血红蛋白电泳说明书new剖析.docx
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血红蛋白电泳说明书new剖析
碱性血红蛋白电泳说明书
意大利Interlab公司
ViaRinaManti,26-00155Roma
+39-06-227.54.350
用途：
此碱性血红蛋白电泳试剂的包装是用于696PC系统的电泳试剂，此试剂可对人类的正常血红蛋白如H-A,H-A2和H-F通过琼脂糖凝胶的方法进行定性和定量的分离，以及可检测出异常的血红蛋白如S,C,D,E等
概述
血红蛋白合成受遗传基因的控制，并且异常血红蛋白的出现会引起红细胞形态和功能的变性。
血红蛋白是由珠蛋白肽链和含有铁的原卟啉组成。
正常的血红蛋白结构相似，分子量在67000道尔顿左右，由两对珠蛋白肽链和1个亚铁血红素组成。
HbA:
多肽链2和2
HbA2:
多肽链2和2
HbF:
多肽链2和2
正常成人血红蛋白中，HbA占总蛋白浓度的98％，HbA2和HbF相对数量少些。
珠蛋白肽链中某一氨基酸被其他氨基酸所取代会导致Hb变异即可出现血红蛋白病。
目前可鉴定出600多种变异的血红蛋白即结构变异的血红蛋白（S、C、E、D、G、H、I、Lepore等）。
在异常的血红蛋白中约有60％血红蛋白会有电荷差异，这样可用电泳的方法对这些血红蛋白进行鉴定。
HbC和HbS是两种常见的变异的血红蛋白。
HbA伴随有S,C,E等变异的血红蛋白出现称为杂合子血红蛋白病如AS或AC等。
只有一种变异的血红蛋白的出现称其为纯合子血红蛋白病如HbS病、HbC病等。
这些变异的血红蛋白一般可导致地中海贫血。
纯合子型血红蛋白病可引起一系列的临床症状。
碱性血红蛋白电泳主要用于分离正常血红蛋白如HbA、HbA2和异常或变异的血红蛋白（HbS、“快速”血红蛋白和D、C、E）。
然而，在碱性Hb电泳中，一些正常的和异常的血红蛋白有相同的迁移率即这些蛋白质在同一位点（如HbA2与HbC，HbS与HbD）
琼脂糖酸性血红蛋白电泳可确定HbS或HbC。
原理：
根据蛋白质亚结构的电荷分布，在一定的PH值条件下，蛋白质分子可表现出有极性或非极性。
在琼脂糖凝胶电泳中，蛋白质分子根据分子量和等电点的不同而被分离出来。
电泳结束后，用氨基黑染料染色，可看到电泳结果。
警告:
此包装仅用于体外诊断
操作仪器
Interlab碱性血红蛋白电泳的试剂包装，货号为SRE604K在Microtech696PC仪器下可实现全自动分析。
试剂：
请参照使用者手册和手册中的图表来进行试验前的准备
试剂的保存：
所有的试剂储存在室温15－30°C.在有效期的范围内所有的试剂都是稳定的。
有效期过后，不宜再使用此试剂。
1.琼脂糖凝胶片
成分：
琼脂糖、巴比妥缓冲液、防腐剂、稳定剂
应用前的准备：
此胶片可直接使用。
存储和稳定性：
储存在室温15到30C，胶片在有效期内稳定。
有效期过后，勿使用此胶片
勿将此胶片冰冻保存
注意：
胶片必须保持水平放置
试剂变质的标志：
－在胶片包装里面有液体出现
－胶片的厚度不均
－有细菌生长
注：
胶片表面吸水后出现波纹状为正常现象，可正常使用。
R:
22
吞咽有害
R:
36/38
损坏皮肤和眼睛
S:
26
一旦眼睛接触到，需立刻用大量清水清洗
S:
28
一旦皮肤接触到，需立刻用大量清水清洗
S:
46
如果吞咽，需立刻找医生就诊
2、酸蓝染料
成分：
醋酸溶液中含有奈酚蓝浓缩液.
