大肠杆菌内源过氧化氢检测方法的建立.docx
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大肠杆菌内源过氧化氢检测方法的建立
论文题目：
大肠杆菌内源过氧化氢检测方法的建立
学院及专业：
食品与生物工程学院食科
摘 要
本实验旨在通过物理、化学方法的对比及探索改进，找出一种检测细菌內源过氧化氢的模型方法。
本实验以大肠杆菌突变体为研究对象，首先以30%的H2O2为研究对象，确定其原液的浓度，然后通过辣根过氧化物酶—酚红法、荧光法、硫酸钛法三种不同方法绘制出不同的标准曲线，最后根据不同的标准曲线计算出20个大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株在同一生长时期时內源过氧化氢的释放量。
结果显示：
30%的H2O2原液浓度为6.9M，三种检测方法绘制出来的标准曲线的线性相关系数分别是0.9963、0.9936、0.997，根据辣根过氧化物酶—酚红法和荧光法不同的线性关系计算出来不同菌株H2O2的释放量都有明显的差异，范围在1μM～10μM之间。
硫酸钛法的检测区间在10μM～500μM之间，明显检测不到大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株中內源过氧化氢的释放量。
通过分析对比发现三种方法中辣根过氧化物酶—酚红法和荧光法都可以检测到大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株中內源过氧化氢的释放量，硫酸钛法检测不到，但是辣根过氧化物酶—酚红法比较繁琐且需要严格控制反应条件，而荧光法的灵敏度比较高，操作也比较简单方便。
关键词：
內源过氧化氢，检测方法，大肠杆菌，突变体
Subject:
MeasureassaysestablishmentofendogenoushydrogenperoxideinEscherichiacoli
CollegeandSpecialty:
CollegeofFood&Bioengineering
FoodScience&Engineering
ABSTRACT
Thisexperimentisforthepurposeofdiscoveringonedetectionmodelmethodtodetectendogenoushydrogenperoxidebyphysical,chemistrymethodcontrastandtheexplorationimprovement.
ThisexperimenttakestheEscherichiacolimutantsastheobjectsofstudy,firsttake30%H2O2astheobjectofstudyanddeterminethedensityofitsoriginalfluid,thenthroughthehorseradishperoxideenzyme-phenolredmethod,thefluorescencemethod,thetitaniumsulfatemethodthreedifferentmethodsdrawsupthedifferentstandardcurve,FinallyaccordingtodifferentstandardcurvetofigureoutendogenoushydrogenperoxidereleasequantityofthetwentyEscherichiacolioxidationresistancegenemutantstrainsintheidenticalgrowthperiod.
Theresultsshowedthat30%H2O2originalfluiddensityis6.9M,usethreedetectionmethodstodrawupthestandardcurves,andwhoselinearcorrelationcoefficientrespectivelyare0.9963,0.9936,0.997,calculatesthattheH2O2releasequantityofdifferentstrainshavetheobviousdifferenceaccordingtodifferentlinearrelationshipofthehorseradishperoxideenzyme-phenolredmethodandthefluorescencemethod,thescopeisbetween1μM~10μM.ThedetectionintervalofTitaniumsulfatemethodisbetween10μM~500μM,soobviouslywecannotexaminetheendogenoushydrogenperoxidereleasequantityinEscherichiacolioxidationresistancegenemutantstrain.
Throughtheanalysiscontrast,wediscoverthatthehorseradishperoxideenzyme-phenolredmethodandthefluorescencemethodmayexaminetheendogenoushydrogenperoxidereleasequantityintheescherichiacolioxidationresistancegenemutantstraininthisthreemethods,thetitaniumsulfatemethodcannotexaminethat,butthehorseradishperoxideenzyme-phenolredmethodisquitetrivalandneedsthestrictcontrolcondition,whilethefluorescencemethodhasquitehighsensitivity,andtheoperationisalsoquitesimpleandconvenient.
