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现代生物制药技术的研究进展

燕京理工学院

YanchingInstituteofTechnology

（2016）届化工与制药专业现代制药技术论文

题目：

现代生物制药技术的研究进展

学院：

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX专业：

XXXXX

学号：

XXXXXXX姓名：

Dream

指导教师：

林贝

教研室主任（负责人）：

林贝

2015年6月4日

现代生物制药技术的研究进展

Dream

化工与材料工程学院化药1204班学号XXXXXXX

指导教室林贝

摘要

本文简述了近年来基因工程在生物制药技术的发展和应用。

其中主要从基因操作中大分子的分离、PCR技术、基因芯片、外源基因的表达这4个方面叙述基因工程相关技术的应用和发展,以和基因工程药物的产业化现状与发展趋势。

关键词：

生物技术基因工程基因操作技术生物制药

1基本概念

1.1生物技术

广义的生物技术是指人类对生物资源（包括动物、植物、微生物）的利用、改造的相关技术。

其发展经历了三个不同的阶段——以酿造为代表的传统生物技术，以微生物发酵为代表的近代生物技术，以基因工程、细胞工程、酶工程和蛋白质工程为代表的现代生物技术。

现代生物技术可以理解为是直接操纵有机体细胞和基因的一种全新技术是二十世纪70年代开始异军突起的高技术领域，在医疗、制药、农业、轻工食品和环保业发展迅速。

[1]以上的生物技术成果集中应用于医药工业。

1.2现代生物技术两大核心工程

1.2.1工程

概念：

基因工程是分子遗传学和工程技术结合的产物。

是现代生物技术的核心它能按人类需要把遗传物质DNA分子从生物体中分离出来，进行剪切、组合、拼装合成新的DNA分子。

再将新的DNA分子植入某种生物细胞中，使遗传信息在新的宿主细胞或个体中得到表达，以达到定向改造或重建新物种的目的。

1.2.2细胞工程

概念：

利用细胞融合技术把含有不同遗传物质的细胞合成杂种细胞。

并使之分裂生长成为杂种生物。

它包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染色体片段的重组等。

1.3现代生物制药

主要指基因重组的蛋白质分子类药物的制造过程，即利用基因工程、抗体工程或细胞工程技术生产的源自生物体内的天然物质，用于体内诊断、治疗或预防药物的生产过程（也可称基因工程制药）。

2基因操作技术

基因大分子的分离主要指质粒（plasmidDNA）和基因组DNA的分离。

质粒分离的常用方法有碱变性抽提法、煮沸法、去污剂裂解法、质粒DNA释放法、酸酚法等。

质粒在基因工程中最常用来做成各种克隆载体（cloningvector）或表达载体（expressionvector）。

质粒载体还可用于RNA干扰（RNAinter-ference）的研究[1]（由于这一技术的研究和应用,美国科学家AndrewZ.Fire博士和CraigC.Mello博士获得了2006年度的诺贝尔生理学或医学奖）。

基因组DNA的分离通常采用酚-氯仿法、基因文库（genelibrary）、Southern杂交以和PCR扩增技术等。

其中基因文库是指含有某种生物基因组不同基因片段的一群DNA重组体克隆,包括cDNA文库（com-plementaryDNAlibrary,cDNAlibrary）和基因组DNA文库（genomiclibrary）。

最近又有研究者利用名为chum-RNA的小分子RNA建立非PCR扩增的单细胞cDNA文库[2]。

2.1聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术。

该法由Mullis等人于1985年发明,并于1993年获得了诺贝尔化学奖。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR技术可分为定性PCR和定量PCR。

2.2定性PCR技术

定性PCR技术包括:

反转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）,是从非常少量的mRNA样品构建大容量cDNA文库的方法,还发展出实时RT-PCR用于定量实验[3];多重PCR（multiplexPCR）,是指在同一PCR反应体系中加入多对不同的引物,以扩增同一模板的不同区域;反向PCR（inversePCR）,该法可以对一个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究;锚定PCR（an-choredPCR）,现称为cDNA末端快速扩增技术（rap-idamplificationofcDNAends,RACE）[4]。

