枸杞组培快速繁殖技术研究报告.docx
《枸杞组培快速繁殖技术研究报告.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《枸杞组培快速繁殖技术研究报告.docx（48页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
枸杞组培快速繁殖技术研究报告
枸杞组培快速繁殖技术研究
①本文通过对“宁杞２号”枸杞离体组织培养的研究，进行了丛生芽诱导，试管母本的建立，嫩梢增殖，生根状况分析及其移栽等方面的探讨，进而探索了组培快速繁殖以及生产上适用的组培技术，结果表明：
改良ＭＳ＋ＢＡ０．２＋ＫＴ０．３＋ＮＡＡ０．５和改良ＭＳ＋ＢＡ０．７５＋ＮＡＡ１＋ＩＢＡ０．１交替使用，可加快增殖速度；以较短的根系移栽试管苗，既省工、省力，又能提高成活率，从而确立了一套较为理想的快速繁殖体系，为大规模工厂化育苗提供了可靠依据
②选用“宁杞2号”离体组织进行了愈伤组织诱导和生根状况的研究．筛选出了适宜的愈伤组织诱导和生根的培养基．结果表明，最适的愈伤组织诱导培养基为1／2MS＋BA1．0mg／L＋NAA1．0mg／L,最适的生根培养基是；1／2MS＋NAA0．6mg／L＋IBA0．2mg／L．
③本试验以枸杞嫩枝及顶芽作外植体进行组织培养。
结果表明,不定芽诱导用MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L;增殖培养基以MS+6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L较佳;生根培养基为1/2MS（大量元素减半,其它成分不变）+IBA0.1mg/L+活性碳0.1%。
④植物名称:
宁夏枸杞（Lyciumbarbarum）材料类别:
多年生植株上当年萌生出的嫩枝茎尖。
培养条件:
基本培养基为MS。
长芽培养基中的激素成分为（毫克/升）:
①IAA0.5,KT1,②IAA0.5,BA1。
蔗糖浓度为3％。
生根培养基成分为1/2MS（大量元素减半）,附加Zt0.2,NAA0.4,蔗糖浓度2％。
培养温度25～30℃,自然光照。
⑤MS和MS（1/2大量、微量元素全量）培养基均适于枸杞的培养、芽增殖和发根.在培养基的附加成分中激素的调节是重要的,激素以IBA浓度在0～1.1×10-6mol/L均适其培养,但以IBA的浓度为5.5×10-7mol/L效果最佳,在有机成份中VB1的含量对发根有明显的促进作用.微量全量对枸杞的发根是必需的.MS（1/2大量、微量元素全量）+VB12.96×10-5mol/L+IBA5.5×10-7mol/L（其他有机成分常量）是枸杞芽增殖与发根同步的最佳培养基.
⑥枸杞属植物（LyciumhaminifoliumMill）花粉粒发育成胚和植株的形成已有报导。
本文报导枸杞叶外植体的愈伤组织诱导及其植株的再生。
从未开花植株上摘取无病虫害的叶片作材料,先用流水冲洗除去尘土,然后在70％的酒精中浸20秒左右,再在含万分之二昇汞和5％安替福民的溶液中消毒4～5分钟（消毒时间不能过长,以免伤害叶片）。
用无菌水淋洗3～5次后,在无菌条件下将叶片横切成1厘米左右的切段,接种在Murashige和Skoog培养基上,培养基附加激动素（K）2.0,吲哚乙酸（IAA）2.0或K4.0,IAA
枸杞髓组织离体培养及高频率植株再生的研究*
曹有龙 陈 放 罗 青 曲 琳
摘 要：
枸杞髓组织在4种MS培养基上都能诱导出愈伤组织，诱导率53.7%～100%。
在培养基MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L获得的愈伤组织，呈颗粒状，分散性能好，胚性细胞多。
将其转移到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.01mg/L的分化培养基上获得大量绿色小芽，小芽在MS+6-BA0.2mg/L的培养基上得到快速繁殖，繁殖系数50～150株/芽.月。
丛生芽在MS+NAA0.2mg/L的培养基上形成完整植株。
关键词：