Keywords：
endogenoushydrogenperoxide,detectionmethod,escherichiacoli,mutantstrain
第1章文献综述
1.1过氧化氢
过氧化氢是1818年由法国化学家J．H．Thenard发现，又名双氧水，分子式为H202，为无色、无气味的液体，具有苦涩味，易分解为水和氧气。
过氧化氢是一种强氧化剂，它作为一种重要的化工产品具有消毒、杀菌、漂白等功能，在纺织品、纸浆漂白、化学产品的合成以及环保领域和医疗领域中广泛应用。
过氧化氢在自然界中也广泛存在。
近年来，天然水（地表水、大气水滴及降水等）中的活性物质（单重态氧、羟基自由基、过氧化物、超氧化物等）引起了人们极大的注意。
这些活性物质与天然水中发生的氧化还原反应有密切关系，是影响化学品在水环境中的迁移、转化、归宿及生态效应的重要因素。
过氧化氢是一种重要的痕量气体并且在对流层中扮演了一个很重要的角色。
过氧化氢还间接的影响了酸雨的形成，它对大气的质量是非常有害的。
吸入过量过氧化氢可使人中毒，空气中过氧化氢含量不得超过1.4mg／m3。
过氧化氢在生物体中极为重要。
过氧化氢在植物体中广泛存在，植物细胞可以通过多条途径产生H202，H202已经被认为是植物中的一种信号分子，因为过氧化氢是许多酶催化反应的产物，通过测定过氧化氢，可以间接测定许多底物或酶的含量。
过氧化氢是生物体内主要的活性氧之一，它虽不是自由基，但分子中含有较易断裂的过氧键，常被诱发均裂，产生羟自由基（OH•），它是最活泼的活性氧，又称之为侵袭性自由基[1]。
过氧化氢是生物体内的一种代谢产物，超量过氧化氢能够对生物系统产生有害作用，它还与中神经病理学中的枢神经系统疾病有关。
可见，过氧化氢在环境中广泛存在，过氧化氢的测定在食品检验、药物分析和环境监测等方面都有很重要的意义。
迄今，国内外学者对天然水中过氧化氢的含量、分布、生成机理及光化学反应等方面进行了大量的研究。
如何测定过氧化氢也一直以来是科研工作者研究的热点。
1.2过氧化氢的应用
过氧化氢目前广泛应用于纺织印染、化工、造纸、环境保护和电子工业等领域，近年来，其在环境领域和食品安全领域的作用显得尤其突出。
1.2.1环境领域
目前，水资源的有效利用为环境工作者研究的重点。
工业上高浓度难降解有毒有害有机废水的有效处理为国内外环境工作者和安全工作者的难题，而能产生强氧化性的羟基自由基，可以很方便地采用亚铁和过氧化氢组成的芬顿试剂产生。
因此，过氧化氢能处理多种无机和有机的有毒物质，可以治理各种高浓度难降解的工业废水，治理效果十分明显。
过氧化氢氧化和芬顿试剂由于其无二次污染，备受环境工作者和安全工作者的厚爱。
国外发达国家已经将过氧化氢用于环境保护，应用规模呈增长趋势，而我国由于成本问题在这方面的应用较少。
但是其有效应用与突出效果还是备受环境工作者和安全工作者的推崇。
1.2.2食品行业
过氧化氢在食品包装、食品纤维等方面用作消毒杀菌剂[2]，产生大量活泼的羟基自由基，具有极强的氧化性，可将很多有机污染物最终氧化分解为水和二氧化碳。
过氧化氢在食品行业具有较为广泛的应用，但是，其残留问题是安全工作者要首先考虑的问题。
为有效降低安全风险，体现“科技以人为本”的现代化理念，必须对过氧化氢的浓度进行有效监测。
1.2.3纺织行业
纺织工业是我国过氧化氢的最大用户，主要用于各种纺织物和针织物的漂白[3]。
近几年虽因纺织工业结构调整和市场疲软，对过氧化氢需求量的增长缓慢。
但随纺织企业生产技术的不断提高和纯棉织品受到人们青睐，预计今后几年国内纺织行业对过氧化氢的需求还会增加。
1.2.4其他行业
过氧化氢在化工行业上的应用是相当广泛的。
它是合成许多无机、有机过氧化物的主要原料[4]。
近几年国内重视精细化工产品的生产，积极开发包括过氧化氢下游产品在内的新产品，使过氧化氢在化工行业上的消费呈上升趋势。
此外，过氧化氢还广泛应用于造纸业、电子行业等；在冶金行业的电镀液净化除铁、毛皮、烟草漂白，火箭、鱼雷等军工用的化学推进剂、化妆品行业[5]等也都有一定应用。
因此，过氧化氢可以说是与人们生活、安全健康、环境污染、社会进步等休戚相关，其准确检测的有效性和必要性日益提上日程。
1.3过氧化氢的测定方法
1.3.1常规滴定法
最早用于过氧化氢测定的常规滴定法是根据过氧化氢具有的很强的氧化还原性而形成的一种最普遍的常规分析法。
如KMm04法，该法是在室温下的稀H2S04介质中，以MnS04为催化剂，用KdVm04标准溶液直接滴定H202：
