酶工程 考试重点.docx

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酶工程考试重点

第二章微生物发酵产酶

名词解释

酶生物合成的诱导作用：

加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象

酶生物合成的反馈阻遏作用：

又称产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象

分解代谢物阻遏作用：

是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象

判断组成酶or诱导酶受什么阻遏

固定化细胞：

又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞

固定化原生质体：

是指固定在载体上，在一定的空间范围内进行新陈代谢的原生质体

原生质体：

是除去细胞壁后由细胞膜及包内物质组成的微球体。

原生质体由于除去细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外，可以用于胞内酶等胞内产物的生产。

问答题

何为细胞产酶动力学，简述其动力学模型

产酶动力学主要研究发酵过程中细胞产酶速率以及各种因素对产酶速率的影响规律，主要为宏观产酶动力学。

根据细胞产酶模式的不同，产酶速率和细胞生长速率的关系也有所不同。

1）同步合成型的酶：

其产酶与细胞生长欧联，在平衡期产酶速率为零，即非生长偶联的比产酶速率β=0方程：

dE/dt=αμX

2）中期合成型的酶：

在培养液中有阻遏物存在，α=0，无酶产生。

在此阶段的产酶动力学方程与同步合成型相同

3）滞后合成型：

其合成模式为非生长偶联行，生长偶联的比产酶系数α=0方程：

dE/dt=βX

4）延续合成型的酶：

在细胞生长期和平衡期均可以产酶，产酶速率是生长偶联与非生长偶联产酶速率之和（最理想状态）方程：

dE/dt=αμX+βX

受mRNA抑制的模型：

1）、2）

原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节，与酶的生物合成密切相关的基因有4种：

调节基因、启动基因、操纵基因和结构基因。

结构基因与操纵基因、启动基因一起组成操纵子。

原核生物中有两种类型操纵子：

诱导性，如乳糖操纵子；阻遏型操纵子，如色氨酸操纵子。

1、发酵工艺流程（了解，考点较少）：

细胞活化→细胞扩大培养→制作培养基（碳源、氮源、无机盐、生长因素）→分离纯化→酶

2、发酵工艺条件的控制

（1）培养基的配制调控

碳源：

提供碳素化合物的营养物质；为细胞提供能量的能源

氮源：

向细胞提供氮元素的营养物质

无机盐：

提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的pH，氧化还原单位和渗透压其调节作用

生长因素：

提供繁殖所必需的微量有机化合物，主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、生物素。

氨基酸是蛋白质的组分；嘌呤、嘧啶是核酸和某些辅酶或辅基的组分，维生素主要起辅酶作用；动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分裂起调节作用

（2）pH调节控制

细菌和放线菌的生长最适pH在中性或碱性范围（pH6.5-8.0）霉菌和酵母的最适生长pH为偏酸性（pH4-6）植物细胞生长的最适pH为5-6

细胞发酵产酶的最适pH与生长最适pH往往有所不同。

细胞产酶的最适pH通常接近于该酶催化反应的最适pH。

Eg：

发酵生产碱性蛋白酶的最适pH为碱性（pH8.5-9.0）生产中性蛋白酶的pH以中性或微酸性（ph6.0-7.0）为宜，而酸性条件（pH4-6）有利于酸性蛋白酶的产生。