应用前的准备：
此染液直接使用
存储和稳定性：
储存在室温15到30C。
浓缩液在有效期内稳定；工作液（稀释后的染液）储存时瓶盖要盖紧并在室温15到30C条件下稳定6个月。
工作液用过10次染色循环后即染过10张胶片后应不能再使用。
厂家建议，每五张胶片更换染液，保证无沉淀并染色效果良好。
试剂变性标志：
无
R:
10
易燃
R:
35
引起严重烧伤
R:
36/37/38
对眼睛、呼吸系统及皮肤有刺激作用
S:
23
勿呼吸挥发气体
S:
26
一旦眼睛接触到，立刻用大量清水清洗
S:
37/39
应戴保护手套及防护眼镜
3.含有缓冲液的海绵
缓冲液成分:
含有巴比妥的碱性缓冲液及防腐剂
使用前的准备：
直接使用
存储和稳定性：
储存在室温15°到30°C，缓冲绵条在有效期内稳定。
有效期过后，勿使用。
缓冲液：
巴比妥缓冲液（PH值为碱性）、防腐剂
试剂变性标志：
如果试剂包装已被打开或缓冲绵条是干燥的则勿使用。
绵条有黑色或黄色污点出现不会影响实验结果。
警告：
R:
25
吞咽有毒性
R:
36/38
对皮肤及眼镜有刺激性
R:
52
对水生生物有害
S:
26
一旦眼睛接触到，需立刻用大量清水清洗
S:
46
如果吞咽，需找医生就诊
4、点样器清洗液
成分：
表面活性剂、防腐剂
应用前的准备：
直接使用
存储和稳定性：
储存在室温15到30C。
有效期内稳定。
试剂变性标志：
有云雾状沉淀出现
5、一次性载样盘
成分：
带有微孔的塑料盘
应用前的准备：
直接使用
存储和稳定性：
储存在室温15到30C。
6、吸水纸
成分：
薄吸水纸用于吸收凝胶片中多余的水分
应用前的准备：
直接使用
存储和稳定性：
储存在室温15到30C。
有效期内稳定。
7、脱色液（货号.:
SRE201M;不包括在此试剂盒中）
成分：
柠檬酸水溶液
应用前的准备：
此包装为浓缩液，应用前必须以1:
1000比例用蒸馏水溶解
存储和稳定性：
储存在室温15到30C。
浓缩液在有效期内稳定；工作液（稀释后的染液）于室温稳定2星期。
试剂变性标志：
有云雾状及黑色氧化斑点出现
R:
36/38
对眼睛、皮肤有刺激作用
R：
41
对眼睛有严重损坏
S:
37/39
应戴保护手套及防护眼镜
8、裂解液：
成分：
含有防腐剂的EDTA水溶液
应用前的准备：
此裂解液直接使用
试剂变质的标志：
此溶液必须是澄清的
R:
22勿吞咽
S:
46如果吞咽，请立刻找医生就医
试剂包装的组成
货号：
SRE604K
用于696PC系统130人份
货号
产品描述
数量
SFE166M
Agaroseplates
琼脂糖胶片
10
SCE149M
Sponges
海绵条
10
SRE600A
AcidBluestain（500ml）
酸蓝染液（500ml）
1
SRE150M
Washingapplicators（100ml）
洗液（100ml）
1
SCE605M
Samplewellsplates（10）
载样盘（10）
1
SCE602A
Blotters（10）
吸水纸（10）
1
SRE140B
Lysingreagent（60ml）
裂解液
1
此包装不含有的试剂但额外需要的试剂
货号
产品描述
数量
SRE201A
脱色液（100ml）
1
Ø100ml、1000ml加样枪
Ø蒸馏水
Ø0.90%NaCl
ØInterlab血红蛋白质控品SCE129E和或SCE130E
Ø离心机
Ø10ml移液器
样本要求
新鲜的肝素或EDTA抗凝的全血
存储和稳定性：
全血样本可储存在2-6°C保存1周
试验过程
样本的制备：
1.RBC洗涤：
1）用3000转速的离心机离心全血5分钟
2）弃去上层血浆
3）加入约2ml的生理盐水，上下颠倒混匀5次
4）用3000转速的离心机离心5分钟并弃去浮在表面上的悬浮液
5）重复2）和3）步骤，直到上层液无色透明
