美国药典微生物检测精要.docx

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美国药典微生物检测精要

美国药典微生物检测精要

培训小结

一微生物实验室规范

重要的控制点：

无菌技术、培养基控制、菌种控制、设备操作与控制、数据记录与实验室布局和运作、员工培训等。

1无菌技术：

防止和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作方法和管理方法。

可通过无菌环境、灭菌、消毒、卫生要求、无菌操作技术等手段来实现。

2培养基：

是微生物实验工作的核心。

包括培养基制备、培养基储存、培养基质量控制。

2.1培养基制备

2.1.1根据既定的目的选用正确的培养基

2.1.2参考生产商的ＣＯＡ和说明书：

关于配制、储存和菌种选用等。

2.1.3所用的水应为去离子水或蒸馏水，应记录用量。

2.1.4成分的称量应用校准过的天平，根据称量量的不同选择合适的天平。

使用清洁的容器和工具（<1051>玻璃器皿清洁）以防外来污染和抑制剂。

应记录称量量。

2.1.5加热帮助溶解时应防止过度加热，通常培养基颜色变深说明加热过度了。

2.1.6灭菌条件：

●灭菌参数应验证，验证应同时考虑无菌和培养基生长能力

●采用高压蒸汽灭菌或过滤灭菌。

湿热灭菌应考虑装载分布，加热速度过慢会使培养基过度加热，通常为121℃15min，此时间是指培养基温度达到121℃后15min。

●保证最低SAL，在无菌和过度加热之间平衡。

●与污染物分开灭菌

●消毒结束后，不应在灭菌柜中储存培养基，过度加热会影响培养基颜色、澄清、pH和凝固能力。

2.2培养基储存

2.2.1制备培养基的储存

●琼脂培养基易受冷冻影响，低于0℃会破坏凝胶结构。

●应避光避热，密封防止水分蒸发（建议使用螺旋盖的瓶子密封，保存时间长）。

2.2.2培养基融化

●不能超过一次，以防过度加热或潜在污染。

●融化可采用水浴、流通蒸汽或微波炉加热。

微波炉加热宜采用少量多次，以防过度。

●培养基融化后在40-50℃水浴中储存不应超过8小时，浇制平皿前应擦干以防污染。

2.2.3培养基标示

●培养基名称

●批号、制备批号

●制备日期、有效期

2.2.4有效期确定

●根据成分、配方、容器、储存条件等确定

●有生长能力试验数据支持

2.2.5应在验证过的条件下储存

2.2.6重要区域环控用培养基必须

●双层包装

●最终灭菌，否则进行全数培养及用前检查

2.2.7根据当地生物危险品安全程序处置过期培养基

2.3培养基质控

2.3.1灭菌后培养基检查

2.3.1.1生长能力

●每批制备的培养基均需进行

●测试菌种根据药典，供应商说明书及环境中分离得到

●测试不合格应进行调查，如无原因，或无有效纠正措施，不得使用该批号

2.3.1.2无菌

2.3.1.3pH

2.3.1.4容器/平皿的完整性

2.3.1.5抑制或指示能力

2.3.2定期稳定性检查以确认储存有效期

3菌种保藏

3.1建立标准程序处理、保存菌种，防止污染和特性变化

3.2使用前确认菌种身份和纯度

3.3根据生产商说明书复苏菌种，使用接种技术

3.4-70℃以下或冷冻干燥保存储备菌种，可延长保存周期

3.5开启后不要重新冷冻菌种，剩余部分应弃置

3.6传代次数（每接种一次即为一代）不超过5次

3.7保藏时间根据具体保藏条件确定

4设备维护

4.1定期校准、保养

4.2定期性能检查

4.3定期清洁、消毒

5实验室布局和运作

5.1防止交叉污染

5.2活动分区：

无菌、环控样品的处理和培养应在无菌环境中进行

5.3当发现微生物生长，后续的工作应转移至“阳性”区

5.4环控设备应放置在待取样区域环境中并小心操作

