HGH发酵和纯化工艺.docx
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HGH发酵和纯化工艺
资料项目名称：
hGH原液生产工艺的研究资料
第一部分：
发酵工艺研究
重组hGH发酵工艺研究分：
实验室摇瓶研究及上罐工艺研究。
实验室摇瓶研究的主要目的是通过对rhGH的一系统列优化表达实验，为上罐发酵确定了基本工艺条件；然后该工艺又通过在发酵罐水平（5L）进行了不断地优化与验证，最终确定了本工程菌稳定的发酵工艺，rhGH的表达量每升培液可达近2g/L。
该工艺经过连续多批中试规模（5L体积），证实工艺稳定。
1、rhGH表达工艺的实验室研究
在尽可能与发酵罐条件相近的条件下，用小摇得到一定的实验数据，为后期中试上罐研究提供一定的数据参考。
以500ml三角烧瓶为主，个别实验自选。
批内2次，批间1次即可。
实验对象均采用经筛选最稳定高表达EB0200901号菌种。
1.1最佳诱导pH
方法：
取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:
10的比例二级接种于50ml培养基的500ml三角烧瓶中（每个条件有副管），培养24hr左右，1%甲醇诱导，诱导阶段的pH需按下表调节（因为是BMGY，所有在BMMY培养基中直接调节pH）。
诱导24hr取样，测定OD及pH，再加1%甲醇继续诱导。
共诱导48hr。
诱导前、诱导不同时间样品检测SDS-PAGE。
实验编号
实验条件
1
pH3.0
2
pH4.0
3
pH5.0
4
pH6.0
5
pH7.0
HGH
97kD
66kD
43kD
31kD
20kD
14kD
12345678910
4：
Marker（从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD）
1：
诱导前摇瓶上清液
2、3、5、6、7：
依次为pH3~7条件下诱导24hr摇瓶上清液（pH1.0/点）
8、9、10：
依次为pH3~5条件下诱导48hr摇瓶上清液（pH1.0/点）
图1.摇瓶pH优化电泳图
结论：
由于摇瓶实验采用的培养基于上罐不一样，并且实验中对pH的控制不十分精确，故认为HGH在pH=4.0附近时表达较好。
1.2保护剂类型及浓度
方法：
取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:
10的比例二级接种于50ml低盐培养基（用氨水调节pH为6.0）的500ml三角烧瓶中，培养24hr左右，1%甲醇诱导。
按下表添加不同的保护剂，诱导24hr取样，测定OD及pH，共诱导48hr。
诱导前、诱导不同时间样品检测SDS-PAGE。
实验编号（副管以’表示）
实验条件
1
CA
0.5%
2
1%
3
Yeastextract
0.5%
4
1%
5
Peptone
0.5%
6
1%
7
空白对照
－
8
－
HGH
97kD
66kD
43kD
31kD
20kD
14kD
123456789101112131415
1：
诱导前摇瓶上清液；2：
空白对照诱导48hr；4：
Marker
3、5、6、7：
依次为添加Yeastextract诱导24hr和48hr摇瓶上清液（6和7为重复）
8、9、10、11：
依次为添加CA诱导24hr和48hr摇瓶上清液（10和11为复）
12、13、14、15：
依次为添加Peptone诱导24hr和48hr摇瓶上清液（14和15为重复）
图2.摇瓶补料优化电泳图
结论：
首先，三种保护剂中Yeastextract效果较好，1%浓度也比0.5%浓度好。
另外，诱导48小时能够提高表达量，可作为上罐发酵指导。
2.rhGH的发酵罐工艺研究（中试研究）
初步完成中试实验，得到一定的实验数据，为后期中试稳定高表达工艺提供一定的数据参考，为以后进一步优化中试工艺提供依据。
以5L发酵罐，工作体积为3L。
实验对象均采用经筛选最稳定高表达的EB0200901号菌种。
2.1毕赤酵母发酵经典方法初步鉴定
方法：
取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:
10的比例二级接种于250mlBMGY的1L三角烧瓶中，培养4~8hr左右，上罐发酵，pH5.0（用氨水调节）、温度30℃、DO>35%，待溶氧上升后以10~15转度流加50%甘油300ml，待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度1开始诱导，逐渐提速，诱导后每隔4hr留样离心-20℃冻存，诱导36hr结束。
样品检测SDS-PAGE、蛋白含量。
rhGH
12345678910
3：