2.3荧光标记分子

定量PCR技术以实时PCR（realtimePCR）为代表,其基本原理是在PCR反应体系中引入荧光标记分子,对每一反应时刻的荧光信号积累进行实时监测,计算出PCR产物量,或通过标准曲线法得出初始模板量。

2.4基因芯片

基因芯片（genechipormicroarray）,是生物芯片的一种,其基本技术包括:

核酸方阵的构建、样品的制备、杂交和杂交图谱的检测和读出。

根据用途不同可分为表达谱芯片（expressionpro）、测序芯片和诊断芯片。

其中表达谱芯片的应用最为广泛,可用于基因功能分析、疾病发生机制的探讨和药物研究和筛选[5]。

（1）确定药靶基因:

通过比较正常细胞与异常细胞表达谱之间的差异,从而确定药靶基因。

（2）监测药物治疗前后的基因表达变化:

该监测可有3方面的作用。

一是用于研究药物作用机制,通过监测基因表达的变化,可研究药物作用途径和对细胞信号转导的影响,从而了解该药物的作用机制;二是用于研究药物毒理,从表达谱的改变和异常表达,便可分析药物毒理;三是用于药物筛选,利用用药前后表达谱的改变,通过分析病理、生理、生化原理,能高效地筛选出新的药物或先导化合物。

NA芯片技术在药物基因组学的应用,一方面可加速药物基因组学的发展;另一方面:

DNA芯片利用药物基因组学的研究成果,根据基因型将人群划分为各种类型。

DNA芯片可自动快速地检测哪些可影响药物效应的基因（为药物代谢酶、药物作用靶标等）例如设计一种淋巴白血病药物基因组芯片,包括所有可能影响病人化疗反应的基因,借助于这种芯片,根据病人的基因型分类,医生为每一个病人选择合适的治疗药物和剂量。

2.5外源基因

导入宿主细胞的外源基因,通过基因表达得到相应的蛋白质产物。

根据宿主细胞的不同可分为原核细胞表达系统和真核细胞表达系统。

在外源基因表达时,通常把一个报告蛋白的基因与一个目的蛋白的基因融合在一起,形成融合蛋白,用于目的蛋白的检测与纯化。

常用的报告蛋白有β-半乳糖苷酶（β-gal-actosidase）、谷胱甘肽S-转移酶（glutathiones-transfer-ase,GST）、绿色荧光蛋白（greenfluorescenceprotein,GFP）以和硫还蛋白（thioredoxin,Trx）等。

其中值得一提的是GFP,2008年8月有3位科学家因此获得诺贝尔化学奖:

日本科学家OsamuShimomura、美国科学家MartinChalfie、美籍华人科学家钱永健。

除了直接标记目的蛋白用于检测与纯化外,还可利用某些GFP具有荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）的现象,用于蛋白质折叠[6]、蛋白质-蛋白质相互作用[7]、信号转导通路等[8]方面的研究。

3现代生物制药的现状

国际上,生物制药业主要集中在美国日本和欧洲,其中美国作为生物制药的发源地,无论是在经费投入、产品开发和研制,还是在产品生产和市场卜都居于国际领先地位,其它开发的产品和市场销售额占全球的90%以上。

目前,美国共有生物制药公司约1400家,具中形成规模生产的有Alzlgen、Seherir一g一Plougll、EliIJ1l一yMcrk、Gelexlteell等20多家公司。

日本在生物技术的开发仅次美国,目前共有生物制药公司约600家,其中麒麟啤洒、中外制药、味之素等著名厂商不仅在日本习内处与生物制药各方面的领先地位,而不断加强世界市场的开拓,进入欧洲和亚洲市场。