说明：
若无法使用全管血进行样本制备，则取200μL血细胞，加2mL生理盐水，依序3）4）5）步骤进行。
RBC裂解过程
1.除掉表面的悬浮液确保没有多余的生理盐水残留在RBC表面上
2.取30lRBC于一试管中，加150l裂解液
3.充分混匀，使用前需要等5分钟。
说明：
RBC及裂解液比例浓度可据标本情况调整。
试验运行条件
确定电脑软件中的参数是否正确包括（点样参数、电泳参数、染色脱色参数和结果判读参数），各参数设置请参照如下介绍。
请参考“User’sManual”查阅有关仪器参数设置的详细说明。
胶片的处理
用吸水纸C（SCE602A）吸取胶片表面多余的缓冲液（时间为2秒钟），将胶片插入胶片支架中。
696PC系统参数一览表：
碱性血红蛋白样本处理参数
SAMPLESDRAWINGTIME
吸样时间
10
SAMPLESAPPLICATIONTIME
点样时间
40
AFTERAPPLICATIONWAITINGTIME
点样后等待的时间
0
NUMBEROFAPPLICATIONS
点样梳的数量
1
WASHING1TIME
用洗液1清洗点样梳的时间
10
WASHING2TIME
用洗液2清洗点样梳的时间
10
电泳参数
MIGRATIONCHAMBERVOLTAGE
电泳槽电压
400
MIGRATIONTIME
电泳时间
20
WAITINGTIMEAFTERMICGRATION
电泳后的等待时间
0
染色、脱色、结果判读参数
DENATURATIONOFTIMELEFTCHAMBER
左边加热槽变性时间
12
DENATURATIONOFTIMERIGHTCHAMBER
右边加热槽变性时间
0
STAINNINGTIME
染色时间
4
DESTAININGTIME（RECOVERED-DISCHARGE）
脱色时间（重复利用的脱色液－排放）
4
DESTAININGTIME（CLEAN-DISCHARGE）
脱色时间（干净脱色液－排放）
4
DESTAININGTIME（CLEAN-RECOVERED）
脱色时间（干净脱色液－返回至重复利用脱色液瓶中）
4
WASHINGSOLUTIONTIME
消耗洗液时间
0
DRYINGOFGELTIMELEFTCHAMBER
左边电泳槽凝胶烘干时间
5
DRYINGOFGELTIMERIGHTCHAMBER
右边电泳槽凝胶烘干时间
0
SCANNING
结果判读时间
1
696PC系统维修参数
●血清蛋白样本处理参数
1°APPLICATIONPOINT
点样梳距离载样盘距离
0
2°APPLICATIONDISTANCE
两个点样梳之间的距离
73.0
●电泳参数
MIGRARIONWITHCENTRALELECTROD
含有中央电极
0
MIGRATIONWITHPOLARITYINVERSION
带有电极反转
1
POWERSUPPLYON
电压供给
1
VACUUMPUMPENABLED
真空泵应用
1
MIGRATIONTEMPERATURECONTROL
电泳时的温度控制
1
●电泳全过程步骤参数
APPLICATION&MIGRATION
点样和电泳
LEFTDENATURATION
左边电泳槽变性
STAINNING
染色
DESTAINING（CLEAN-DISCHARGE）
脱色
DESTAINING（RECOVERED-DISCHARGE）
脱色
DESTAINING（CLEAN-RECOVERED）
脱色
DRYING
烘干
SCANNING
结果判读
PARKHOLDER
将膜片支架放在停靠在支架位置
696PC系统由4部分组成
1.第一部分
第一部分是由载样盘和2个点样梳组成
载样盘：
－正确插入金属条
－在载样盘上方放入金属条以固定载样槽
－加样量
－在载样盘中所加的样本为30ml.
