基因工程试验.docx
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基因工程试验
基因工程实验流程
实验一丹参总DNA勺提取
实验目的：
掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DN湖方法。
实验材料：
丹参叶片
实验器材：
台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，研钵和杵，离心管，微量移液器，枪头
实验步骤：
第一次使用前请先在漂洗液WEft结合液PQ中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！
取所需适量裂解液PL放置在65C预热，使用前加入6-筑基乙酿到终浓度2%
1.取适量植物组织（新鲜组织100mg或干重组织30m。
在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到一个1.5ml离心管，不要解冻，加600vl65C预热的裂解液PL（确认已加入6-筑基乙醇至2%）,剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头轻柔吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.65C水浴20-60分钟，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
可选如果组织干燥或者产量低，可以适当延长水浴时间。
如RNA^留多，可在水浴前加入6^iIRNA酶（20mg/ml）。
4.加入700M氯仿/异戊酿（体积比24:
1混合），颠倒充分混
匀几分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm离心5分钟。
若提取的
植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前用等体积酚/氯仿
（1:
1）抽提一遍。
5.小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管，注意不要吸到界面物质。
如上清比较浑浊，则需要重复步骤4一遍，直到得到透亮上清。
6.较精确估算上清量，加入1.5倍体积结合液PQ（请先检查是否已加入无水乙醇！
）后立刻涡旋，充分混匀。
此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
7.将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放-5-入收集管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液（先加700M离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。
8.加入500M抑制物去除液IR,12,000rpm离心30秒，弃废液。
9.加入700M漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!
）,12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
10.加入500M漂洗液WB12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
11.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙酿抑制下游反应。
12.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100M洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70C水浴中预热），室温放置3-5分钟12,000rpm离心1分钟。
将得到的
溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心
1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积，如果需要DNA^度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50vl,体积过小降低DN碱脱效率，减少DNA^量。
13.DNA可以存放在2-8C,如果要长时间存放，可以放置在一20°C。
按照植物总DNA提取试剂盒操作说明。
1%琼脂糖凝胶电泳检测
注意事项：
1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf5415C或者类似离心机。
2.开始实验前将需要的水浴先预热到65C备用。
3.需要自备氯仿/异戊酿（体积比24:
1混合）、无水乙醇和6
-筑基乙醇。
4.结合液PQ和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。
若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.不同来源的植物组织材料中提取DNA的量会有差异，一般100mg新鲜组织典型产量可达3-25vgo
6.洗脱液EB不含有螯台剂EDTA不影响下游酶切、连接等反应。
也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5,pH过低影响洗脱
效率。
用水洗脱DNA^该保存在—20Co
实验结果：
本组实验结果是第九孔和第十孔，其中第九孔的DNA
提取效果较第十孔提取效果好。
两空之间的差异可能是由于两个
离心管中添加的植物量不一样，所以最后提取的量不一样。
实验结果分析:
1.在液氮研磨叶片的时候，研磨不够充分，且在向离心管中添加
的时候，添加的量不多，速度慢，导致氧化，对提取效率造成很大影响。
2.可能是因为在提取DNA的最后步骤向吸附管中添加的洗脱液太多150ul,导致DNA的浓度过低，所以条带不亮。
3.在第九步中，将吸附柱放置室温晾干，可能晾置时间不足，导
