蛋白浓度测定完成.docx
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蛋白浓度测定完成
蛋白浓度测定
蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。
在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：
它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：
物理性质：
紫外分光光度法
化学性质：
凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法，BCA法，胶体金法
染色性质：
考马氏亮蓝染色法、银染法
其他性质：
荧光法
蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。
例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。
常用的测定蛋白质含量方法的比较
方 法
测定范围（μg/ml）
不同种类蛋白的差异
最大吸收波长（nm）
特 点
凯氏定氮法
小
标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定
紫外分光光度法
100—1000
大
280
205
灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响
双缩脲法
1000—10000
小
540
重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大
Folin-酚试剂法
20—500
大
750
灵敏，费时较长，干扰物质多
考马氏亮蓝G-250
50—500
大
595
灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移
BCA
50—500
大
562
灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长
由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。
试验一：
BCA法
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。
在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂SDS，TritonX-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。
基本原理：
碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
主要特点
1.准确灵敏,线性范围广：
BCA试剂的蛋白质测定范围是10－2000ug/ml；
2.快速：
45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。
3.经济实用：
在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。
4.不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。
5.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。
试剂要求
BCA试剂A,B液室温保存，蛋白标准（5mg/ml）-20℃保存
仪器准备
96孔板，酶标仪，37℃恒温箱
使用说明
1.配制工作液:
根据标准品和样品数量，按体积比A：
B（50：
1）配制适量BCA工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
2.稀释标准品：
取10微升标准品用PBS稀释至100ul（标准品一般可用PBS稀释），使终浓度为ml。
将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20ul。
或者依照下面的表格中设置的浓度做标准曲线。
3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20ul。
一般蛋白样品可以几个不同的稀释比例检测，常用的是每孔中加入1ul，2ul，4ul样品，补加PBS到20ul。
4.各孔加入200ulBCA工作液，37℃放置30分钟。
5.冷却到室温，用酶标仪562nm测定OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
20ul体系
蛋白浓度mg/ml
加入C液量ul
补足PBS量ul
0
0
20
2
18
1
4
16
6
14
2
8
12
10
10
3
12
8
14
6
4
16
4
5
20
0
注意事项
1.在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解,如发现细菌污染则应丢弃。
2.样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。
3．要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔,每次均应做标准曲线。
4．当试剂A和B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失，工作液在密闭情况下可保存1周。
5．需准备37℃水浴或温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为540-595nm之间，562nm最佳。
酶标仪需与96孔酶标板配套使用。
使用分光光度计测定蛋白浓度时，试剂盒测定的样品数量会因此而减少。
使用温箱孵育时，应注意防止因水粉蒸发影响检测结果。