建议：
在执行血红蛋白电泳时包含有质控样本
点样梳
－确定系统是否含有2个点样梳
2.第二部分：
第二部分为电泳槽部分
－打开铝酯的包装，取出白色的海绵条
－如果是13个样本/膜片，则将2块白色的海绵放入相应的电极上（即两边电极不包含中央电极）
－将电泳槽放入系统中
3.第三部分
第三部分是光密度判读部分。
4.第四部分
第四部分包含有染色槽和烘干装置
染色脱色槽连接有不同的瓶子包括染色瓶、脱色液瓶、重复利用的脱色液瓶、洗液瓶、废液瓶。
－应确保所有的瓶子都正确的装满相应的液体
―应确保废液管放在称放废液的瓶子中。
－胶片支架
－用单张吸水纸吸去胶片表面多余的水分。
1个胶片支架可容纳1张胶片
－将胶片插入胶片支架中
－应确保胶片是否正确的插入支架上
－将胶片支架垂直的放在称放胶片支架的位置上（即Parkingtanks）
5.开始运行试验
注意：
每次在电泳结束后，不要忘记弃去海绵条。
结果：
从阳极道阴极结果如下：
—Hb-A
—Hb-F
—Hb-S-D
—Hb-A2-C-E
—碳酸酐酶带
—点样点
正常值：
-Hb-A96-99%
-Hb-A21-3.5%
-Hb-F<2%
每个实验室应该建立自己的参考值范围
异常值：
血红蛋白A2或F的值升高，则需要用定量方法检测
异常区带：
如果有额外的条带出现，则有必要用酸性血红蛋白电泳继续检测
在碱性血红蛋白电泳中，血红蛋白C-A2-E在同一位点
在碱性血红蛋白电泳中，血红蛋白S-D-G-Lepore也在同一位点
质控
推荐使用Interlab公司的质控品，货号为SCE129E和或SCE130E。
每个实验室应为每批质控品建立相应的可接受的参数。
如果质控品不在可接受的参数范围内，则此病人的检测结果是可疑的，应重新检测。
室内质控
在此试剂运输前，为了能使每个包装的试剂都符合Interlab产品的质量控制的要求，每个包装所有批号的产品都经过Interlab公司检测过。
质控试验的结果已报告在产品质量合格证中。
干扰因素和限制性
－不要用溶血的样本
－如果有异常的血红蛋白检测出来，其与异常的血红蛋白S,C,D的迁移率不同则建议用其他的方法进行鉴定，或联系其他特殊实验室
任何与操作规程不符的因素都会影响到试验结果。
性能特点：
精密度
在696PC系统中，将1个样本进行连续的13次试验即一张胶片用一个样本，这四个样本所用的试剂为同一批号。
以下表格是针对1个样本计算出的平均值、标准差、和CV值
区带
平均值
S.D.
C.V（%）
A
35.4
0.32
0.9
F
23.3
0.54
2.4
S
22
0.20
1.1
C
19.3
0.55
2.9
用同一批试剂，将1个病人的标本在4张不同的胶片上进行试验的重复，这4张胶片的批号有两种，其中1个病人的结果如下
区带
平均值
S.D.
C.V（%）
A
36
0.6
1.6
F
23.4
0.6
2.7
S
21.5
0.7
3.3
C
19
0.5
2.6
准确度：
用696PC系统对90个样本包括正常和异常标本进行试验，同时用商品化的琼脂糖凝胶系统对这90个样本进行试验对照。
这两种试验系统的相关性如下：
区带
斜率B
Y轴截距－A
相关性
A
0.90
1.84
1.00
F
0.95
0.30
1.00
S
0.99
0.38
1.00
C
1.00
0.08
0.99
升级会员 