Marker（从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD）
1：
诱导前发酵上清液
2~10：
依次为不同诱导时间发酵上清液（最长36hr）
图3.发酵参数优化前电泳图
结论：
通过经典的方法，我们发现HGH能够有一定的表达，但表达水平较低，说明此项目的发酵工艺还需要进行不断地摸索，优化发酵工艺路线，提高表达水平。
2.2最佳pH
方法：
取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:
10的比例二级接种于3瓶250mlBMGY的1L三角烧瓶中，培养4~8hr左右，上罐发酵，初始pH5.0，诱导pH（如下表）、温度30℃、DO>35%，待溶氧上升后以10~15转度流加50%甘油300ml，待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度1开始诱导，逐渐提速，诱导后每隔4hr留样离心-20℃冻存，诱导48hr结束。
样品检测SDS-PAGE、蛋白含量。
发酵罐编号
实验条件
1
pH：
3.5
2
pH：
4.0
3
pH：
4.5
12345678910111213141516171819202122232425
1、17：
Marker（从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD）
2~8：
依次为pH3.5下诱导0、8、16、24、36、44、48hr
9~16：
依次为pH4.0下诱导0、8、16、24、36、44、48hr
18~25：
依次为pH4.5下诱导0、8、16、24、36、44、48hr
图4.发酵pH参数优化电泳图
结论：
从电泳结果来看，与摇瓶结果有差异的是：
最佳诱导pH=3.5。
根据文献资料及经验，可能选用更低的pH（3.0）可能会得到更好的表达水平，下一步将采用更低的pH进行对比。
2.3诱导最佳pH验证
方法：
取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:
10的比例二级接种于2瓶250mlBMGY的1L三角烧瓶中，培养4~8hr左右，上罐发酵初始pH5.0，诱导（如下表）、温度30℃、DO>35%，待溶氧上升后以10~15转度流加50%甘油300ml，待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度1开始诱导，逐渐提速，诱导后每隔4hr留样离心-20℃冻存，诱导48hr结束。
样品检测SDS-PAGE、蛋白含量。
发酵罐编号
实验条件（诱导前菌湿重）
1
pH3.0
2
pH3.5
HGH
HGH
1234567891011121314151617181920
1、13：
为marker（从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD）
2~10：
依次为pH3.0下诱导0、7、12、24、36、40、44、48hr
11~20（除13）：
依次为pH3.5下诱导0、7、12、24、36、40、44、48hr
图5.发酵pH参数优化电泳图
结论：
从电泳结果上来看，诱导pH3.0表达水平明显好于pH3.5，表明采用更低的诱导pH是完全可行及正确的。
另外，由于保护剂及诱导pH选择所解决的主要问题都是防止目的蛋白的降解，而我们仅通过改变诱导pH就达到了较高的表达水平，完全满足了工艺要求，考虑到这点及成本方面的原因，故原先准备摸索的保护剂实验可不予进行。
2.4发酵工艺稳定验证：
方法：
取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1:
10的比例二级接种于250mlBMGY的1L三角烧瓶中，培养4~8hr左右，上罐发酵初始pH5.0，诱导pH（下表）、温度30℃、DO>35%，待溶氧上升后以10~15转度流加50%甘油，待溶氧再次上升后用100%甲醇以转度1开始诱导，逐渐提速，诱导后每隔4hr留样离心-20℃冻存，诱导48hr左右结束。
样品检测SDS-PAGE、蛋白含量。
典型电泳图
12345678
hGH发酵结果SDS-PAGE电泳图
1.Marker（从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD）2.诱导前3～8：
诱导8~48小时，每隔8小时样品
结论：
通过本次实验，基本确定并验证了hGH的发酵工艺。
在此工艺条件下，hGH的表达水平稳定，表达量高，最终样品扫描结果显示，目的蛋白的表达量在60%以上，总量达到3g/L发酵液，而且没有明显的降解条带，这些都为纯化提供了极大的方便。
因此，可以说目前的发酵工艺是稳定、成熟而且高水平的。
第二部份：
rhGH纯化工艺研究
