsites.

形成突变热点的最主要的原因是5－甲基胞嘧啶的存在。

C→U的错误可由尿嘧啶糖基酶系统修复；

CMe→T的错误，修复系统的修复效率较低。

第三节DNA的修复（都看一下）

一、复制修复：

1.尿嘧啶－糖基酶系统：

修复对象：

掺入到DNA链的U（能与A配对，PolIII无法修复）

修复过程：

⏹糖苷水解酶特异性切除受损核苷酸上的N-β糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点；

⏹AP核酸内切酶把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA；

⏹DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链。

2.错配修复系统（重点掌握）

使错配产生的突变率由10－8降低到10－10或10－11

如何识别模板链和新生链？

甲基化酶使GATC序列中的腺嘌呤甲基化：

N6－甲基腺嘌呤。

沿着新生链，有一个甲基化梯度，靠近复制叉处甲基化程度最小，亲本链上甲基化程度高而均一。

未甲基化的子代链上，包含错配碱基的DNA片段被切除并修复。

3.E.Coli中的错配修复系统：

a）在MutL二聚体的参与下，MutS二聚体与错配位点结合

b）MutS包含两个DNA识别位点（一个识别错配位点，另一个识别位点不具有序列和结构的特异性），伴随着ATP的水解，它在DNA上移动，直到遇上GATC位点

c）MutS在移位的过程中同时与错配位点结合，形成一个环状结构；

d）GATC序列的识别使MutH核酸内切酶和MutSL结合，核酸内切酶切开未甲基化的子代链；

e）在解螺旋酶UvrD的帮助下，核酸外切酶降解从GATC位点到错配位点的DNA片段被；

f）由DNAPOLIII合成新链。

二、损伤修复（都要看）

1.光修复：

（直接修复）

胸腺嘧啶二聚体光解形成单体

2.切除修复（Excisionrepair）：

损伤发生后，首先由DNA切割酶（excinuclease）在已损伤的核苷酸5和3位分别切开磷酸糖苷键，产生一个由12-13个核苷酸（原核生物）或27-29个核苷酸（人类或其它高等真核生物）的小片段。

移去小片段后由DNA聚合酶I（原核）或ε（真核）合成新的片段。

由DNA连接酶完成修复中的最后一道工序。

3.重组修复（Recombination-repair）：

损伤部位，复制酶无法通过；

跳过，重新合成引物和DNA；

子代链损伤处留下缺口；

遗传重组，从完整母链上响应核酸酸序列移到子链缺口处；

再合成序列补上母链缺口。

4.SOSresponse（重点掌握）

是细胞DNA受损或复制系统被抑制时产生的应急反应，

SOS反应包括：

溶原性细菌释放噬菌体；

DNA损伤的修复效应和诱变效应；

细胞分裂的抑制。

诱导的修复系统：

避免差错的修复系统（errorfreerepair）

倾向差错的修复系统（errorpronerepair）

SOS诱导产生DNA聚合酶Ⅳ和V：

PolIV和PolV没有3’核酸外切酶校正功能，使DNA链在损伤部位出现不配对碱基时，复制仍能继续前进。

在此情况下允许错配可增加存活的机会。

SOS反应由RecA蛋白和LexA蛋白相互作用引起。

RecA（相对分子质量为22700）被称为辅蛋白酶（coprotease），在有单链DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激活而促进LexA自身的蛋白水解酶活性。

LexA蛋白是许多基因的阻遏物，当它被RecA激活自身的蛋白水解酶活性后自我分解，使一系列SOS基因得以表达，如:

umuDC（编码DNA聚合酶V）

dinB（编码DNA聚合酶Ⅳ）

第四章重组和转座

第一节重组的分类（类型及特点）

一、 同源重组或普遍性重组：

—依赖于参与重组的DNA分子在序列上的广泛一致性；

—同源性重组可以发生在两条同源DNA上的任何位点；

—经常发生于减数分裂期的同源染色体之间。

二、位点特异性重组

—这种重组的特点是重组发生在特异位点，此位点含有短的同源序列,供位点特异性重组酶识别（如λ噬菌体DNA整合到寄主DNA）；

—重组DNA的其它区域不具有同源性

三、转座：

（与靶位点在序列上无相关性）

—转座分为复制型、非复制及保守型三种类型

四、模板选择（copychoice）性重组

适用于RNA病毒，在这种重组中，聚合酶从一个模板转换到另一个模板来合成RNA，结果新合成的分子将含有两个不同亲本的遗传信息

第二节同源重组

一、Holliday连接：

（掌握）

在同源染色体的相同位点产生切口

两条染色体的DNA链发生交叉

切口封闭，形成hollidayjunction（或chi结构）

Branchmigration（分枝迁移）

在两对同源链的其中任意一对上产生切口，拆分中间体

第三节转座（transposition）

一、原核转座子的类型及特征（掌握）

1.插入序列（insertionsequences,IS）:

■IS家族的结构：

—短的正向重复序列（directrepeats,DR）

—略长的反向重复序列（invertedrepeats，IR）

—1kb左右的编码区，仅编码和转座有关的转座酶。

■对靶位点的选择有三种形式：

随机选择，热点选择和特异位点的选择。

 2.复合转座子（Compositetransposons）：

—含有一个中心序列和位于两侧的臂（arm）；

—除了和自身转座有关的基因外，中心序列含有抗药性基因等遗传信息；

—复合转座子两端的臂由IS序列组成。

3.TnA家族:

■TnA是复制型转座的转座子，长约5kb左右。

■两端具有末端反向重复序列（而不是IS），长约38bp左右，任一个缺失都会阻止转座。

■中部的编码区编码三个基因：

转座酶，解离酶和抗性基因，TnA家族都带有抗性标记。

■靶位点具有5bp的正向重复序列。

■解离位点（res）是TnA家族特有的内部位点。

二．转座机制：

（理解）

根据转座子的机制，转座可分成三种不同的类型

1．复制型转座（replicativetransposition）：

—Replicativetranspositiondescribesthemovementofatransposonbyamechanisminwhichfirstitisreplicated,andthenonecopyistransferredtoanewsite.

—Replicativetranspositioninvolvestwotypesofenzymaticactivity:

■转座酶：

transposase

■解离酶：

Resolvase

2．非复制型转座（nonreplicativetransposition）

 Nonreplicativetranspositionallowsatransposontomoveasaphysicalentityfromadonortoarecipientsite.Thisleavesabreakatthedonorsite,whichislethalunlessitcanberepaired.

3．保守转座（conservativetransposition）

Conservativetranspositioninvolvesdirectmovementwithnolossofnucleotidebonds

三、转座中的一般过程：

1.非复制转座：

（需看懂）

转座子插入到DNA上新的位点，首先交错切开靶DNA，再将转座子连接到靶DNA的凸出单链上，最后填补空缺完成转座。

第四节真核生物的转座因子

发现者：

BarbaraMcClintock

（芭芭拉·，麦克林托克）

一、Ac-Ds系统（掌握）

—若玉米带有野生型C基因，则胚乳呈紫色；

—C基因的突变阻断了紫色素的合成，那么胚乳呈白色;

—在胚乳发育的过程中，突变发生回复导致斑点的产生,回复突变发生在早期发育阶段，紫斑就比较大;

—McClintock推测原来的C突变（无色素）是由一个“可移动的控制因子”引起的，称解离因子（dissociator，Ds），它可以插入到C基因中（即转座）。

—另一个可移动的控制因子是激活因子（activator，Ac），它的存在可激活Ds转座，进入C基因或其他基因，也能使Ds从基因中转出，使突变基因产生“回复突变”，这就是Ac-Ds系统

第五章转录和转录后加工

第一节RNA聚合酶（掌握）

RNA合成的基本特征：

–RNA的前体:

ATP，GTP，CTP，UTP

–RNA合成的方向:

5’→3’

–RNA聚合酶能起始一条新链的合成，起始核苷酸一般是嘌呤核苷三磷酸（pppA或pppG）

–RNA聚合反应的四个步骤:

1模板识别:

2起始:

短核苷酸链合成并释放（流产式起始：

短核苷酸链合成并释放，进行若干次循环）

3延伸:

聚合酶合成RNA

4终止:

RNA聚合酶和RNA释放

原核生物的RNA聚合酶

RNA聚合酶的组成:

全酶:

α2ββ’andσ

核心酶:

