不同剂量的天花粉蛋白对Caski细胞凋亡的影响.docx
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不同剂量的天花粉蛋白对Caski细胞凋亡的影响
不同剂量的天花粉蛋白对Caski细胞凋亡的影响
（作者:
___________单位:
___________邮编:
___________）
作者：
张艳琼，黄利鸣，李红军，吴江锋【摘要】目的探讨天花粉蛋白（TCS）对人宫颈癌Caski细胞生长的抑制作用及量-效关系。
方法不同浓度TCS作用于体外培养人宫颈癌Caski细胞株，采用吖啶橙荧光染色，荧光显微镜观察TCS对Caski细胞的生长抑制作用；透射电镜和TUNEL检测法观察Caski细胞凋亡及TCS诱导Caski细胞凋亡的量效关系。
结果TCS对Caski细胞的生长具有明显的抑制作用，透射电镜和TUNEL法证实该抑制作用是通过诱导细胞凋亡实现的。
在一定浓度范围内，细胞凋亡数与TCS的浓度之间有剂量依赖性。
结论TCS能诱导体外培养Caski细胞凋亡，最佳浓度为60μg/ml。
【关键词】天花粉蛋白；Caski细胞；细胞凋亡 Abstract:
ObjectiveTostudytheinhibitoryeffectofdifferentdosetrichosanthin（TCS）onCaskicells.MethodsTheantiproliferativeeffectofdifferentdoseTCSonCaskicellswasobservedbyfluorescencemicroscope.TheTUNELassayandelectromicroscopewereusedformeasurementofapoptosisofdifferentdoseTCSonTheCaski.ResultsTheapoptosisofdifferentdoseTCSonCaskiCellsactedastheantiproliferation.ThequantityoftheapoptosisoftheCaskicellsdependedonTCS’dosewithincertainrange.ConclusionTheapoptosisoftheCaskicellswillhappenwhentheyweredealtwithTCSandthebestdoseoftheTCSis60μg/ml. Keywords:
Trichosanthin;Caskicell;Apoptosis 人子宫颈癌是常见妇科恶性肿瘤，严重威胁妇女健康。
天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）是从葫芦科植物栝楼TrichosanthinkirilouiiMaxim的块根中提取的一种单链核糖体失活蛋白（ribosome-inactivatingprotein，RIP），迄今的研究发现TCS具有抗绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤、白血病和子宫颈腺癌等恶性肿瘤作用［1,2］。
本实验旨在研究TCS对人子宫颈磷癌细胞的作用，并探讨其量-效关系，为TCS在抗宫颈癌的临床应用提供实验依据。
1材料与仪器 TCS购自上海金山制药厂（1.2mg/ml）；RPMI-1640培养基购自Gibcol公司；10%新生牛血清购自杭州四季青公司；吖啶橙购自Sigma公司；DNaseI购自上海博亚生物技术有限公司；TritonX-100购自华美生物工程公司；DAB试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；TUNEL试剂盒购自Roche公司；倒置显微镜和多功能显微镜及图像分析系统购自德国Leica；H-7500型透射电镜购自日立。
2方法 2.1细胞培养人子宫颈鳞癌Caski细胞株（中国协和医科大学基础研究所生物物理教研室馈赠），培养于5%CO2，37℃湿化孵箱中。
培养基RPMI-1640中含10%新生牛血清，0.1U/L青霉素，0.1U/L链霉素，所有实验均取对数生长期细胞。
2.2倒置和荧光显微镜观察细胞的形态学变化体外培养的Caski细胞用PBS处理为阴性对照组、实验组分别用不同浓度（20,40，60，80，100μg/ml）TCS处理24h和48h后，加入0.01%吖啶橙磷酸缓冲液（pH6.0）50μl，轻轻混匀，静置2min后，于荧光显微镜下观察并记录图像。