欧洲在生物技术的开发上稍落后于日本但近两年来欧洲在生物技术的投入和新公司成众的数量上急速增长,目前欧洲的生物制药公司约有300家但还处在发展的开始阶段。

3.1我国生物制药的现状

至2004年我国有现代生物制药企业114家，其中疫苗生产企业28家，可以生产27种基因工程药物和26种病毒的41种疫苗。

按现价统计规定，生物生化制品生产企业全国409家，总产值220亿元，销售收入196亿元。

“十五”前四年，平均每年大于20%的速度增长用于该领域的投资不断加大于固定资产平均增长32.5%。

我国现已成为世界疫苗最大生产国年产量超过了10亿个计量单位。

儿科常见病疫苗年产量达5亿人民币除满足自用外还向世界卫生组织（WHO）提供疫苗产品用于其他国家。

3.2我国生物制药存在的问题和应采取的措施

我国生物制药存在一系列问题开发水平低缺少创新产品生物制药产业下游技术薄弱重复生产严重、资源浪费过大产业化规模小、市场竞争无序。

可采取的措施以仿制促进创新最终以创新实现产业飞跃，多渠道建立融资网络改革科研体制建立新的产学研一体化的机制，加强国际交流与合作积极应对国际竞争加强宏观调控强化和规范财税优惠政策。

4基因工程在生物制药中的发展趋势

目前基因工程药物的研发趋势是:

（1）发展表达载体:

目前最主要的用于生产的表达载体是哺乳动物细胞和大肠杆菌。

大肠杆菌属于原核表达系统,没有糖基化功能,只能用于表达功能蛋白不需要糖基化的重组药物,如胰岛素等,且目的蛋白大量表达之后易形成包涵体,不易复性。

而功能蛋白需要糖基化的则主要在哺乳动物细胞中表达。

也有用真核化的原核表达载体[9]。

目前还有“人源化”酵母表达体系和植物表达体系正在发展。

（2）对现有的重组药进行基因工程改造和修饰:

通过基因工程的改造和修饰使蛋白药物在临床应用上更安全更有疗效,如G-CSF和EPO等突变体药物研究与开发。

目前,由于天然基因工程药物品种的研究已经相当普遍,因此采取对现有的重组药进行基因工程改造和修饰的策略,既可以避免侵犯知识产权,又可以为新药研究开辟出新途径。

（3）改变给药途径:

在继续改进注射用溶液和注射用无菌粉末的稳定性之外,还发展出化学修饰型、控释微球型和脉冲式给药系统。

而在鼻腔、口服、直肠、口腔、肺部给药方面也已取得重大进展。

5生物制药研究新进展

5.1计算机辅助药物设计技术发展

计算机技术的发展和向药物化学学科的渗透，促进了药物设计的发展。

20世纪90年代计算机辅助药物设计取得突破性进展，现已成为药物研究和开发的重要方法和工具。

计算机辅助药物设计利用了计算机快速、全方位的逻辑推理功能、图形显示控制功能，并将量子化学、分子力学、药物化学、生物化学和信息科学结合起来，研究受体生物分子与药物结合部位的结构与性质、药物与受体复合物的构型和立体化学特征、药物与受体结合的模式和选择性、特异性、、药物分子的活性基团和药效构象关系等，从药物机理出发，改进现有生物活性物质的结构，快速发现并优化先导化合物，使其尽早进入临床前研究，减少传统的新药研究的盲目性，缩短新药研制的时间。

计算机辅助药物设计有两类方法，一类是基于机理的药物设计（MBDD），另一类是基于结构的药物设计（SBDD），基于机理的药物设计要针对药物作用机理，从靶点出发，考虑药物与受体的作用过程，并要模拟药物在体内的吸收、转运、代谢等动态过程，比基于结构的药物设计更合理，但该法还不成熟。