（3）温度的调节控制

有些细胞发酵产酶的最适温度与生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。

这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。

枯草杆菌最适生长温度为34-37度，黑曲霉的最适生长温度为28-32度

（4）溶解氧的调节调控

细胞的生长、繁殖和生物合成过程需要大量能量，必须获得充足的氧气，发酵过程中尽量控制溶氧速率等于或稍高于好氧速率。

3、提高酶产量的措施

（1）添加诱导物（只针对诱导酶的发酵生产），可分为：

酶的作用底物、酶的反应产物、酶作用底物的类似物（异丙基-β-硫代半乳糖苷IPTG、蔗糖甘油单棕榈酸酯）

（2）控制阻遏物的浓度是解除阻遏提高酶产量的有效措施

解除分解代谢产物阻遏方法：

①控制可利用的碳源浓度②添加一定量的环腺苷酸cAMP

解除受代谢途径末端产物阻遏的方法：

①控制末端产物的浓度的方法②对于非营养缺陷性菌株，可通过添加末端产物类似物的方法减少或者解除阻遏作用

（3）添加便面活性剂：

有离子型（对细胞有毒害作用，一般不能在酶的发酵生产中添加培养基中）和非离子型（常用）

（4）添加产酶促进剂

综合分析题：

试通过所给实验现象，分析酶生物合成调控的特点（不知道怎么答。

。

。

）

第四章

1、细胞破碎的方法：

分类

细胞破碎方法

细胞破碎原理

机械破碎法

捣碎法、研磨法、匀浆法

通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎

物理破碎法

温度差破碎法

压力差破碎法

超声波破碎法

通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎

化学破碎法

添加有机溶剂

添加表面活性剂

通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎

酶促破碎法

自溶法

外加酶自制法

通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，从而达到细胞破碎

2、酶提取的主要方法：

提取方法

使用的溶剂或者溶液

提取对象

盐溶液提取

0.02~0.5mol/L的盐溶液

用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶

酸溶液提取

pH2~6的水溶液

用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性好的酶

碱溶液提取

pH8~12的水溶液

用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶

有机溶剂提取

可与水混溶的有机溶剂

用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶

3、酶沉淀分离方法的原理与特点：

沉淀分离方法

分离原理

特点

盐析沉淀法

利用蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出从而使酶与杂质分离

应用最早、使用广泛、盐析得到的酶沉淀含有大量盐分

等电点沉淀法

利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出从而使酶与杂质分离

沉淀不完全

有机溶剂沉淀法

利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，达到目的

酶沉淀易于离心或过滤分离，不含无机盐；分辨率较高；容易引起酶变性失活

4、膜分离技术（大题）

指的是借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。

在酶生产中的应用：

加压膜分离1）微滤在酶的分离纯化过程中，可以通过微滤除去酶液中含有的微生物细胞等。

2）超滤是借助于超滤膜将不同大小的物质颗粒或分子分离的技术，主要用于分离病毒和各种生物大分子。

不仅用于酶的分离纯化，同时还能达到酶液浓缩的目的，特别适用于液体酶制剂的生产。

3）反渗透主要用于分离各种离子和小分子物质，在无离子水的制备、海水淡化等方面也广泛应用。

5、层析分离方法

层析方法

分离原理

离子交换层析

利用离子交换剂上的活性基团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的

凝胶层析（Ka=Ve--Vo/ViKa=0最先流出，Ka=1最后流出，0~1从小到大洗脱出去，不是单纯的凝胶层析时，会出现Ka大于1）

以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离

亲和层析

利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分离纯化

凝胶电泳的分类及其原理：

聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶

7、离心分离：

借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。

1）差速离心适用于大小和密度相差较大的颗粒2）密度梯度离心使沉降系数比较接近的物质得以分离3）等密度梯度离心

名词解释：

沉淀分离：

是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他溶质分离的过程。

凝胶层析：

是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。

凝胶电泳：

是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。

双水相萃取：

利用溶质在互不相容的两相中的溶解度不同而达到分离目的。

超临界萃取：

是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。

（最常用的的超临界流体是co2）

反胶束：

将表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体。

电泳：

带点粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。

层析分离：

利用混合液中各组分的物理化学性质的不同，使各组分以不同比例分布在两项中

结晶是纯化分离的一种手段

等电点聚焦电泳的目的是，测定酶的等电点及酶和其他蛋白质的分离

第五章酶分子修饰

第五章酶分子修饰

名词解释：

1.酶分子修饰：

通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。

2.大分子结合修饰：

采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。

3.肽链有限水解修饰：

在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的催化特性的方法。

4.核苷酸剪切修饰：

将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

问答题：

试述酶分子修饰的作用。

通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些合理的改变，就有可能提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、改变酶的底物专一性等。

同时通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与催化特性之间的关系，所以，酶分子修饰在酶学和酶工程研究方面具有重要的意义。

举例说明肽链有限水解修饰和核苷酸剪切修饰。

一肽链有限水解修饰：

1用具有高度专一性的蛋白酶对某些酶原进行肽链有限水解修饰，从而显示出酶的催化活性或提高酶活力。

例如，胰蛋白酶原本来没有催化活性，当受到胰蛋白酶或肠激酶的修饰作用，从N端去一个六肽后，就显示胰蛋白酶的催化功能。

2有些酶的活性较低，通过酶分子主链修饰可以显著提高酶的催化活性。

例如，天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰，从其羧基末端切除10个氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸的催化效率提高5倍左右。

3采用适当的方法使酶分子的肽链在特定的位点断裂，其分子质量减少，就可以在基本保持酶活性的同时使酶的抗原性降低或消失。

例如，酵母的喜春化酶经肽链有限水解，除去由150个氨基酸残基组成的肽段后，酶活性仍然可以保持，抗原性却显著降低。

4酶蛋白的肽链有限水解修饰通常使用某些专一性较高的蛋白酶或肽酶作为修饰剂。

有时也可以采用其他方法使酶的主链部分水解，而达到修饰目的，例如，枯草杆菌中性蛋白酶经过EDTA处理后，再通过纯水或稀盐缓冲液透析，部分水解，得到仍然具有蛋白酶活性的小分子肽段，将其用作消炎剂使用时，不产生抗原性，表现出良好的治疗效果。

核苷酸链剪切修饰作用：

某些RNA分子原本不具有催化活性，经过适当的修饰作用，在适当位置去除一部分核苷酸残基后，可以显示酶的催化活性，称为一种核酸类酶

eg：

四膜虫26SrRNA前体经过自我剪接作用形成成熟的26SrRNA，同时生成由414个核苷酸（nt）

组成的线性间隔系列LIVS。

LIVS的5’端切除15nt后环化，开环后进行第二次环化，有失去4nt，最后开环得到一个在5’端失去19个核苷酸残基的多功能核酸类酶L-19IVS

1、酶分子修饰作用：

提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、降