该方法利用KMn04自身指示剂来确定滴定的终点，再根据滴定耗用的标准液的体积求出H202含量。
滴定法操作简单，不需要昂贵的仪器，但是此方法测定过程比较费时，终点颜色变化不明显，干扰因素较多，许多具有氧化还原活性的物质都有可能对测定结果产生干扰。
并且此方法的准确度和灵敏度不高，达不到许多微量、痕量测定的要求，不能连续化、微量化。
1.3.2分光光度法
分光光度法可以分为三类：
①碘离子的氧化；②金属离子的氧化；③有机物的显色反应[6]。
分光光度法的灵敏度取决于产生吸光物质的摩尔吸收系数，选择能产生高摩尔吸收系数的物质能够使其灵敏度大大提高。
分光光度法的灵敏度、准确度要优于传统的滴定法，但是任何一种分光光度法都需要加入一种显色剂，并使H202在合适的条件下与之发生发应，从而确定的H202的含量。
因此方法较为复杂，而且其它过氧化物往往会对其测定产生干扰，使这种方法不适用于许多复杂的测量体系。
1.3.3电化学方法
电化学方法[7-10]主要包括极谱法、电流法以及恒电位法。
近年来，许多科学工作者利用各种修饰电极对过氧化氢进行了测定。
电化学方法具有很高的灵敏度，但是它一般要利用酶或者模拟酶等试剂作为反应试剂，这使它的稳定性降低，并且大大增加了检测的成本。
很多修饰电极的制作方法也较为复杂，这使电化学方法具有了一定的局限性。
1.3.4荧光法
荧光法的一般原理是在过氧化酶作用下，基质与H202反应产生荧光物质，根据荧光强度与H202成正比的关系确定H202浓度。
荧光法[11,12]的灵敏度高，由于一般采用酶作为反应试剂使该方法具有比较好的选择性，但是生物酶价格较高，且不易长期保存，在使用过程中的失活或活性降低将会给实际分析带来诸多不便。
虽然已经可以在某些情况下用过氧化物模拟酶代替生物酶，但是也存在过氧化物干扰等缺点。
1.3.5其它方法
除了上述几种方法外，较常用的还有室温磷光分析法[13,14]、化学发光法[14-16]、电致化学发光法[17]、色谱法[18,19]等几种方法。
其中室温磷光分析较其它方法有它自己独特的优越性：
（1）灵敏度高
（2）大大降低成本和简化操作步骤（3）分析曲线线性范围宽（4）选择性好（5）检测限低（6）可实现连续操作，易于实现自动化。
化学发光法具有较高的灵敏度、可控的发射速率以及较宽的动力学范围，但是这种方法同样需要与之反应的一个发光试剂或是催化剂等使其产生发光信号。
电致化学发光法也有其独特的特点：
（1）分析的选择性高
（2）具有极高的灵敏度及很宽的动力学响应范围；（3）反应迅速（4）扩大了化学发光法可检测物质的范围；（5）易于与其他技术联用。
色谱法也能用于过氧化氢的分析测定。
该方法具有准确度高，易操作，实用性强等优点。
色谱法能够对不同的过氧化物进行分离和定量，与其它方法相比具有一定的优越性。
但是色谱法对仪器的要求比较高，所需要的仪器昂贵，对流动相的纯度要求高。
目前，这种方法用于过氧化氢的分析还有待进一步研究和改进。
1.4过氧化氢检测方法的发展趋势
目前，对过氧化氢的检测主要就是以上的几种方法，每种方法都有其有缺点。
电化学分析法具有很好的灵敏度，但是对于干扰的消除和提高方法的稳定性和重现性仍然是今后研究的重点[20]；分光光度法的所需的设备比较简单，但是要提高其灵敏度就还需要寻找具有高摩尔吸收系数的物质，特别是有机显色剂；荧光光度法和化学发光法灵敏度高，可以很容易的结合流动注射技术使其实现连续操作和实时监测，提高检测速度，还可以利用酶提高其方法的选择性[21]，但是利用酶反应同时也带来了一些问题，比如说酶试剂价格昂贵，不利于长期保存等，发现新的高效的发光试剂和荧光试剂用于过氧化氢的测量仍然是科学工作者的研究重点之一。
由于具有较高的灵敏度和容易实现在线分析等优点，电化学方法和化学发光法的应用比较广泛。
此外，还有待发现新的、灵敏度高、选择性好的测定过氧化氢的方法。
1.5过氧化氢测定方法优缺点分析
测定方法
优点
缺点
常规滴定法
电化学分析方法
分光光度法
化学发光法
荧光光度法
色谱法
方法简单
方法简单干扰因素多
方法简单，选择性较好
灵敏度高，pH选择范围宽
灵敏度高需要昂贵的设备
灵敏度高，可实现连续自动操作
干扰因素多
装置较复杂
灵敏度干扰因素多
需要昂贵的设备
操作复杂，干扰因素多
需要昂贵的设备，操作复杂
目前，国内外对于液相过氧化氢的测定技术总体来说已相对成熟，然而，随着科学的不断进步，社会需求和发展，科研人员的不断尝试、探索和努力，新的测试方法也将相继面世。