致添加的有机溶剂没有完全挥发，而有机溶剂影响了DNA的提
取。
实验二质粒DNA的提取及酶切检测
实验目的：
学习和掌握小量提取质粒的方法。
实验原理：
质粒提取（碱裂解法）根据共价闭台环状质粒DNA
与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH12.0-12.6的碱性条件下，线性的染色体DNA变性，双螺旋解开，而共价闭环质粒DNA仍保持双链紧密缠绕的状态。
将pH
调至中性并保持高盐浓度的条件下，染色体DNA之间形成不落
性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS作用下形成沉淀，而共价闭环质粒DNA保持可洛状态，经离心可将大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质除去，质粒DNA留在上清液中，用酚、氯仿抽提，可进一步纯化质粒DNAo
实验材料：
含有pET28a质粒的大肠杆菌H5a;构建好的含有目的基因SRP的pET28a-SRP质粒的大肠杆菌DH5a实验器材：
离心机、水浴锅、电泳仪、离心管，微量移液器，枪头，等
实验步骤：
质粒提取按照试剂盒操作说明。
1.用1.5ml离心管收集1-5ml菌液。
12,000rpm离心1min,弃上清。
应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。
菌量过大可能导致洛菌不充分，纯化时会影响质粒纯度。
菌
体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。
2.250vl溶液I/RNaseA混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。
室温静置1-2min。
初次使用本试剂盒时，请将
RNaseA全部加入到溶液I中，均匀混合后于4C保存。
可保存6个月。
•不要残留细小菌块。
菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率
的高低。
•室温静置1-2min是为使溶液中的RNA被充分降解。
3.加入250vl溶液II,轻柔地反复颠倒混匀6-10次。
室温放置1-2min,使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
•若溶液H出现沉淀，请于37C保温溶解。
待恢复至室温后使
用。
沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。
•不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。
•此步骤不宜超过5min。
4.加入350vl溶液山，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。
此时会出现白色絮状沉淀。
5.12,000rpm室温离心10min,收集上清。
6.将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。
•如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积（800vl）,可将上清分次加入DNA纯化柱中。
7.12,000rpm离心1min,弃滤液。
•此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。
8.加入500M溶液PB/PE（去蛋白液），12,000rpm离心1min,弃滤液。
•此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获
得高质量质粒DNAo
9.加入500M溶液WB,12,000rpm离心1min,弃滤液。
•溶液W初次使用前用无水乙醇按1:
1.5稀释，即含60%乙醇。
10.加入500M溶液w,12,000rpm离心1min,弃滤液。
11.12,000rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体。
12.将DNA纯化柱置于新的离心管中。
向纯化柱中央处，悬空滴加50-100M溶液Eluent,室温放置2min。
•12,000rpm离心1min，管底即为高纯度质粒DNA。
质粒DNA
于-20C保存
•溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5。
溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而
o
酶切反应体系：
载体pET28a-SRP30ul
XhoI1ul
HindIII1ul
双酶切buffer5ul
超纯H2O13ul
37度，3小时。
电泳检测分析
注意事项；
1.使用前往准备好的solution中加入RNaseA；
2.浓缩的washbuffer用乙酿稀释；
3.所有步骤都在室温下操作。
实验结果:
实验结果分析
实验三目的基因的克隆
［实验目的］
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
［实验原理］
多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。
在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核昔酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
1,变性：
加热使模板DNA在高温下（94C）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2.退火：
使溶液温度降至50-60C，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。
3.延伸：
溶液反应温度升至72C，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核昔三磷酸（dNTP），按5,+3,方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该