2.3透射电子显微镜观察实验组以60μg/ml的TCS处理Caski细胞24h和48h，PBS处理为阴性对照组。
2.5%戊二醛固定、包埋、超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸钠硝酸铅双重染色后，倒置电镜下观察并拍照。
2.4脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测实验组用不同浓度（20,40,60,80,100μg/ml）TCS处理Caski细胞24h。
按TUNEL试剂盒说明操作。
用DNaseⅠ处理Caski为阳性对照，试剂2替代TUNEL反应混合溶液为阴性对照。
凋亡细胞的判断：
胞核棕黄色染色为阳性，阴性细胞不显色。
2.5图像分析软件定量分析每一玻片任选10个视野，计算在200倍光镜下检测凋亡阳性细胞的个数、平均面积和平均灰度［3］。
数据统计学分析用SPSS10.0统计软件（t检验）。
3结果 3.1倒置显微镜下观察对照组细胞呈梭形，贴壁牢固、密集，折光性好，胞质饱满；实验组中经20μg/mlTCS作用48h后细胞间隔增大,细胞体积缩小，胞浆凝缩，折光率增强，贴壁性差；60μg/mlTCS浓度作用48h脱落细胞数增加,细胞表面出现发泡现象；TCS药物浓度达到100μg/ml作用24h后即出现上述特征。
3.2荧光显微镜下观察经吖啶橙荧光染色后，长链的DNA在荧光显微镜592nm波长紫外线激发下发出绿色荧光，而RNA发出黄色或黄绿色荧光。
本实验的阴性对照组的细胞核DNA为绿色均匀荧光（图1）；各实验组均可见到凋亡的细胞：
细胞膜完整，细胞核或细胞质可见致密浓染的黄色荧光，出现凋亡小体（图2）。
3.3透射电镜观察阴性对照组细胞表面微绒毛丰富，胞质内可见线粒体、粗面内质网、游离核糖体，核仁明显，未发现凋亡细胞（图3）。
TCS处理细胞可见明显的细胞凋亡：
细胞膜完整，染色质局部增多且趋边凝聚，核固缩，有凋亡小体形成；部分细胞表面微绒毛减少或消失，胞质可见大量空泡结构；细胞核趋边，呈半月形；有的细胞核碎裂为一个或多个致密小体（图4）。
3.4TUNEL法检测结果TCS处理细胞后24h，采用TUNEL法染色细胞核呈棕黄色的细胞判为凋亡细胞，未被染色为非凋亡细胞。
阴性对照组未见凋亡细胞，而阳性对照组和各实验组均可见大量的胞核棕黄色染色细胞，采用图像分析软件定量分析阳性细胞（表1）。
表1TCS作用Caski细胞后图像定量分析结果（略） 表1中凋亡细胞数量显示，在一定浓度范围内（20μg/ml到60μg/ml），随着TCS浓度逐渐增加，凋亡细胞的数量也随之增多；TCS的剂量从60μg/ml增高到100μg/ml，凋亡数减少；剂量为60μg/ml时，凋亡数最多。
由表1中的单个细胞平均面积数可以看出，除60μg/ml的TCS剂量组略大于阳性对照组外，其它各剂量组的平均面积均显著大于阳性对照组（P0.05）。
由表1中的平均灰度可以看出，阴性对照组、60，80μg/ml各剂量组的单个细胞的平均灰度均显著高于20，40，100μg/ml剂量组（P0.05）。
4讨论 子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，约80%～95%为鳞状细胞癌，其次为腺癌或其它类型癌。
自从RuQH［2］发现TCS能引起人子宫颈腺癌细胞系HeLa细胞凋亡以来，有学者［4～6］对TCS引起HeLa细胞的凋亡机制进行了较为深入的探讨。
发现TCS处理可以引起HeLa细胞中多个基因的表达改变，其中Bcl-2蛋白表达减少、Bax蛋白增多和CREB蛋白的磷酸化；实验还显示TCS引起HeLa细胞凋亡与抑癌基因的去甲基化有关。
但文献对发病率较高的子宫颈鳞状细胞癌的报告很少［7］，目前认为，TCS能抑制体外子宫颈鳞状细胞癌Caski细胞的生长，该过程可能与对OPCML、DAPK基因的去甲基化作用有关。
本实验研究了TCS在体外对人子宫颈鳞癌Caski细胞的生长影响，通过吖啶橙荧光染色、TUNEL法和透射电镜等多种方法检测了细胞凋亡。
结果显示，多种浓度的TCS均能诱导子宫颈鳞癌Caski细胞凋亡。
在研究TCS作用于HeLa细胞量效关系时发现，HeLa细胞的凋亡比例与TCS具有剂量依赖性［8］。