5.5应在受控条件下小心取样

6样品处理

6.1大部分样品、水或环控样品中的微生物对操作、储存环境敏感

6.2减少样品，取样与测试间的时间间隔

6.3长时间的转移需确认转移条件对测试及样品的影响

6.4在无菌条件下，使用无菌技术取样，即使是非无菌样品

6.5取样记录：

样品信息、取样日期、送样日期、人员/部门、实验室样品接受及确认

7培养基培养时间

7.1短于3天，用小时表示

7.2长于3天，用天表示（上午、下午，相同时间段）

8人员培训

8.1每个岗位应有相应培训要求，进行上岗前资质确认

9实验室文件

9.1微生物人员培训和能力确认（上岗资质）

9.2设备验证、校准和维护

9.3测试中的设备性能（如温度记录）

9.4培养基制备、无菌检查、生长能力测试、选择性测试

9.5培养基清单与控制

9.6根据程序（ＳＯＰ）进行测试的重要数据

9.7数据和计算的确认

9.8经ＱＡ人员或相应领导审核过的报告

9.9超标结果调查

10实验室结果维护

10.1检测报告至少应包括：

●日期

●测试样品

●微生物检验人员名字

●程序编号

●测试结果

●偏差（如有）

●测试参数（设备、菌种、培养基）

●管理人员审核签名

10.2数据纠错：

错误的地方划一横线，签名和日期，必要时说明原因

10.3测试结果

●应包含平皿计数结果（如有）

●数据分析方法应罗列在相关ＳＯＰ中

●对粘贴的图表、数据骑缝签名

10.4存档：

记录应存档并防止丢失，应有记录留存计划

11测试结果解释

11.1微生物数据有时不容易解释

●与人类相关的微生物群落被广泛的用于许多测试

●人员污染是始终被关心的问题

●样品或环境中的微生物并非均匀分布

●微生物检测可变范围大：

可能在+/-0.5log10单位左右

11.2不符合的结果可能是由2个原因造成的：

实验室错误或产品不符合。

无论哪种情况，管理层必须立即被通知

11.3调查应包括：

●数据偏离的程度（严重性）

●平行数据间差异的评估

●实验室环境

●取样方法

●物料特性（存活的污染微生物）

●人员面谈

●留样评估

●测试过程

11.4纠偏计划（警戒限、行动限）

●如果发现实验室错误，需要

●纠偏措施的有效性需要跟踪和记录

11.5无效测试：

由于错误将试验视作无效必须记录

11.6确认测试（复试）：

应有ＳＯＰ描述何时进行

二非无菌产品：

微生物计数

1常规过程

1.1避免产品以外的微生物的污染。

1.2去除细菌抑制/真菌抑制性。

1.3证明表面活性剂的无毒性及其与抑制剂的相容性。

2计数方法

2.1薄膜过滤法

2.2平皿计数法：

平皿浇注法，表面涂布法。

2.3最大可能性数量法（MPN）：

用于检测极少数量的微生物，精密度、准确度差，不适合用于霉菌。

3生长能力测试和方法适用性

3.1生长能力测试：

●一般考虑

●测试菌株准备

●缓冲液

●阴性对照

●培养基生长测试

3.2计数方法适用性：

●样品制备

●接种与稀释

●中和/去除抗菌活性

●产品存在情况下的微生物的回收率

●结果与解释

4微生物数据的可变性

4.1成品测试

4.1.1抗菌效力测试

4.1.2微生物限度检查

4.2培养基生长能力测试

固体培养基，计数结果与标准接种物的计数数量差别小于系数2。

对新鲜制备的菌液，生长与前批已通过的培养基的前次测试结果一致。

4.3计数方法适用性测试

样品计数结果与对照计数结果的相差小于系数2。

4.4微生物回收率验证

4.4.1固体培养基的回收率验证

4.4.2受损微生物的恢复

三非无菌产品：

控制菌微生物测试

1常规过程

1.1避免产品以外的微生物的污染。

1.2去除细菌抑制/真菌抑制性。

2产品测试

2.1样品制备和增殖

2.2选择性培养

