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酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（ELISA）

1.定义

酶联免疫吸附测定法（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），简称ELISA，采用抗原和抗体特异反应将待测物和酶连接，然后通过酶和底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析一种检测方法。

2.原理

采用抗原和抗体特异反应将待测物和酶连接，然后通过酶和底物产生颜色反应，可对受检物质定性或定量分析。

2.1抗原抗体反应

2.1.1可逆性

抗原和抗体结合形成抗原抗体复合物过程是一种动态平衡，其反应式为：

Ag+Ab→Ag·Ab

抗体亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：

K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab解离程度和K值有关。

高亲和力抗体抗原结合点和抗原决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。

解离后抗原和抗体均能保持原有结构和活性。

2.1.2特异性

抗原抗体结合发生在抗原决定簇和抗体结合位点之间。

化学结构和空间构型互补关系，具有高度特异性。

因此，在很多时候，测定某一特定物质不需分离待测物。

2.1.3最适比例

只有当抗原抗体浓度比例是当时，才出现可见反应。

以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）

图

（1）

该理论支持者网格学说，其成立三个条件：

Ø抗原多价，抗体双价；

Ø二则比例合适；

ØAg/Ab过剩。

当抗原抗体浓度比例合适时，抗体两个Fab段分别结合两个Ag分子，相互交叉结合连接成巨大网格状立体聚合物，沉淀可见，如图b。

Ab/Ag过剩时，过剩方结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物，沉淀不可见，如图a，c，d。

图

（2）

2.1.4敏感性

化学比色法敏感度为mg/mL水平；酶反应测定法敏感度约为5-10μg/mL；免疫测定中凝胶扩散法和浊度法敏感度和酶反应相仿；标记免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mL水平。

如HBsAg，其敏感度可达0.1ng/mL。

2.2免疫测定在临床检验中应用

由于各种抗原成分，包括小分子半抗原，均可用以制备特异性抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可测试标本中抗原，因此免疫测定应用范围极广。

3.ELISA类型

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

在这种测定方法中有三个必要试剂：

Ø免疫吸附剂：

固相抗原或抗体；

Ø结合物：

酶标记抗原或抗体；

Ø底物：

酶催化此物。

常见检测方法有：

双抗体夹心测抗原、

3.1双抗体夹心法测抗原：

图（3）

此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。

只要获得针对受检抗原特异性抗体，就可以用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

3.2双抗原夹心法测抗体

用特异性抗原进行包被和制备酶标结合物。

此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。

乙肝标志物中抗HBsAg检测常采用本法。

本法关键在于酶标抗原制备，应根据抗原结构不同，寻找合适标记方法。

3.3间接法测抗体

间接法优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体方法。

3.4竞争法测抗体

图（4）

当抗原材料中干扰物质不易除去，或不易得到足够纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。

3.5竞争性测抗原

小分子抗原或半抗原缺乏可作为夹心法两个以上位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。

其原理是标本中抗原和一定量酶标抗原竞争和固相抗体结合。

标本中抗原含量越多，结合在固相上酶标抗原越少，最后显色也越浅。

小分子激素、药物等多用此法。

3.6捕获包被法测抗体

以IgM抗体为例。

血清中针对某些抗原特异性IgM常和非特异性IgM，以及特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM测定。

捕获法则较好地解决了上述问题，其原理是先用抗人IgM（μ链）抗体包被固相载体，使血清中所有IgM（包括特异性和非特异性IgM）均固定在固相上，经洗涤去除IgG后，再测定特异性IgM。

此方法目前主要用于检测各类早期感染特异性抗体IgM。

3.7ABS-ELISA法

ABS为亲和素（avidin）生物素（biotin）系统（system）略语。

亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合亚基组成。

生物素为小分子化合物，分子量244。

用化学方法制成衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可和蛋白质和糖等多种类型大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。

生物素和亲和素结合具有很强特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。

由于一个亲和素可和4个生物素分子结合，因此如把ABS和ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。

两者均以生物素标记抗体（或抗原）代替原ELISA系统中酶标抗体（抗原）。

在LAB中，固相生物素先和不标记亲和素反应，然后再加酶标记生物素以进一步提高敏感度。

在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，和聚苯乙烯载体吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。

从链霉菌中提取链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者趋势。

由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。

4.ELISA试剂组成

ELISA试剂中有三个必要组成部分：

免疫吸附、结合物、酶底物。

常见组成如下：

Ø已包被抗原或抗体固相载体（免疫吸附剂）；

Ø酶标记抗原或抗体（结合物）；

Ø酶底物；

Ø阴性对照品或阳性对照品，参考标准品；

Ø结合物及标本稀释液；

Ø洗涤液；

Ø酶反应终止液；

4.1固相载体：

聚苯乙烯具有较强吸附蛋白质性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍能保留原来免疫学活性。

聚氯乙烯，对蛋白质吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

良好ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一条各孔之间性能相近。

4.2包被方式

将抗原或抗体固定在固相载体上过程称为包被。

蛋白质和聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合，靠是蛋白质分子结构上疏水基团和固相载体表面疏水基团间作用。