枸杞；髓组织；离体培养；植株再生
枸杞（LyciumbarbarumL.）是重要的药用植物，多年来，国内外科技工作者十分重视枸杞的组织培养，已有用叶片、花药、下胚轴、茎端及幼嫩子房为材料进行组织培养分化出植株的〔1,2,3〕，我们在此基础上，以枸杞髓组织为试验材料进行组织培养，获得了再生植株，为枸杞细胞突变体的筛选、细胞悬浮培养、原生质分离、细胞杂交、基因转移的研究提供依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料 供试材料为宁夏农科院枸杞研究所培育的高产优质枸杞新品种——宁杞１号。
1.2.1 愈伤组织的诱导 取当年生长的明显分化成髓组织的枝条，摘除叶子、侧芽和带有分生组织的顶端100mm，把外植体的切端蘸熔蜡封着伤口，然后浸入70％酒精中20s，再转入0.1%HgCl2溶液中，经过8～10min后，用无菌水冲洗3遍，最后以吸水纸吸干，从茎的两端各切除10mm，余下部分切成20mm的小段，用无菌镊子夹着茎的切段，用瓶塞打孔器从切段中取出圆柱体髓组织，并将其转移到90mm的无菌培养皿中，用解剖刀切成2～3mm厚的小圆片，接种到4种含不同激素的MS固体培养基上诱导愈伤组织发生。
1.2.2 愈伤组织的继代培养 在P2培养基中加入500mg/L的水解酪蛋白作为继代培养的培养基。
挑选色泽鲜艳、生长迅速的愈伤组织进行继代培养，每次20d，2～3次继代后，出现疏松颗粒状胚性愈伤组织，选择颗粒较细的愈伤组织，加快继代频率（2周1次），当愈伤组织易碎，颗粒均匀且生长迅速时，改为3周1次保存之。
1.2.3 分化培养 将上述继代过程中产生的胚性愈伤组织转移到含不同浓度的6－BA和NAA的MS培养基上，4周后观察不同培养基上愈伤组织的分化出芽情况。
1.2.4 生根培养 选择较为健壮的丛生芽，切除底部的叶片，只保留上部2～3片叶，插入生根培养基中，3周后观察其生根情况。
在上述各步骤中，各外植体均接种于容量为120ml的三角瓶中，每瓶3～4个外植体，每处理3～4次重复。
培养条件：
温度20～25℃，每日光照10～12h，光照强度为2500～3000lx。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导和生长
枸杞髓组织切片接到诱导培养基上3d后开始膨大，在切面上开始形成白色愈伤组织（图版Ⅰ:
1），其中P1培养基诱导频率最高，可达95.7%；P3与P4培养基诱导的愈伤组织白色紧密，不易分散，经过30d继代培养，有的可直接分化出苗，但频率很低（表1），而P2培养基上诱导的愈伤组织为淡黄色松散型，这种愈伤组织继代转接后能迅速生长，多次继代培养后，颗粒小，分散好，难以用镊子夹起来，而且胚性细胞多，分化频率高。
表１ 枸杞髓组织在不同激素配比培养基上的诱导情况
Table1EffectsofhormonesoncalliinductionofLyciumbarbarumL.pithtissue
培养基编号
No.ofmedium
培养基组分
（mg/L）
Contentsofmedium
开始启动时间
（d）
Timeofcalliproduced
接种块数
（块）
Numberofexplantsplanted
出愈块数
Numberofexplantswithcalliinduction
诱导频率
（%）
Percentageofcalliinduction
P1
MS+2,4-D0.5
3
95
95
100
P2
MS+6-BA0.1+NAA0.5
10
95
75
78.9
P3
MS+6-BA0.5+NAA0.5
14
95
70
73.7
P4
MS+NAA0.1+KT0.5
14
95
51
53.7
2.22,4-D对愈伤组织继代的影响
在P1培养基中，我们加入植物激素2,4-D0.5mg／L诱导愈伤组织发生，诱导率为100%。
这说明2,4-D对枸杞愈伤组织的诱导有一定的促进作用，将其转入含不同激素成分的培养基中进行继代培养，结果如表2。
表2 2,4-D对枸杞愈伤组织的影响
Table2Effectsof2,4-DoncalliofLyciumbarbarumL.