2.3结果解释

3培养基适用性测试和方法适用性测试

3.1培养基适用性测试：

●测试菌株准备

●菌株

●阴性对照

●生长能力测试、抑制及选择性测试

3.2方法适用性：

●样品制备

●接种与稀释

●中和/去除抗菌活性

●产品存在的情况下，微生物的回收率

●结果与解释

4菌种

●金黄色葡萄球菌

●铜绿假单胞菌

●大肠埃希菌

●肠道沙门氏菌

●白色念珠菌

●梭菌

4.1微生物使用不超过5代

4.2PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH7.2磷酸盐缓冲液制备悬浮菌液

4.3悬浮菌液2小时内使用，2-8℃不超过24小时

4.4生孢梭菌也可制备孢子悬浮液，2-8℃保存期限需确认

四药物制剂和药用物质的接受标准

1非无菌制剂的微生物质量标准

1.1口服固体

1.2口服液体

1.3直肠制剂

1.4局部及鼻腔制剂

1.5阴道制剂

1.6吸入剂

1.7活性药物成分、辅料

2药物产品的接受标准

2.1其他重要性根据评估：

●产品用途

●产品特点

●应用的方法

●药物接受者：

对婴儿、幼儿及衰弱患者的风险是不同的

●存在疾病、伤口、器官损伤

相应的因素的风险评估由经授权的有资质的人员进行

3有害微生物

3.1有害微生物的概念不适合无菌产品，无菌产品中不得有任何微生物

3.2将用于非无菌产品的微生物测试，及非无菌产品环境中分离到的微生物评估及清洁验证

3.3有害微生物的定义：

3.1.1能在产品中增殖的微生物，对药品的物理特性及治疗作用有负面影响

3.1.2由于产品中微生物的数量及致病性能导致使用该药品的患者受到感染

4微生物质量相关的产品召回

5USP微生物质量接受标准

5.1USP各论要求是最低的公共标准

5.2通则提供了符合各论要求的方法

5.3有效期内测试

5.4不等于成品所需的所有放行测试

五水分活性确定对非无菌药品的应用

1水分活性

1.1非无菌药物制剂中水分活性的确定：

1.1.1改善产品处方以提高防腐系统的抗菌效力

1.1.2降低可能在产品处方中化学水解的活性成分的降解

1.1.3降低微生物对产品的污染

1.1.4可以减少和如何筛选需测试的控制菌

1.2降低水分活性在微生物生长方面的作用

1.2.1较长的停滞期、较慢的生长速度、较少的稳定期的微生物数量

1.2.2减少微生物毒素的产生

1.2.3在某个微生物专有的水分活性以下，该微生物不会生长

1.2.4水分活性下降后，微生物的耐热性会提高

2测试策略

2.1水分活性高于0.75的多剂量水性药品需要加入防腐剂并将微生物限度测试作为常规放行测试

2.2水分活性低于0.75的药品不需额外防腐，在风险评估后不需要将微生物限度测试作为常规放行测试

2.3制药厂商对原料厂商的生产工艺、质量计划、测试记录有全面的了解。

这些可以通过供应商审计计划得到

六无菌测试

1灭菌和无菌保证中的观点：

按照无菌最严格的定义，只有当样品中完全没有活的微生物时，它才能被称为是无菌的。

2无菌测试的首要难点：

整批产品不能进行逐个破坏检查是无法证明绝对无菌的。

2.1无菌是根据概率的原则判断的。

从给定批号的所有产品中存在被污染产品的概率得出判断。

2.2目的是使其可能性与真实性仅有可接受的微小差异。

3无菌测试本身并不是设计用于保证产品无菌或产品已灭菌。

产品的无菌保证是通过灭菌工艺或无菌工艺的验证来得到的。

4无菌测试流程

4.1培养基和细菌抑制/真菌抑制性测试（方法验证）

4.2去除任何抑制细菌和真菌生长的因素

4.3确定用于测试的样品数量，每个样品的用量

4.4培养样品

4.5检查测试样品是否有生长的迹象

4.6显微镜检查有疑问的容器是否有生长的迹象

4.7必要的话再接种培养

4.8写报告