目前的计算机辅助药物设计主要还是基于结构的药物设计，今后的计算机辅助药物设计的目标是向基于机理的药物设计方向发展。

相信随着生命科学和计算机科学的发展，考虑药物不同作用机理和全部作用过程的计算机辅助药物设计技术将逐步建立并不断完善。

5.2组合化学与高通量筛选技术发展

组合化学是近20年发展起来的一种合成大量化合物的新方法，它是建立在高效平行的合成之上，在同一个反应器内使用相同条件同时制备出多种化合物，建立各类化合物库的策略。

组合化学通常采用操作、分离简便的固相化学合成。

液相化学合成技术也在快速发展和完善中。

在药物研究过程中，通过化合物活性筛选而获得具有药物活性的先导化合物是新药研究的基础。

随着分子水平的药物筛选模型的建立，筛选方法和技术都发生了根本性的变化，出现了高通量筛选的新技术，大大加快了先导化合物的寻找和发现，并促进了高通量有机合成。

近年来，组合化学与高通量筛选结合，使组合化学的化合物库种类、数量不断扩大，筛选的先导化合物数量和种类也在不断地增多，使新药的种类和数量也在不断地增加。

组合化学实现的自动化合成仅20世纪90年代后得到的各类化合物总和已超过了人类有史以来所发现化合物的总和，故有人把组合化学与高通量筛选结合技术称为“新药发现的高速公路”，据文献记载，1992年～1998年的几年，经过组合化学化合物库与高通量筛选，确定的候选药物已有46个，并已进入人体测试阶段。

[10]显然，组合化学与高质量筛选的结合技术，大大地加快了新药研制的步伐。

虽然如此，组合化学建立的大型化合物库，为筛选也带来了困难，因此，利用组合化学设计，构建具有结构多样性的小型而便于筛选的组合化合物库，结合化学信息学和高通量筛选，将是组合化学与高通量筛选结合的一项重要课题。

5.3药物手性合成技术发展

化学合成技术在新药发现过程中发挥着十分重要的作用。

近年来由于有机化学学科新理论、新反应、新技术不断发现，使得合成反应具有化学选择性成为现实，并促进了药物合成技术的快速发展，其中手性合成技术使新药研制的领域不断扩大。

手性是自然界的本质属性。

在生物体手性环境，如酶、受体、离子通道、蛋白质、载体中，分子之间手性匹配是分子识别的基础，受体与配体的专一作用，酶与底物的高度、区域、位点和立体催化专一性，抗原与抗体的免疫识别都与手性有关，同时药物的生物应答常受到手性影响，包括药物在体内的吸收、转运、分配、位点活性的作用以和代谢和消除。

所以，手性药物的开发是当前医药界重点研究的热点之一，并取得了令人注目的成就。

目前已上市的药物中手性药物约占1/3，如2000年全球手性药物销售额达1233亿美元。

手性药物的制备技术主要有拆分法、化学合成法和生物合成等三大类，发展较快的是后二类。

化学合成法是在不对称催化剂存在下，利用化学反应的动力学和热力学不对称性，进行单一对映体合成。

在已上市的手性药物中，其手性中间体均可通过现有的重（双）键不对称还原技术，特别是不对称氢化和不对称转移氢化来合成。

至今为止在不对称催化合成中，昂贵的手性配体和贵金属的使用，以和手性催化剂的催化效率仍是制约其在手性技术上应用的关键。

因而，手性催化剂的设计和合成，以和催化剂的回收循环使用是当今不对称催化合成研究的方向。

生物合成法则利用催化剂,酶-催化反应的高度、底物、区域、位点和立体选择性来合成手性药物。

生物合成法具有选择性高、产率高、反应条件温和等特点，随着科学技术的发展，生物合成法将成为手性制备的高效手段。

5.4药物生物技术发展[11]

生物技术药物是指利用DNA重组技术或单克隆抗体技术或其它生物技术研制的蛋白质、抗体或核酸类药物，它是目前生物技术研究最为活跃的领域，给生命科学的研究和生物制药工业带来了革命性变化。

参考文献

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