因此，要结合实验条件，根据所需的测试要求和实际可操作条件，选择合适的测试方法至关重要。
分光光度法由于方法简单，不需要复杂的设备，选择性较好，应用非常广泛；在实验技术条件普遍不高的条件下，通过对常规方法的改进，提高其灵敏度和效率，是一种简单又有效的方法。
本实验以大肠杆菌为研究对象，通过对其內源过氧化氢含量的检测，找出检测內源过氧化氢的简单有效的模型方法[22]。
1.6大肠杆菌的特点
大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。
周身鞭毛，能运动，无芽孢。
能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。
正常栖居条件下不致病。
但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症[23]。
在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。
兼性厌氧菌。
在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。
若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。
因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。
除某些菌型能引起腹泻外，一般不致病，能合成维生素B和K，对人体有益。
大肠杆菌是现代生物学中研究最多的一种细菌，作为一种模式生物，其基因组序列已全部测出，遗传背景清楚,培养条件简单,表达高效，用分子生物学方法在大肠杆菌得出的结论可用于其它生物的研究。
此外，在生物工程中，大肠杆菌被广泛用于基因复制和表达，经常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究。
大肠杆菌的一个株是具有某些能和其它柱区分开的特征的族群。
不同的大肠杆菌菌株生活在不同动物中，因此我们可以通过其判断粪便来源于人或者鸟类等。
通过突变，新的大肠杆菌菌株不断出现，其中一些可能对宿主动物造成损害。
尽管对于大多数健康成年人，这样的菌株可能只引起一场腹泻，或者根本没有症状，但对于幼儿、大病初愈的人或者进行某些药物治疗的人来说，陌生的菌株可能引起严重疾病甚至死亡[24]。
大肠杆菌O157:
H7就是一个毒性很强的菌株。
大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢。
主要生活在大肠内。
大肠杆菌—纳米级图像大肠杆菌平板培养基
（1）大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。
（2）大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
（3）人体与大肠杆菌的关系：
在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可认为是寄生。
（4）培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。
（5）大肠杆菌在生物技术中的应用：
大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视。
目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。
（6）大肠杆菌在生态系统中的地位，假如它生活在大肠内，属于消费者，假如生活在体外则属于分解者。
1.6.1致病性
当前大肠杆菌病带来的损失越来越大，其难于治愈、死亡率高、极易复发等临床特点，临床通常多考虑的是抗菌素耐药、继发或并发感染、药物靶部位等因素，其实还忽视了一个引起包心包肝、气囊炎、败血症、肠炎及发热等常见临床病症的另一个重要元凶——大肠杆菌死亡溶解释放的内毒素。
1.6.2致病物质
大肠杆菌具有很多毒力因子，包括内毒素，荚膜，〣型分泌系统，黏附素和外毒素等。
黏附素：
能使细菌紧密黏着在泌尿道和肠道的细胞上，避免因排尿时尿液的冲刷和肠道的蠕动作用而被排除。
外毒素:
大肠杆菌能产多种的外毒素，包括：
志贺毒素〡和〢；耐热肠毒素〡和〢；不耐热肠毒素〡和〢。
1.6.3传播途径