成熟人生长激素是一种由191个氨基酸组成的非糖基化蛋白质，hGH含有两个分子内二硫键，4个半胱氨酸，这两个分子内次级键对于形成正确的球性构象起了重要作用。
其分子量为22kD。
1、纯化实验室研究
1.1tube小试：
通过使用1.5mltube装载0.5ml各种不同层析介质（Q、DEAE、Heparin、CM、Phenyl），使用各种不同pH、缓冲体系、离子强度，摸索最佳层析初始条件。
介质
pH
缓冲体系
离子强度
Q、DEAE
Phenyl、CM、Heparin
4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0
醋酸、柠檬酸、PB、Tris-HCl
10mM、40mM、50mM
如选择CM-SerpharoseFF（Pharmacia）做层析介质，把样品的pH保持在rhGH的等电点之下，实验发现载样量很低，目的蛋白收率很低。
使用heparin、phenyl这两种介质不管在等电点之上还是之下，都出现载量低，目的蛋白收率低的情况。
如选择Q-SerpharoseFF或DEAE-Serpharose（Pharmacia）做层析介质，把样品的pH调至rhGH的等电点5.0之上，对rhGH载样量上有所提高，目的蛋白回收率也较高。
对比这两种阴离子介质，发现Q在载量上更有优势。
由于有文献报道rhGH在pH8.0之上容易产生酰胺化，而在Ph3.0之下时不利于该蛋白的活性。
选择Q－sepharoseFF做层析介质，在Ph6.0—7.5PB缓冲体系下载量高，并且分离效果好。
1.21ml预装柱、10-30ml填充柱小试
借鉴tube小试结果，进行1ml预装柱、10-30ml填充柱柱小试实验，进一步摸索Q并确定最佳层析条件（缓冲液浓度、流速、上样条件、载量、洗脱条件）。
使用1ml预装柱进行柱层析实验，考察不同pH、缓冲液下对目的蛋白结合的影响。
结果表明，缓冲体系为10mMPB,Ph7.5时蛋白的结合效果最佳,采用0.1MNaCl阶段洗脱可以较好洗下目的蛋白，提高目的蛋白纯度。
30%B
100%B
20%B
10%B
123456789101112131415
97kd
66kd
43kd
31kd
20kd
14kd
1上样前2穿透峰4为10%B洗下蛋白，5为10%B峰尖
通过实验我们选择了最佳的第一步层析条件：
介质为Q-SerpharoseFF、缓冲体系为10mMPB，Ph7.5，采用10％SolutionB阶段洗脱。
通过小试进一步摸索了第二步层析的一些基本条件：
介质
洗脱条件
缓冲体系
离子强度
Q
0-100％B，10CV
PB,Ph7.5
10mM
Phenyl
100％B直接洗脱
PB，Ph7.5
10mM＋1M（NH4）2SO4
1
12345678
2
hGH小试Q-sepharoseFF柱层析结果1-7为峰1不同部分洗脱，8为峰2高盐洗脱部分
将第一步层析洗脱得到的含目标蛋白的样品，再进行Q-sepharoseFF柱线形洗脱，从色谱图和电泳图看，杂质和目标蛋白没有明显的分离效果，主要集中在一个洗脱峰里。
但是将第一步层析洗脱得到的含目标蛋白的样品经过phenyl柱的分离后，得到了纯度为98％以上的目的蛋白。
见下图
1234567891011
rhGH
1：
proteinMarker；2：
上样前；3-6：
峰1；7：
峰2；8：
峰2峰3交叉；
9：
峰3；10：
峰3峰尖；11：
峰3后半部分
通过以上小试结果初步确定了一些基本条件：
将3K超滤后的样品进行第一步层析时，选用Q-sepharoseFF为层析介质,10mMPB，Ph7.5为上样缓冲液，采用10%SolutionB阶段洗脱目的蛋白；在第二步层析时，选用phenyl-sepharoseFF为层析介质,10mMPB+1M（NH4）2SO4，Ph7.5为上样缓冲液，并用10mMPB，Ph7.5作为洗脱缓冲液，经过两步层析后rhGH的纯度达到98%以上。
2.rhGH纯化中试研究:
借鉴实验室研究结果，进行层析条件的放大及优化，初步确定中试研究的工艺
123456
rhGH
97kd
66kd
43kd
31kd
20kd
14kd
hGH中试纯化Q柱SDS-PAGE电泳图
1.Marker4.10%B洗脱峰峰尖
2.上样前5-6：
洗脱杂峰
3.10%B洗脱峰
12345678
rhGH
14KD
20KD
31KD
43KD
66KD
97KD
hGH中试纯化phenyl柱SDS-PAGE电泳图
1.Marker5.Heparin洗脱目的蛋白峰
2.上样前6.超滤后
3.上样峰7.8Q柱上样峰即样品峰
4.洗脱杂峰
（i）Q-sepharoseFF洗脱目的蛋白峰
（i）phenyl柱洗脱目的蛋白峰
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