为了进一步开发TCS抗宫颈癌的潜在价值，为临床治疗提供更细致的客观数据，本研究进一步研究了TCS作用于子宫颈鳞癌Caski细胞的量-效关系。
结果表明，TCS的剂量从20μg/ml到60μg/ml，随着浓度的增高，细胞凋亡数明显增加，表明药物在一定的浓度范围内，两者有一定的剂量依赖关系；剂量从60μg/ml增高到100μg/ml，对凋亡的影响越来越小；剂量为60μg/ml时，凋亡最明显。
该实验将为TCS在抗宫颈癌的临床应用提供一定的实验依据。
【参考文献】 ［1］孙景，涂水平，吴裕圻，等.天花粉蛋白诱导胃癌细胞MKN245凋亡中P53、Bcl-2、c-myc蛋白表达变化［J］.上海医学，2001,21（4）:
291. ［2］RuQH,LuoGA,LiaoJJ,etal.CapillaryelectrophoreticdeterminationofapoptosisofHeLacellsinducedbytrichosanthin［J］.JChromatogrA,2000,894（1-2）:
165. ［3］常青，唐海兰.PACAP对VSMC表达增生细胞核抗原影响的定量分析［J］.中国病理生理学杂志，1998,14:
617. ［4］黄益玲，胡火军，黄利鸣，等.天花粉蛋白诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的分子机制研究［J］.中国药理学通报，2007,23
（1）:
99. ［5］WangP,LiJC.Trichosanthin-inducedspecificchangesofcytoskeletonconfigurationwereassociatedwiththedecreasedexpressionlevelofactinandtubulingenesinapoptoticHelacells［J］.LifeSci，2007,81（14）:
1130. ［6］WangP,YanH,LiJC.CREB-mediatedBcl-2expressionintrichosanthin-inducedHelacellapoptosis［J］.BiochemBiophysResCommun，2007,363
（1）:
101. ［7］王艳华，黄利鸣.OPCML、DAPK基因甲基化与宫颈癌CasKi细胞凋亡相关性的研究［J］.中国药理学通报，2008，24（4）:
543. ［8］DouCM,LiJC.EffectofextractsoftrichosanthesroottubersonHepA-HcellsandHeLacells［J］.WorldJGastroenterol.2004,10（14）:
2091. 3结果 3.1倒置显微镜下观察对照组细胞呈梭形，贴壁牢固、密集，折光性好，胞质饱满；实验组中经20μg/mlTCS作用48h后细胞间隔增大,细胞体积缩小，胞浆凝缩，折光率增强，贴壁性差；60μg/mlTCS浓度作用48h脱落细胞数增加,细胞表面出现发泡现象；TCS药物浓度达到100μg/ml作用24h后即出现上述特征。
3.2荧光显微镜下观察经吖啶橙荧光染色后，长链的DNA在荧光显微镜592nm波长紫外线激发下发出绿色荧光，而RNA发出黄色或黄绿色荧光。
本实验的阴性对照组的细胞核DNA为绿色均匀荧光（图1）；各实验组均可见到凋亡的细胞：
细胞膜完整，细胞核或细胞质可见致密浓染的黄色荧光，出现凋亡小体（图2）。
3.3透射电镜观察阴性对照组细胞表面微绒毛丰富，胞质内可见线粒体、粗面内质网、游离核糖体，核仁明显，未发现凋亡细胞（图3）。
TCS处理细胞可见明显的细胞凋亡：
细胞膜完整，染色质局部增多且趋边凝聚，核固缩，有凋亡小体形成；部分细胞表面微绒毛减少或消失，胞质可见大量空泡结构；细胞核趋边，呈半月形；有的细胞核碎裂为一个或多个致密小体（图4）。
3.4TUNEL法检测结果TCS处理细胞后24h，采用TUNEL法染色细胞核呈棕黄色的细胞判为凋亡细胞，未被染色为非凋亡细胞。
阴性对照组未见凋亡细胞，而阳性对照组和各实验组均可见大量的胞核棕黄色染色细胞，采用图像分析软件定量分析阳性细胞（表1）。
表1TCS作用Caski细胞后图像定量分析结果（略） 表1中凋亡细胞数量显示，在一定浓度范围内（20μg/ml到60μg/ml），随着TCS浓度逐渐增加，凋亡细胞的数量也随之增多；TCS的剂量从60μg/ml增高到100μg/ml，凋亡数减少；剂量为60μg/ml时，凋亡数最多。