这种物理吸附是非常特异性，受蛋白质分子量、等电点、浓度等影响。

大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。

不易吸附非蛋白质抗原，可用间接包被抗原经固相抗体亲和层析作用，包被在固相上抗原纯度大大提高，因此含杂质较多抗原也可采用捕获包被法。

亲和素生物素，即用亲和素先包被载体，加入生物素化DNA,这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质定量测定。

脂类物质，无法和固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。

优点：

试验特异性、敏感性均由此得以改善，重复性也好，抗原用量少，仅为直接包被1/10乃至1/100。

4.3包被用抗原：

天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。

合成多肽抗原是抗原决定簇氨基酸序列人工合成多肽片段。

一般只含有一个抗原决定簇，纯度高、特异性也高。

但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。

借助于偶联物和固相载体吸附，间接地结合到固相载体表面。

包被用抗体：

IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联接发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。

取材于抗血清或含单克隆抗体培养液，须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验特异性。

腹水中单抗浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。

在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好效果。

4.4包被条件：

Ph9.6碳酸盐缓冲液；

pH7.2磷酸盐缓冲液；

Ph7-8Tris-HCl缓冲液；

加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。

包被浓度随载体和包被物性质可能有很大变化，每批材料需通过实验和酶结合物浓度协调选定。

一般蛋白质包被浓度为10ng/mL-20ug/mL。

封闭：

在包被后，用高浓度无关蛋白质溶液再包被过程。

封闭让大量无关蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后步骤中干扰物质再吸附。

常用封闭剂：

0.05%-0.5%BSA；10%小牛血清或1%明胶；脱脂奶粉，比较价廉，可以用高浓度（5%）。

4.5洗涤液：

在板式ELISA中，常用稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。

4.6结合物：

即酶标记抗体（或抗原）是ELISA中关键试剂。

4.7酶催化性；

抗体（抗原）免疫活性；

含有或少含有游离抗体（或抗原）；

结合物要有良好稳定性。

结合物用抗原和抗体

制备结合物时所用纯度较高IgG，以免在和酶联结时其他蛋白干扰。

最好用层析纯化抗体，这样全部酶结合物均具有特异免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本地浅淡。

在ELISA中用酶标抗原模式不多，总要求是抗原必须是高纯度。

酶

纯度高，催化反应转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同酶。

酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。

在ELISA中有HRP,AP,葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。

HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。

4.8结合物制备

酶标记抗体制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。

戊二醛交联法：

戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶和蛋白质氨基酸通过它而联结。

有效（结合率达60%-70%）和重复性好。

但是交联反应是随机，结合物大小不一，酶和酶，抗体和抗体之间也有可能交联，影响效果。

过碘酸氧化法：

适用含糖量较高酶。

过碘酸钠将HRP分子表面多糖氧化为醛基很活泼，可和蛋白质上氨基形成chiff氏而结合。

简单有效。

结合物中混有游离酶一般不影响ELISA中最后酶活性测定，但会和酶标抗体竞争相应固相抗原，因此制备酶结合物应予纯化，去除游离酶和抗体后用于检测，效果更好。

制得结合物，最适工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低本底，并获得测定最佳灵敏度，达到最合适测定条件和测定费用节省。

4.9结合物保存

酶和抗体均为生物活性物质，易失活。

高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。

结合物溶液中加入等体积甘油，加入蛋白保护剂。

另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳汞，AP结合物可加叠氮钠）。

结合物稀释液

用于稀释高浓度结合物以配成工作液。

为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：

0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐温20。

试剂盒均已用合适缓冲液配制成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。

4.10酶底物

1）HRP底物

DH2+H2O2

D+2H2O

上式中，DH2为受氧体，H2O2为受氢体。

DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色产物。

DH2如邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS。

OPD氧化后产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用底物。

TMB经HRP作用后产物显蓝色。

TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需和H2O2溶液混合即成应用液。

酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。

ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。

HRP对氢受体专一性很高，仅作用于H2O2、小分子醇过氧化物和尿素过氧化物。

AP底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。

产物为黄色对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。

用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。

AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物比色法。

4.11酶反应终止液

常用HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

对照设定

阳性对照品和阴性对照品是检验试验有效性控制品，同时也作为判断结果对照。

阳性对照品基本组成应尽量和检测标本组成相一致，多以含蛋白保护剂缓冲液为基质。

加入量应和试剂敏感度想称；

在测定中得到吸光值和受检标本吸光值比较，可以估计标本物质量。

阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。

例如HBsAg检测阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。

4.12参考标准品

定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用参考标准品，应包括覆盖可检测范围4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂缓冲液中。