二、考马氏亮蓝G－250染色法（Bradford法）
此方法是1976年Bradform建立。
染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。
【原 理】
考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。
【操作步骤】
1、标准曲线的制备：
按下表操作，在试管中分别加入0、20、40、80、100微克蛋白标准溶液，用水补足到100微升，加入3ml的染色液，混匀后室温放置15分钟。
编 号
1
2
3
4
5
6
蛋白标准（ml）
0
蒸馏水（ml）
0
染色液（ml）
3
3
3
3
3
3
在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。
2、血清蛋白质测定
稀释血清（或其它蛋白样品溶液），准确吸取血清，置入50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。
再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作。
混匀后室温放置15分钟，在595nm波长比色，计算蛋白质浓度。
试剂（毫升）
1（空白管）
2（标准管）
3（样品管）
蒸 馏 水
—
—
蛋白质标准
—
—
稀释血清
—
—
染 色 液
3
3
3
【计 算】
每100毫升血清中蛋白质的含量（g％）＝
【试 剂】
1、考马氏亮蓝G－250染色液：
称取100mg考马氏亮蓝G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100毫升85％的磷酸，加入稀释到1升。
2、蛋白标准（ml）
准确称取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装，－20℃冰箱保存。
【注意事项】
1、常用试剂的干扰：
有些常用试剂在测定中会受到不同程度的干扰。
Tris、巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢剂有较少影响，而1％SDS、1％TritonX-100及1％Hemosol的干扰严重。
2、显色结果受时间与温度影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行。
3、考马氏亮蓝G－250染色能力很强，特别要注意比色杯的清洗。
颜色的吸附对本次测定影响很大。
可将测量杯在LHCl中浸泡数小时，再冲洗干净即可。
三、紫外分光光度法
紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是将蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作很简便，而且样品可以回收。
【原 理】蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。
另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。
所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。
【操 作】将待测蛋白质溶液适当稀释K倍，在紫外分光度计中分别测定样品在10mm光径石英比色皿中，分别在280nm及260nm两种波长下的吸光度值A280和A260。
【计 算】1、当蛋白样品的吸光收比值A280／A260约为，可用下面的公试进行计算：
蛋白质浓度（mg/ml）＝（－）×K（稀释倍数）
2、也可以先计算出A280／A260的比值后从下表中查出校正因子“F”值，由下面的经验公式计算出溶液的蛋白质浓度。
同时从表中还可以查出样品中混杂的核酸的百分含量：
蛋白质浓度（mg/ml）＝F×A280×K
A280/A260
核酸（%）
F
A280/A260
核酸（%）
F
注：
一般纯净蛋白质的光吸收比值A280/A260约为，而核酸A280/A260的比值约为。
【方法评价】操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。
但核酸含量小于20％或溶液混浊、则测定结果误差较大。
在使用上表和公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在280nm及260nm处的光吸收值也不尽相同，故计算结果有一定误差。
四、双缩脲法
【原 理】
利用半饱和硫酸铵或％硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。
盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质—酶、蛋白激素等的分离和纯化。
蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。
但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物
以及分子内有
—CH2—NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。
本实验用％硫酸钠—亚硫酸钠溶液稀释血清，取出一部分用双缩脲反应测定蛋白质的含量，剩余部分则用滤纸过滤，使析出的球蛋白与白蛋白分离，取出滤液用同一反应测定白蛋白的含量。
总蛋白与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。
白蛋白与球蛋白之比即所谓的白／球比值。
【操 作】
1、取中试管4支，分别标以“1”、“2”、“3”、“4”，吸取％硫酸钠—亚硫酸钠1ml，置“1”管中备用。
2、吸取血清于另一试管中，加％硫酸钠一亚硫酸钠，用拇指压住管口倒转混合5～6次，放置约15秒，用1ml刻度管吸取1ml置于管“4”中（总蛋白测定管）。