由表1中的单个细胞平均面积数可以看出，除60μg/ml的TCS剂量组略大于阳性对照组外，其它各剂量组的平均面积均显著大于阳性对照组（P0.05）。
由表1中的平均灰度可以看出，阴性对照组、60，80μg/ml各剂量组的单个细胞的平均灰度均显著高于20，40，100μg/ml剂量组（P0.05）。
4讨论 子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，约80%～95%为鳞状细胞癌，其次为腺癌或其它类型癌。
自从RuQH［2］发现TCS能引起人子宫颈腺癌细胞系HeLa细胞凋亡以来，有学者［4～6］对TCS引起HeLa细胞的凋亡机制进行了较为深入的探讨。
发现TCS处理可以引起HeLa细胞中多个基因的表达改变，其中Bcl-2蛋白表达减少、Bax蛋白增多和CREB蛋白的磷酸化；实验还显示TCS引起HeLa细胞凋亡与抑癌基因的去甲基化有关。
但文献对发病率较高的子宫颈鳞状细胞癌的报告很少［7］，目前认为，TCS能抑制体外子宫颈鳞状细胞癌Caski细胞的生长，该过程可能与对OPCML、DAPK基因的去甲基化作用有关。
本实验研究了TCS在体外对人子宫颈鳞癌Caski细胞的生长影响，通过吖啶橙荧光染色、TUNEL法和透射电镜等多种方法检测了细胞凋亡。
结果显示，多种浓度的TCS均能诱导子宫颈鳞癌Caski细胞凋亡。
在研究TCS作用于HeLa细胞量效关系时发现，HeLa细胞的凋亡比例与TCS具有剂量依赖性［8］。
为了进一步开发TCS抗宫颈癌的潜在价值，为临床治疗提供更细致的客观数据，本研究进一步研究了TCS作用于子宫颈鳞癌Caski细胞的量-效关系。
结果表明，TCS的剂量从20μg/ml到60μg/ml，随着浓度的增高，细胞凋亡数明显增加，表明药物在一定的浓度范围内，两者有一定的剂量依赖关系；剂量从60μg/ml增高到100μg/ml，对凋亡的影响越来越小；剂量为60μg/ml时，凋亡最明显。
该实验将为TCS在抗宫颈癌的临床应用提供一定的实验依据。
【参考文献】 ［1］孙景，涂水平，吴裕圻，等.天花粉蛋白诱导胃癌细胞MKN245凋亡中P53、Bcl-2、c-myc蛋白表达变化［J］.上海医学，2001,21（4）:
291. ［2］RuQH,LuoGA,LiaoJJ,etal.CapillaryelectrophoreticdeterminationofapoptosisofHeLacellsinducedbytrichosanthin［J］.JChromatogrA,2000,894（1-2）:
165. ［3］常青，唐海兰.PACAP对VSMC表达增生细胞核抗原影响的定量分析［J］.中国病理生理学杂志，1998,14:
617. ［4］黄益玲，胡火军，黄利鸣，等.天花粉蛋白诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的分子机制研究［J］.中国药理学通报，2007,23
（1）:
99. ［5］WangP,LiJC.Trichosanthin-inducedspecificchangesofcytoskeletonconfigurationwereassociatedwiththedecreasedexpressionlevelofactinandtubulingenesinapoptoticHelacells［J］.LifeSci，2007,81（14）:
1130. ［6］WangP,YanH,LiJC.CREB-mediatedBcl-2expressionintrichosanthin-inducedHelacellapoptosis［J］.BiochemBiophysResCommun，2007,363
（1）:
101. ［7］王艳华，黄利鸣.OPCML、DAPK基因甲基化与宫颈癌CasKi细胞凋亡相关性的研究［J］.中国药理学通报，2008，24（4）:
543. ［8］DouCM,LiJC.EffectofextractsoftrichosanthesroottubersonHepA-HcellsandHeLacells［J］.WorldJGastroenterol.2004,10（14）:
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