增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：
DNA模板、反应缓
冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA弓I物、耐热Tag聚合酶。
［仪器、材料与试剂］
（一）仪器
1.PCR热循环仪2.琼脂糖凝胶电泳系统3.吸
头、0.2ulPCR管，微量移液器，
（二）材料：
质粒
（三）试剂
1.2XPCRMasterMix（含dNTP,Tag酶，缓冲液）
2.质粒DNA
3.弓I物（上、下游引物浓度均为约10umol/ul）
F:
5-CCCAAGCTTCTTTTTAATCCTTCCCTCAAATATC-3（HindIII）
R:
5-CCGCTCGAGGGGACAATGAAAAAGCTGATAAC-3（XhoI）
4.灭过菌的millipore水
5.琼脂糖
6.DNA相对分子质量标准物DL2000
［实验方法］
1.学习PCR仪的使用，设定反应程序：
反应程序为：
94C变性3min;94C变性30s,57C退火30
s,72°C延伸1min20s,30个循环；72C延伸8min。
4C保存
2.加样（冰上操作）：
50ul反应体系，其中上游引物1ul,下游引物1ul，丹参DNA
模板2ul或质粒DNA模板1ul,2XPCRMasterMix25ul,灭菌水
21或22ul
3.瞬时离心后在PCR仪上进行扩增反应。
4.电泳检测。
注意事项：
1.在PCR仪设定的时候要注意时间与温度，不要设置错误；
2.在加样的时候要确保加入的量准确，在冰上加样；
3.操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可
靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；
4.PCR之后最好能立刻电泳，不要隔夜。
实验四PCR产物从琼脂糖凝胶上的回收
仪器：
水浴锅，离心机，电子天平，微量移液器
试剂：
琼脂糖凝胶回收试剂盒
耗材：
Eppendorf管，大小枪头
实验步骤：
按照DNA®脂糖凝胶回收提取试剂盒操作说明。
1.在长波紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DN燎带切下，
尽量切除不含DNA勺凝胶，得到凝胶体积越小越好。
2.将切下含有DN成带凝胶放如1.5ml离心管，称重。
先称一个空1.5ml离心管重量，然后放入凝胶块后再称一次，两次重量相减，得到凝胶的重量。
3.加一到二倍体积溶胶/结合液DR如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100则加入100~200M溶胶液。
凝胶块最大不能超过400mg如果超过400mg请用多个离心柱，进行回收。
4.56°C水浴放置5min（或直至胶完全溶解）。
每1-2min涡旋震荡一次帮助加速洛解。
5.将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管
中），12000rpm离心30-60S,倒掉收集管中的废液。
如果总体
积超过750M,可分两次将溶液加入同一个吸附柱AC中。
6.加入700vl漂洗液WB12000rpnW心min,弃掉废液。
7.将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min,尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙酿抑制下游反应。
8.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中。
在吸附膜的中
间部位加50M洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70C水浴中加热效果更好），室温放置2min,12000rpm离心1min。
如果需要较多量DNA可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，
离心1min。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DN缺度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于30vl,体积过小降低了DNA洗脱效率，减少产量。
回收的PC产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，—20C保存或直接用于后续试验。
注意事项：
1:
保证是新胶新缓冲液浓度大小合适
2:
割胶大小要对，不要割错了条带，这很重要，
3:
短波紫外线（254）会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体，前者会使以后的链接与转化等实验失败，后者肯能造成基
因突变，给克隆工作带来麻烦，波紫外线，回收DNA时也要尽量短时照射，避免连续长时间照射
4:
回收时要尽量的柔缓，避免将DNA链弄断
5:
做胶时要尽量小薄，回收时割胶尽量少提高回收效率乙酿对回收的影响较大应注意吸干。
实验结果：
本组为第五孔
实验结果分析：
本组为第五孔。
DNA的提取量较大，且PCR较成功。
电泳中条带很亮很清晰，说明目的DNA已经被大量克隆，可以进行下一步PCR产物与T载体的连接。
PCR产物从琼脂糖凝胶上的回收这一步骤比较成功，主要
因为：
1.PCR的结果比较好，获得了大量的目的基因；
2.跑胶的时间以及胶自身制备好；
3.在切胶的时候，切得大小比较合适，所以提取的回收率较高。
实验五PCR产物与T载体的连接
［实验目的］
将通过PCR获得的目的基因与载体进行连接，可进一步用于测序和克隆等。
［实验原理］
所用的T载体为线装载体，其两端分别有突出的一个T;而
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PCR产物在其两端各有一个A末端，因此，可将目的基因与载体连接起来。