3、将剩余的血清混悬液（如滤液不清，可重复过滤，直至澄清为止），用另一支1ml刻度吸管取此液1ml，置于管“3”（白蛋白测定管）。
4、另用一支1ml刻度吸管吸取标准血清1ml，置管“2”中（标准管）。
5、于上述4支试管中分别加入双缩脲试剂4ml，混匀。
6、在室温下放置10分钟后，以管“1”（空白管）调零，在540nm的波长下进行比色，分别记录“2”、“3”、“4”管的光密读数
【计 算】
血清球蛋白含量（克／100ml）＝总蛋白含量—白蛋白含量
白：
球比值＝白蛋白含量／球蛋白含量。
【临床意义】
正常人每100ml血清中含蛋白质6～8克，平均7克左右，白／球比为～:
1。
长期营养不良，肝脏疾病，慢性肾炎时，总蛋白含量降低；大量失水（如呕吐、腹泻）时则升高。
肝脏疾病、慢性肾炎以及慢性传染病有大量抗体生成时，白／球比值变小，甚至倒置。
【试剂与器材】
（一）器材
1、中试管6支。
2、刻度吸管：
、5ml、10ml、1ml。
3、玻璃漏斗。
4、快速滤纸。
5、分光光度计。
（二）试剂
1、％硫酸钠—亚硫酸钠溶液：
取浓硫酸2ml加到900ml蒸馏水中，将此含酸蒸馏水加于盛有无水硫酸钠208克及无水亚硫酸钠70克，的烧杯中，边加边搅拌，待液解后全部移至1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。
取此溶液1ml，加蒸馏水24ml，检查其pH，应为7或略高于7，本试剂应贮于25℃温箱中。
2、双缩脲试剂：
称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）克及石酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）6克，分别用适量蒸馏水溶解，混合后加入10％NaOH溶液300ml，最后加蒸馏水至1000ml。
3、标准血清：
取经凯氏定氮标定后的血清用15％的NaCl溶液稀释25倍，贮于冰箱中备用。
【注意事项】
（一）硫酸钠的溶解度与温度有关，温度低于30℃易结晶析出，故室温较低时应在37℃水浴或恒温箱进行保温。
（二）血清样品必须新鲜，如有细菌污染或溶血，则不能得到正确的结果。
（三）含脂类较多的血清，可用乙醚3ml抽提一次后再进行测定。
五、Folin－酚试剂法（又名Lowry）法
目前实验室较多用用Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。
【原 理】
蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。
【操 作】
1、标准曲线的制备：
按下表操作，在试管中分别加入0、、、、、1ml蛋白标准溶液，用生理盐水补足到1ml。
加入5ml的碱性酮试剂，混匀后室温放置20分钟后，再加入酚试剂混匀。
编 号
1
2
3
4
5
6
蛋白标准（ml）
0
%NaCl（ml）
0
碱性酮试剂（ml）
5
5
5
5
5
5
混匀后室温（25℃）放置20分钟
酚试剂（ml）
30分钟后，以第1管为空白，在650nm波长比色，读出吸光度，以各客的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。
2、血清蛋白质测定。
稀释血清（或其它蛋白样品浓度）：
准确吸取血清，置于50ml容量瓶中，用生理盐水释释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。
再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作：
编 号
测定管
标准管
空白管
稀释标本（ml）
—
—
稀释标准液（ml）
—
—
%NaCl（ml）
—
—
碱性酮液（ml）
混匀后于室温放置20分钟
酚试剂（ml）
混匀各管，30分钟后，在波长650nm比色，读取吸光度。
【计 算】
1、以测定管读数查找标准曲线求得血清蛋白含量。
2、无标准曲线时，可以与测定管同样操作的标准管按下式计算蛋白含量：
血清蛋白含量（g%）＝
【试剂配制】
1、碱性酮溶液：
甲液：
Na2CO32g溶于LNaOH100ml溶液中。
乙液：
CuSO4•5H2O克溶于1％酒石酸钾100ml中。
取甲液50ml，乙液1ml混合。
此液只能临用前配制。
2、酚试剂：
取Na2WO4•2H2O100g和Na2MoO3•2H2O25g，溶于蒸馏水700ml中，再加85％H3PO4，50ml和HCl（浓）100ml，将上物混合后，置1500ml园底烧瓶中温和地回流10小时再加硫酸锂（Ll2SO2•H2O）150g，水50ml及溴水数滴，继续沸腾15分钟以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml，然后过滤，溶液应呈黄色（如带绿色者不能用），置于棕色瓶中保存。
使用标准NaOH滴定，以酚酞为指示液，而后稀释约一倍，使最后浓度为lN。
3、蛋白标准液（ml）
准确称取10mg牛血清蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度。
溶后分装，放于－20℃冰箱保存。
【注意事项】
1、Tris缓冲液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、丙酮……等均会干扰Folin-酚反应。
2、当酚试剂加入后，应迅速摇匀（加—管摇一管）以免出现浑浊。
3、由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红外光区呈现较宽吸收峰区。
不同实验室选用不同波长，有选用500或540nm，有选用640nm，700或750nm。
选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选用波长650nm。
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