培养基编号
No.ofmedium
激素浓度
（mg/L）
Hormoneconcentration
生长情况
Growthstatus
褐化时间（d）
Timeofcallibecomebrown
愈伤组织特点
Callicharacteristics
（1）
MS+2,4-D2
++++
10
白色水质状，生长快
（2）
MS+2,4-D1
+++
12
白色水质状，生长快
（3）
MS+2,4-D0.5
++
25
白色松散，生长较快
（4）
MS+2,4-D0.5+CH
++
28
白色松散，生长较快
（5）
MS+2,4-D0.5+KT0.5
+
2
白色紧密，颜色由白转绿
（6）
MS+NAA0.5+6-BA0.5
+++
－
淡黄色，颗粒状
注:
愈伤组织生长情况分四级:
+很少 ++少 +++中等 ++++大量
Fourclassesweredividedaccordingtothecallusgrowth:
+verysmall ++small +++medium ++++large.
表2可以看出,2,4-D对枸杞愈伤组织的形成在一定范围内（0.5～2mg／L）随2,4-D浓度的增加,愈伤组织生长加快,但褐化时间提前。
当0.5mg／L2,4-D与0.5mg／LKT配合使用时，愈伤组织生长速度很低，而且变得十分坚硬，颜色也由白色转为绿色，近培养基部分2d后出现褐化；培养基中添加500mg／LCH对愈化组织的生长有很好的促进作用。
当把培养基含2,4－D0.5mg／L诱导出的愈伤组织转接到P2培养基后，愈伤组织逐渐转变为颗粒状胚性愈伤组织，与P2培养基上诱导的愈伤组织物质很相似（图版Ⅰ:
2）。
因此，如果用含2,4－D0.5mg／L的培养基诱导愈伤组织发生，用P2培养基进行继代培养，将获得大量颗粒状胚性愈伤组织。
因此，这种方法是枸杞进行离体快繁较为适宜的途径。
表3 不同植物激素对枸杞愈伤组织分化频率的影响
Table3EffectsofdifferenthormonesondifferentiationrateofLyciumbarbarumL.calli
培养基（mg/L）
Medium
分化频率（％）
Regenerationrate
每块愈伤组织平均的苗数（个）
Averagenumberofshootsonasinglecallus
特征
Characteristics
6-BA2
100
12
大多数玻璃化
6-BA1
90
10
部分玻璃化
6-BA0.5
97
8
正常
6-BA0.5+NAA0.5
90
10
芽基部有愈伤组织产生
6-BA0.5+NAA0.01
93
11
正常
2.3分化培养
将经过P2培养基进行继代培养15d的愈伤组织转入附加3%蔗糖、0.8%琼脂，500mg／LCH,pH5.8～6.0含不同6-BA浓度的MS分化培养基，两周后开始形成芽点，可进一步发展成芽丛（图版Ⅰ:
3），所做不同植物激素配比试验结果表明，枸杞愈伤组织芽的分化需要一定浓度使用的5种含6-BA的培养基分化频率都在90％以上，6-BA浓度高,每块愈伤组织得苗数多,但玻璃化苗也多,6-BA与NAA配合使用,能显著提高愈伤组织的分化频率,但同时愈伤组织也得到增殖,分化得到的苗必须及时转移，否则苗的基部又会转化为愈伤组织。
单独使用6-BA，浓度为0.5mg／L或者附加NAA0.01mg／L时愈伤组织分化频率略为下降，但分化出的苗正常，比较几种培养基分化出苗的结果，以MS+6-BA0.5mg／L+NAA0.01mg／L结果最好（表4）。
表4 枸杞芽的扩繁
Table4Reproductionofbuds
培养基
Medium
繁殖系数（株／月.芽）