该种疾病可通过饮用受污染的水或进食未熟透的食物（特别是免治牛肉、汉堡扒及烤牛肉）而感染。
饮用或进食未经消毒的奶类、芝士、蔬菜、果汁及乳酪而染病的个案亦有发现。
此外，若个人卫生欠佳，亦可能会通过人传人的途径，或经进食受粪便污染的食物而感染该种病菌。
潜伏期通常为3至4日，但亦会长达9日。
1.6.4预防方法
1、保持地方及厨房器皿清洁，并把垃圾妥为弃置。
2、保持双手清洁，经常修剪指甲。
3、进食或处理食物前，应用肥皂及清水洗净双手，如厕或更换尿片后亦应洗手。
4、食水应采用自来水，并最好煮沸后才饮用。
1.7在生物技术中的应用
大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系，处于生物安全考虑，生物工程用的菌株是在不断筛选后被挑选出的菌株。
这些菌株由于失去的细胞壁的重要组分，所以在自然条件下已无法生长。
甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。
这样，即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。
此外，生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如β半乳糖甘酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆实验。
真核基因在大肠杆菌中表达,必须有合适的表达载体（Vector）,常用载体:
pBV220,pET系统目的基因在大肠杆菌中表达的情况:
大肠杆菌更适合原核基因的表达,外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的,而单位体积产量与细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相相关.细胞浓度与生长速率,外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在动态平衡,单个细胞的产量又与外源基因拷贝数,基因表达效率,表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关[25-27]例如，科学家们把人的胰岛素基因送到大肠杆菌的细胞里，让胰岛素基因和大肠杆菌的遗传物质相结合。
人的胰岛素基因在大肠杆菌的细胞里指挥着大肠杆菌生产出了人的胰岛素。
并随着它的繁殖，胰岛素基因也一代代的传了下去，后代的大肠杆菌也能生产胰岛素了。
这种带上了人工给予的新的遗传性状的细菌，被称为基因工程菌。
第2章硫酸钛法测大肠杆菌內源过氧化氢
2.1材料和方法
2.1.1试剂
0.1%的硫酸钛（用20%硫酸溶解）
注：
称取0.1克硫酸钛固体加入到100ml浓度为20%的硫酸溶液中即为0.1%的硫酸钛溶液。
2.1.2仪器
离心机，可见分光光度计，比色皿。
2.1.3实验方法
2.1.3.1确定过氧化氢原液的浓度
用紫外分光光度计240nm检测出原液H2O2的含量。
a.过氧化氢原液分别稀释100,500,800,1000倍。
b.在紫外分光光度计A240波长下分别测定上述各浓度梯度的吸光值（表2-1）。
c.由公式A=c.ε.L算得过氧化氢原液的浓度（ε=43.6／M.cmL=1cm）。
2.1.3.2硫酸钛法过氧化氢标准曲线的制作
（1）确定上下限
将原液按梯度稀释至100mM，10mM，1mM，0.1mM，0.01mM，0.001mM，取0.9mL样液与0.1mL0．1％（w／v）硫酸钛溶液混匀后，在405nm波长处测定光吸收值（OD405），找出上下限（如表2-2）。
（2）制作标准曲线
在上下限之间再稀释几段梯度，用同样的方法在可见分光光度计A405波长下测出吸光值（如表2-3）
2.2实验结果
表2-1240nm紫外下测定原液不同浓度梯度的吸光值
Table2-1Theabsorbanceofdifferentconcentrationgradientstocksolutionat240nmultraviolet
稀释倍数
一组
二组
三组
平均值
1:
100
1:
500
1:
800
1:
1000
2.480
0.591
0.357
0.294
2.566
0.627
0.377
0.306
2.510
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