标本采取和保存

体液、分泌物、排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。

以血清标本为例，血浆含有纤维蛋白原、抗凝剂，其他成份同血清。

血清标本应避免溶血。

红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性物质，以HRP为标记ELISA测定中，可能会增加非特异性显色。

基本操作注意事项

4.13加样：

在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本，加酶结合物，加底物。

加样时应将所加物加在ELISA板孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

4.14保温

抗原抗体完全反应保温过程称为温育。

ELISA属于固相免疫测定，抗原、抗体结合只在固相表面上发生。

温育常常用温度有43℃、37℃、室温和4℃等。

37℃是实验室中常用保温温度，也是大多数抗原抗体结合合适温度。

4.15保温方式：

ELISA仪器附有特制电热块、水浴。

若用保温箱：

ELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿纱布，最后将ELISA板都放在湿纱布上。

反应板均不宜叠放，以保证格板温度都能迅速平衡。

4.16室温温育反应

操作时室温应严格限制在规定范围内，标准室温温度是指在20-25℃，但具体操作时可根据说明书要求控制温育。

应注意温育温度和时间应按规定力求准确。

为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

4.17洗涤

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，却也决定着实验成败。

ELISA洗涤：

达到分离游离和结合酶标记物目。

清除残留在板孔中游离物质，以及非特异性地吸附干扰物质。

聚苯乙烯等塑料对蛋白质吸附是普遍性，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附干扰物质洗涤下来。

可以说，在ELISA操作中，洗涤是最主要关键技术。

洗涤方式除某些ELISA仪器配有特殊自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种。

1）流水冲洗式

流水冲洗法最初用于小珠载体洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。

洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。

已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板洗涤。

让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。

2）浸泡式

微量滴定板多采用。

洗涤液为非离子型洗涤剂中性缓冲液。

聚苯乙烯载体和蛋白质结合是疏水性，非离子型洗涤剂既含有疏水基团，也含有亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。

4.18显色

显色是酶催化无色底物生成有色产物温育反应。

反应温度和时间仍然是影响显色因素。

在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间延长而呈色加强。

适当提高温度有助于加速显色进行。

TMB受光照影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。

但为保证试验结果稳定性，最好在规定适当时间阅读结果。

TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。

4.19比色

拭干板底附着液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。

以蒸馏水校准零点，测量读取底物孔（未经任何反应仅仅添加底物溶液孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程孔），以记录本次试验试剂状况。

其后可用空白孔以蒸馏水校准零点，以上各孔吸光度需减去空白孔吸光度，然后进行计算。

结果以光密度（oplicaldensity,OD）,先按规定用吸光度（absorbence,A），两者含义相同。

通常表示方法是，将吸收波长写于A字母右下角，如OPD吸收波长为492nm，表示方法为“A492nm”或“OD492nm”。

4.20酶标比色仪

酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISA光度计。

针对固相载体形式不同，各有特制适用于板、珠和小试管设计。

酶标仪主要性能指标有：

测读速度、读数准确性、重复性、精确度和可测量范围、线性等等。

优良酶标仪读数一般可以精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。

操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。

测读A值时，要选用产物敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。

有酶标仪可用双波长式测读。

各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。

4.21结果判定

定性测定结果判断做出“有”或“无”回答，分别用“阳新”、“阴性”表示，在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈现阳性反应最高稀释度即为滴度。

根据滴度高低，可以判断标本反应性强弱，这比观察不稀释标本显色深浅判断强阳性、弱阳性更有意义。

在间接法和夹心法ELISA中，阳性孔显色比阴性孔深。

竞争法则相反，阴性孔显色比阳性孔弱。

两种类型反应结果判断方法不同。

1）间接法和夹心法

A．阳性判断值：

cut-offvalue，一般为阴性对照A值加上一个特定常数（0.05），以此作为判断结果阳性或阴性标准。

B．标本/阴性对照比值：

在实验条件（包括试剂）较难保证恒定情况下，这种判断法比较合适。

在得出标本（S）和阴性对照（N）A值后，计算S/N值。

2）竞争法

因肉眼很难辨别弱阳性反应和阴性对照显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N吸光值。

a.阳性判定值法

阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

　　阳性A≤阳性判定值

　　阴性A＞阳性判定值

b.抑制率法

　抑制率（%）=（阴性对照A值-标本A值）×100%/阴性对照

阳性抑制率≥50%为

阴性＜50%

4.22定量测定

ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体包被难达到各个孔之间一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度参考标准品在相同条件下制作标准曲线。

测定大分子量物质夹心法ELISA，标准曲线范围一般较宽，曲线值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较直线部分是最理想检测区域。

4.23ELISA操作要点

严谨设计，优质试剂，正确操作和良好仪器是保证ELISA必要条件。