而且T载体中含有LacZ基因，如果有外源基因的插入，则LacZ基因被破坏，便于通过蓝白斑进行后面的筛选。
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［实验试剂］
pGEM-T载体、T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液、
回收的PCR产物
［实验方法］
1.将pGEM-T载体于离心机上进行短暂的离心，使载体都
位于管低;
2.于Eppendorf管中加入5ulT4DNA连接酶缓冲液、1ulpGEM-T载体、1ulT4DNA连接酶、3ul回收的PCR产物；
3.将所加的物质于离心机上稍加离心，充分混匀，室温保育
3小时或4°C过夜（效果更好）。
注意事项：
1.使用之前，将pGEM-T载体于离心机上进行短暂的离心。
2.所有的样品再添加的时候都应该在冰上操作，保持样品的活性。
加量的时候要准确。
3.将所有的物质充分混匀，使其充分接触，提高连接效率。
4.放在PCR仪中过夜，使其充分连接。
实验六重组载体转化大肠杆菌
［实验目的］
将质粒DNA转化到大肠杆菌中。
［实验试剂］
LB培养基（固体和液体）Amp（10mg/mL）
X-Gal（20mg/ml）IPTG（0.2mg/ml）感受态细胞DH5a
［实验器材］
摇床，离心机、水浴锅
［实验步骤］
1.取感受态细胞DH5a（100uL）用时在冰上缓慢解冻10min后立即使用。
2.每管中加入PCR与T载体的连接产物（10uL）。
于冰上保温40min。
3.于42C热激80s,中间保持静止。
4.迅速在冰上冷却2min,而后加入400-500ulLB液体培养基，37C100—120rpm振荡培养40-60min。
5.将细菌铺布于含IPTG/X-Gal（4ul/40ul）的LB固体培养基（含Amp50ug/ml）上，在37C培养过夜。
于24小时内挑取白色单菌落，在含Amp50ug/ml的LB液体培养基中过夜培养。
注意事项：
1.制备感受态细胞的全部操作均须至于冰浴操作，同时注意近
火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染;
2.42C热处理时很关键，转移速度要快且温度要准确；
3.菌液涂皿操作时，避免反复来回涂步，因为感受态细胞壁发
生了变化，过多的机械挤压会使细胞破裂，影响转化率。
实验结果：
LB固体培养基（含Amp50ug/ml）上，在37C培养过夜之后没有长出单菌落，实验失败。
实验结果分析：
单菌落没长出来，原因可能有
（1）PCR产物与T载体的连接实验没有做好，产物没有很好与
载体连接，导致重组载体转化大肠杆菌失败；
（2）感受态细胞需要在冰上加样，可能在实验过程中将感受态
细胞取出，使其感受态受到影响；
（3）实验在混匀的时候使用漩涡混匀器，可能对细胞有破坏。
实验七阳性克隆检测——菌落PCR
［实验目的］将通过PCR检测重组大肠杆菌的正确性。
［实验原理］菌落PCR与我们通常的普通的PCR的不同在于，不用提取基因组DNA，而是直接以菌体热解后暴露的DNA
直接为模板进行PCR扩增，是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的实验方法。
该方法操作简单，快捷，阳性率较高，常用于在转化鉴定中。
［实验试剂］
1.2XPCRMasterMix（含dNTP,Tag酶，缓冲液）
2.菌液
3.弓I物（引物溶液浓度10pmol/L）
F:
5-CCCAAGCTTCTTTTTAATCCTTCCCTCAAATATC-3（HindIII）
R:
5-CCGCTCGAGGGGACAATGAAAAAGCTGATAAC-3（XhoI）
4.灭过菌的millipore水
5.琼脂糖
6.DNA相对分子质量标准物DL2000
［实验操作］
1.取菌液20ul,100C水浴10min（或在PCR仪（反应程序为：
100°C变性10min;4C保存））。
2.PCR体系配制加样（冰上操作）
20ul反应体系，其中上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，煮沸后菌液2ul,2XPCRMasterMix10ul,灭过菌的millipore水7ulo
3.设定PCR反应程序：
反应程序为：
94C变性3min;
94C变性30s,57C退火30s,72C延伸1min20s,30个循环；
72°C延伸8min。
4C保存
4.瞬时离心后在PCR仪上进行扩增反应。
5.电泳检测。
实验八原核表达载体pET28a-SRP的构建
实验目的：
学习和掌握原核表达载体的构建方法与流程。
实验原理：
通过目的基因及表达载体的酶切、酶连反应，构建重组表达载体pET28a-SRP并将其导入大肠杆菌M15菌株。
实验材料：
重组载体pGEM-T-SRP，目的基因PCR克隆的凝胶回收产物，载体pET28a。
实验步骤：
1.双酶切（50ul反应体系）
（1）PCR凝胶回收产物30ul,XhoI1ul,HindIII1ul,buffer
5ul,H2O13ul
（2）载体pET28a30ul,XhoI1ul,HindIII1ul,buffer5ul,
H2O13ul
37度，反应3小时。
2.电泳检测，凝胶回收（按照凝胶回收试剂盒操作说明）
注：
双酶切体系
（1）回收约1000bp的目的基因，
（2）将双酶切的pET28a回收。
3.连接反应
于Eppendorf管中加入1ulT4DNA连接酶缓冲液、1ulT4
DNA连接酶、5ul酶切后回收的pET28a载体、3ul回收的目的基因，瞬时离心。
16度，3小时或4度，过夜。
4.连接产物转化大肠杆菌M15（方法参照实验六）
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实验九原核表达载体的诱导表达及目的蛋白的检测
目的：
学习原核表达的诱导原理和方法。
原理：
将外源基因克隆在含有lac启动子的pET28a表达载体中，让其在E.coli中表达。
先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与
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