Coefficientofreproduction
特征
Characteristics
MS+6-BA1
0-5
转变为玻璃化苗
MS+6-BA0.5
10-30
部分有玻璃化现象
MS+6-BA0.2
50-150
正常苗
2.4芽的扩增
在愈伤组织上分化形成的芽，等长到2cm高时，将其沿基部切下，转入含不同6-BA浓度的培养基中，使其扩增，结果如表5。
从表5可以看出，以MS+6-BA0.2mg／L时，芽生长正常，经过20d的培养，每芽可产生50～150株无根苗（图版Ⅰ：
4），但BA为1mg／L时，芽不能进行扩增，培养20d后就转变为玻璃化苗，6-BA0.5mg／L的培养基虽能进行扩繁，但随着培养时间的延长，部分也转化为玻璃化苗。
2.5生根培养
将丛生芽沿基部切下，接种到生根培养基上诱导生根，结果如表5．
表5 不同植物激素浓度对枸杞幼芽生根的影响
Table5EffectsofdifferenthormonesofLyciumbarbarumL
培养基（mg／L）
Medium
接种苗数（个）
Numberofplantedshoots
生根芽数（个）
Numberofshootswithinducedroot
生根率（％）
Rateofrootformation
MS0
50
2
4
MS+NAA1
50
0
0
MS+NNAA0.5
50
1
2
MS+NAA0.2
50
46
92
从表5可以看出，无激素或者高浓度的生长素不利于枸杞幼芽根的形成，低浓度的生长素对根的形成有促进作用，当培养基中含有NAA0.2mg/L时，能形成大量完整植株（图版Ⅰ：
5），生根率可达92%，且不定根较粗，并有侧根出现。
2.6试管苗移栽
培养基中取出立即移栽的幼苗一般不易成活，7d后就枯萎死亡。
但再生苗经过7d的练苗后，再进行移栽，所栽6盆36株幼苗，成活14株，成活率38.9%，再生苗移栽20d后开始生长，叶片变绿、变厚、侧枝萌发,30d后主茎杆形成,开始木质化,三个月后形成完整植株（图版Ⅰ:
6）。
3 讨 论
细胞胚的诱导和植株再生已有过报道〔4,5〕,并已用愈伤组织进行了悬浮培养〔6,7,8〕,最近,通过原生质体培养得到了愈伤组织,但没有形成再生植株。
本文报道的试验结果与以往相比,一是培养材料选用枸杞髓组织，二是筛选出了具高分化潜能的颗粒状愈伤组织,继代一年多仍保持较高的分化频率，为枸杞抗病突变体筛选、原生质体融合培养以及外源基因转移的研究提供了一个有用的系统。
杞髓组织由薄壁细胞组成，细胞间隙较大，在诱导培养条件下易于发生突变〔9〕，我们以其为材料进行离体培养并获得再生植株，这为枸杞筛选新的品种打下基础。
我们以枸杞髓组织为实验材料，在取材方面，采用石蜡封着切口，防止HgCl2和酒精等消毒液侵入髓组织内部而使髓细胞遭到破坏，得到比较满意的效果。
植物激素2,4-D在枸杞髓组织的愈伤组织诱导中有重要的作用，但高浓度的2,4-D不利于愈伤组织的诱导，而以0.5mg／L效果最佳，诱导率达100%。
以MS+0.5mg／L2,4-D诱导愈伤组织发生；以P2培养基进行继代培养；以MS+6-BA0.5mg／L+NAA0.01mg／L进行分化培养；以MS+0.2mg／LNAA进行生根培养，这是枸杞进行离体培养的一条理想途径。
第三章枸杞的栽培技术
第三章枸杞的栽培技术
第一节构杞对自然环境的要求
环境条件直接影响枸杞的生长发育及其体内的生理活动。
只有搞清楚枸杞同自然条件的关系，才能制定正确的田问管理技术措施，这对于枸杞获得丰产和提高品质均具有重要意义。
温度、光照、水分和土壤是枸杞所要求的最基本的自然条件，是枸杞生长不可缺少的生存因子。
枸杞是一种适应性很强的树种，对温度、光照、水分、土壤等条件要求不太严格。
