凯氏定氮法.docx

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凯氏定氮法

凯氏定氮法

中文名称：

凯氏定氮法

英文名称：

Kjeldahldetermination

定义：

测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。

即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。

由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

凯氏定氮法

凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。

即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。

由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

原理

　　蛋白质是含氮的有机化合物。

食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。

含氮量*6.25=蛋白含量

　　.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4

凯氏定氮法

反应式为：

　　2NH2+H2SO4+2H=（NH4）2SO4（其中CuSO4做催化剂）

　　2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中

　　反应式为:

　　（NH4）2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4

　　2NH3+4H3BO3=（NH4）2B4O7+5H2O

　　3.用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量

　　反应式为：

　　（NH4）2B4O7+H2SO4+5H2O=（NH4）2SO4+4H3BO3

　　（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

试剂

　　所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。

　　2.1硫酸铜。

　　2.2硫酸钾。

　　2.3硫酸。

　　2.42%硼酸溶液。

　　2.5混合指示液：

1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。

也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

　　2.640%氢氧化钠溶液。

　　2.70.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。

仪器

　　定氮蒸馏装置：

如图所示。

凯氏定氮法仪器

　　1.安全管

　　2.导管

　　3.汽水分离管

　　4.样品入口

　　5.塞子

　　6.冷凝管

　　7.吸收瓶

　　8.隔热液套

　　9.反应管

　　10.蒸汽发生瓶

操作方法

　　1、样品处理：

精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。

取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。

取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。

但是此法比较危险，不易在实验室演示，现在大多数实验室有消煮仪一次可以进行多个（一次可以消煮16个样品）样品处理，并有通风橱进行通风，温度可以自己设定，更加安全和可操作性，因此逐步成为主要的凯氏定氮法的首选处理方法。

　　一般消解温度都设在240度及240度以上，如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解。

　　2、按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

　　3、向接收瓶内加入10ml2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。

将10ml40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，不能立即将玻璃盖塞紧，这样易使玻璃塞粘在进样口，应先用蒸馏水冲洗然后再盖，并加水于小玻璃杯以防漏气。

夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。

移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。

取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。

　　同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。

计算

　　X=（（V1-V2）*N*0.014）/（m*（10/100））*F*100%　

　　X：

样品中蛋白质的百分含量，g；

　　V1：

样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

　　V2：

试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；

　　N：

硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

　　0.014：

1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

　　m：

样品的质量（体积），g（ml）；

　　F：

氮换算为蛋白质的系数。

蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。

注意事项

（1）样品应是均匀的。

固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。

万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

　　（3）硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。

　　（4）在整个消化过程中，不要用强火。

保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

　　（5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。

因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。

　　（6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

　　（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。

如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

　　（8）氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。

　　（9）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。

　　（10）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。

　　（11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。

有时铜离子与氨作用，生成深l蓝色的结合物[Cu（NH3）4]2+

　　（12）这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。

只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。