α2ββ’

σ亚基使核心酶对松散结合位点的亲和力大幅度降低，而对启动子序列的亲和力明显上升；

σ亚基被释放；或者改变与核心酶的连接方式，不再参与DNA的结合（延伸过程中，约70％的RNA聚合酶仍然保留了σ因子）；

酶

细胞内定位

转录产物

相对活性

对α-鹅膏覃碱的敏感程度

RNA聚合酶I

核仁

rRNA

50%-70%

不敏感

RNA聚合酶II

核质

hnRNA

20%-40%

敏感

RNA聚合酶III

核质

tRNA

5sRNA

snRNA

约10%

存在物种特异性

第二节启动子

一、原核生物启动子：

（掌握）

a）-10序列：

又称为牢固结合位点

b）-35序列：

又称为RNA聚合酶识别位点

-10序列和-35序列之间一般相距16～19bp，使两个位点恰好位于DNA双螺旋的同一侧，它们之间距离的改变可影响σ因子的作用力而改变效率

葡萄糖效应：

（掌握）

•ATP在腺苷酸环化酶的作用下生成cAMP

•cAMP与环腺苷酸受体蛋白（CAP）结合，形成复合物

•CAP复合物与启动子上的CAP位点结合，降低CAP位点II附近的富含GC区双螺旋结构稳定性，使－10区熔解温度降低，促进乳糖操纵子基因转录的进行

•在葡萄糖存在的条件下，葡萄糖代谢的降解物可抑制腺苷酸环化酶将ATP环化为cAMP

二、真核生物启动子和转录因子：

（真核生物启动子识别由转录因子识别，原核生物识别由RNA聚合酶某些亚基完成）

RNA聚合酶III同时使用上游和下游启动子

PolIICAD的磷酸化，使PolII进入延伸状态，大部分转录因子在这一阶段从启动子脱落

TBP是三种RNA聚合酶通用的转录因子

第三节转录的起始、延伸和终止（原核生物）

一、起始:

（掌握起始和终止）

与DNA结合形成封闭二元物

DNA溶解形成开放复合物

流产式起始，形成三元复合物

σ因子释放或改变连接方式，进入正式延伸

二、延伸:

（理解）

•NTPentryandaddition

•Topologyofelongation

•Inchwormmodel

三、转录的终止（两种终止子的结构与作用机理）

原核生物终止子的两种类型：

不依赖ρ因子的终止子（intrinsicterminators,Rho-IndependentTerminator）

可以在不依赖其它辅助因子的情况下，终止细菌RNA聚合酶的转录

结构：

形成发夹结构

发夹结构末端是U区域

发夹结构颈基部富含G-C区域

作用机理：

形成发夹结构

RNA聚合酶暂停

终止子U区域与RNA的A区域之间作用力减弱

A-U键断裂，RNA释放。

依赖ρ因子的终止子

Rho-dependentterminatorsaresequencesthatterminatetranscriptionbybacterialRNApolymeraseinthepresenceoftherhofactor.

结构：

有发夹结构、后面没有富含U区域）

ρ因子终止转录作用机理：

（掌握）

–RNA合成起始以后，ρ因子附着在新生的RNA链上，依靠水解ATP产生的能量，沿着5’→3’方向朝RNA聚合酶移动

–终止子形成发夹结构，ρ因子追上暂停的RNA聚合酶

–ρ因子解开DNA/RNA杂合链，使RNA链从DNA模板上释放，转录过程终止

抗终止作用（理解）

一种RNA聚合酶通过特定终止位点，继续合成RNA的转录调节机制。

•N蛋白的抗终止识别位点是nut位点，lambda噬菌体的nut位点包含两个序列元件:

boxA和boxB

•NusB－S10二聚体特异性结合于boxA区域，NusG可能起装配作用

•NusA是一种提高终止效率的通用转录因子，可以促进RNA聚合酶在终止子的停顿。

•N蛋白与nusA因子结合时，可以抑制nusA和RNA的结合（这对终止反应是必需的）

二、真核生物的转录后加工

♦真核生物mRNA的转录后加工：

（掌握）

•5’端形成特殊的帽子结构；

•在3’端切断并添加polyA尾巴；

•通过拼接除去由内含子转录而来的序列；

•链