下面逐一介绍这些生存因子。
一、温度
宁夏枸杞对温度的要求不太严格，并且具有一定的耐寒性。
其野生种的自然分布区处在北纬35。
。
45。
范围内，1月份平均气温一3．3。
C一一15．4℃，绝对最低气温一25．5℃-一41．5。
E，年平均气温4．4℃--12．7℃，7月份平均气温17．2℃--26．6。
C，绝对最高气温33．9。
C一42．9。
C。
在栽培条件下，它既能在海拔2807．7m、年平均气温4．2。
C、极端最低气温一33．6。
C的青海格尔木正常生长结果，也能在绝对气温一41．5℃的乌鲁木齐安全越冬，还能在无霜期135天、全年日照时数2970．5小时、≥l0。
C积温2804．。
C的内蒙古呼和浩特市开花结果（表5）。
据调查，1月份平均气温一4．8℃--7．1℃，年平均气温8．6℃。
9．2℃的区域是宁夏枸杞最适宜的栽培区。
但近年在一些枸杞新发展区，l月份平均气温为一3．3。
C一一15．4。
C，年平均气温为4．4℃--12．7℃也能生长良好，并获得较高产量。
宁夏枸杞一年中对温度的要求，因品种和生长发育阶段不同而异。
在休眠期需要低温，生长期需要高温。
冬季休眠时期耐寒能力很强，在一41．5℃的绝对低温条件下能安全越冬。
当春季气温稳定在7℃左右时，种子即可萌发，幼苗可抵御短期一2℃--一3℃低温。
3月下旬当地温达到0℃以上时，新根就开始生长，4月上旬地温达到8℃--14％时，新根生长最快，10月底地温降到l0。
C以下时，根系基本停止生长。
当4月初气温达5℃以上时，春芽开始萌动，花芽开始分化；4月中旬气温达l0％以上时，开始展叶；12。
（2以上时，春梢生长；15％以上时，生长迅速。
5月上旬气温达16。
C以上时，开始开花，17℃--22％开花最适宜。
果实生长发育的温度在16％以上，20％--25％最适宜。
秋季当气温下降到11℃时，果实生长发育缓慢，体形小，品质降低，但还能成熟。
当旬气温降到l0．8。
C以下时，进入冬季落叶期，随后进入休眠期。
二、光照
宁夏枸杞是强阳性树种，喜光。
光照强弱和日照长短直接影响枸杞的生长和发育。
光照不足，植株发育不良，结果少；光照充分，则植株发育良好，结果多，产量高。
在生产实践中常看到，被遮荫的枸杞树比在正常照下的生长弱，枝条细长，节间也长，木质化程度低，发枝力弱，枝条寿命短，尤其树膛内因缺光照而枯死的枝条多。
被遮荫树的叶片薄，色泽发黄，花果很少。
据调查，树冠各部位因受光照强弱不一样，枝条座果率也不一样。
例如，树冠顶部枝条的座果率比中部枝的高，外围枝座果率比内膛的高，南面枝座果率比北面高。
光照还会影响果实中可溶性固形物含量。
据测定，在同一株树上，树冠顶部光照充足，鲜果的可溶性固形物含量为16．33％，而树冠中部光照弱的果实可溶性固形物含量为13．68％。
由于光照对枸杞生长发育影响大，所以在生产中应很好地选择栽植密度、方式和修剪量，充分利用土地、空间和光照，才能既提高产品质量，又获得丰产。
三、水分
水是一切生物有机体必不可少的极重要的生态因子。
枸杞的生存和生产，水分是不可缺少的条件。
据测定，在成熟的枸杞浆果中水分的含量约占83％。
枸杞耐旱能力强。
野生种在年降雨量不足250ram的干旱、半干旱区仍能正常生长，开花结实。
这是因为枸杞的根系发达并能伸向较深远的土层吸收水分。
同时，从形态解剖上看，枸杞是等面叶，正反两面的栅栏组织都很发达，这种组织的细胞间隙小，使叶面水分蒸发受到节制，相对地保持了更多的水分，增强了耐旱能力。
但是，在栽培条件下若是获得丰产，就必须有足够的土壤水分供应。
有的枸杞园在结果期没有及时灌水，长期处于干旱状态，产量受到严重影响。
枸杞喜湿润条件，但又怕积水。
宁夏枸杞老产区的茨农说：
"枸杞离不开水，又怕水"。
枸杞最忌地表淹水和表土长期积水，在过湿的土壤中，容易诱发根腐病，引起枸杞树死亡。
据吴以德调查，宁夏中宁县恩和乡沙滩村曾在枸杞园周围种水稻，导致枸杞园地下水位上升，使l．9hm2枸杞受浸死亡。
可见枸杞园的地势要高，不能积水，一旦积水，应马上排除，才有利于枸杞生长。
据调查，枸杞在地下水位1．5m以下、20。
40cm土壤含水量15．27％一18．1％时，生长正常，最适宜的土壤含水量为20％。
25％。
地下水位过高，则对枸杞生长不利。
当地下水位在60--10Oem时，树体生长弱，发枝量少，枝条短，花果少，果实也小，叶色提早发黄，容易加重落花落果和落叶。
因为地下水位过高，土壤的通气条件恶化，会影响枸杞根系的呼吸和生长。
另外，地下水位过高会引起土壤次生盐渍化，使土壤可溶性盐含量增加，导致枸杞生长衰弱，产量低。
枸杞对水质的要求不严，宁夏枸杞老产区中宁县用矿化度为19／L以下的黄河水灌溉枸杞园，生长良好。
宁夏干旱地区的同心县王团乡和海原县高崖乡，用3。
69／L的苦水灌溉枸杞园，也生长良好。
水对枸杞树生长的影响因季节不同而异。
春季土壤水分不足时，影响萌芽和枝叶生长；秋季干旱，使枝条和根系生长提前停止；在花果期，尤其是果熟期，如果土壤水分足，果实膨大快，体积大；如果缺水，就会抑制树体和果实生长发育，使树体生长慢，果实小，还会促进花柄和果柄离层形成，加重落花落果，降低产量。
在生长季节，若连续阴雨时间长，枸杞易得霜霉病和黑果病，红熟了的果实会破裂，从而降低果实质量。
四、土壤
土壤作为枸杞的生存基础，供给其生长结实的营养和水分。
枸杞对土壤的适应性很强，在一般的土壤，如沙壤土、轻壤土、中壤土或粘土上，都可以生长。
枸杞的耐盐能力较强，一般在含盐量小于0．2％的土壤上生长良好，并且能获得高产。
甚至在含盐量达0．5％--l．0％的轻盐土上也能生长。
据有关资料介绍，枸杞的耐盐性仅次于胡杨。
但为了获得高产优质的果实，应选择在土层深厚、肥沃的轻壤土上建园最好，沙壤和中壤次之。
在盐渍化严重的土壤上，只能维持生存，不能正常生长和结实。
轻壤土之所以较适于枸杞生长，是因为它土质疏松，透水快，通气好。
但如果土壤沙性过强，则会造成肥水保持能力差，容易干旱，枸杞生长不良。
但如果土质过于粘重，如粘土和粘壤土，虽然养分含量较高，但因经常板结，土壤通气性差，对枸杞根系呼吸及生长都不利，枝梢生长缓慢，花果少，果粒也小。
如果粘土经过改良，如向地里增施麦秆、稻草或羊粪之类，既增加了土壤的疏松性又丰富了土壤养分，枸杞也能生长良好。
亦有资料表明，在土壤肥力较差、含钙量高、有机质少、质地较沙的灰钙土地区，只要加强培肥管理，也适于发展枸杞栽培。
枸杞的耐盐碱能力很强，适应范围也很广。
在新疆0一10Ocm土层含盐量0．5％时生长正常；在以硫酸盐为主的盐碱地上，土壤含盐量达l％时也能生长。
吴以德报道：
宁夏栽种枸杞的土壤大部分可溶性盐含量小于0．2％，凡丰产枸杞园的土壤含盐量多在0．5％以下，而且绝大部分小于0．1％。
丰产枸杞园土壤的盐分组成是以含钙的重碳酸盐为主，HC03-占阴离子总量的50．4％--74．6％，Ca2+占阳离子总量的40．2％。
66．4％。
个别土层随含盐量的增加，氯化物的相对含量增加较快，其盐分组成以碱金属（钾、钠）、氯化物为主。
在土壤表土和心土层含有少量的苏打（NazC03），土壤pH值达8．7的土壤中枸杞生长和结实很好，单产1500。
2250千克／hm2；宁夏主产区宁夏枸杞能在pH值8．2。
8．6、含盐量0．o9％--0．11％的土壤条件下形成单产23萄一4200千克／hm2的丰产园；个别新栽枸杞的土壤pH值9．8，在加强田问管理的情况下，枸
升级会员 