突变型与野生型TNF.docx

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突变型与野生型TNF

突变型与野生型TNF

【关键词】,肿瘤

ApoptosisoftumorcellsinducedbymutantandwildtypeTNFα

　　【Abstract】AIM:

Tocomparetheapoptosisinducedabilityofrecombinanthumanmutanttype471rhTNFα（mt471rhTNFα）withthatofwildtyperhTNFα（wtrhTNFα）andtostudytheapoptoticmechanisminducedbymt471rhTNFα.METHODS:

TheapoptosisofZR751cells,abreastcancercellline,inducedbymt471rhTNFαorwtrhTNFαwasanalyzedandcomparedby20g/Lagarosegelelectrophoresisandflowcytometrytechniques.TheactivationprofilesofnuclearfactorNFκBinZR751cellsuntreatedandtreatedbymt471rhTNFαorwtrhTNFαweredetectedusingTransAMTMNFκBp65kitbasedonELISAforfurtherstudyoftheapoptoticmechanisminducedbymt471rhTNFα.RESULTS:

Theresultsfrom20g/LagarosegelelectrophoresisofgenomicDNAindicatedthatZR751cellstreatedbymt471rhTNFαprovidedatypicalapoptoticladderpatternofDNAfragmentation,whereasweakenedladderswereobservedinZR751cellstreatedbywtrhTNFα.Flowcytometryshowedthatthecellapoptoticrateinmt471rhTNFαtreatedgroupwas43%,but25%inwtrhTNFαtreatedgroup.Themt471rhTNFαheldastrongapoptosisinducibleability.TheresultsofDNAbindingactivityofNFκBshowedthatNFκBactivationinducedbywtrhTNFαwassignificantlyhigherthanthatofmt471rhTNFαwhentheproteinconcentrationofmt471rhTNFαorwtrhTNFαreached50μg/L（P=.CONCLUSION:

Theapoptosisinducedabilityofmt471rhTNFαissuperiortothatofwtrhTNFα.OneofthepossiblereasonsfortheenhancedapoptosisinducedabilitymaybethatNFκBactivationisinhibitedintumorcellstreatedwithmt471rhTNFα.

　　【Keywords】neoplasms;mutanttype471rhTNFα;wildtyperhTNFα;NFkappaB;apoptosis

　　【摘要】目的：

比较重组人突变型471rhTNFα（mt471rhTNFα）与野生型rhTNFα（wtrhTNFα）诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力，并对mt471rhTNFα诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究.方式：

以乳腺癌细胞系ZR751细胞为靶细胞，应用基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析mt471rhTNFα与wtrhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的情形；利用以ELISA为基础的TransAMTMNFκBp65试剂盒检测经mt471rhTNFα或wtrhTNFα处置的ZR751细胞核因子NFκB的活化情形，以便对其诱导凋亡的机制进行初步的研究.结果：

20g/L琼脂糖凝胶电泳显示，mt471rhTNFα处置组的ZR751细胞基因组DNA呈现明显的ladder状散布，wtrhTNFα处置组的“ladder”条带明显减弱；流式细胞仪分析显示，mt471rhTNFα诱导的细胞凋亡峰面积高于wtrhTNFα处置组.NFκB活化检测结果显示，当两型rhTNFα浓度增高到50μg/L时，wtrhTNFα处置组的NFκB的活化量明显高于同浓度的mt471rhTNFα处置组（P=）.结论：

mt471rhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显优于wtrhTNFα；肿瘤细胞内NFκB活化明显受抑是mt471rhTNFα诱导凋亡能力增强的要紧缘故之一.

　　【关键词】肿瘤；突变型471rhTNFα；野生型rhTNFα；NFκB；细胞凋亡

　　0引言

　　人肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactoralpha,TNFα），要紧由巨噬细胞产生，是具有多种生物学活性的细胞因子.mt471rhTNFα是删除wtTNFαN端的7个氨基酸，并将Pro8Ser9Asp10置换为Arg8Lys9Arg10［1］的突变体.这种突变并非改变TNFα分子的高级结构，仍然形成具有生物活性状态的三聚体，抗肿瘤作用增强且毒副作用降低，极具开发价值.咱们在取得mt471rhTNFα重组蛋白的基础上［2-4］，进行新的研究，为mt471rhTNFα的临床前研究提供实验依据.

　　1材料和方式

　　材料

　　两种基因工程蛋白在大肠杆菌DH5α中进行表达，初步检测具有良好的生物学活性.乳腺癌细胞系（ZR751）为本室保留.细胞培育基RPMI1640系GIBCOBRL产品，FCS购自杭州四季青生物技术公司.TransAMTMNFκBp65Kit由晶美生物工程提供.胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒由碧云天生物技术研究所提供.

　　方式

　　确信mt471rhTNFα与wtrhTNFα浓度蛋白溶解液溶解冷冻干燥蛋白，按1∶100稀释，测定280nm和260nm下的A值，确信蛋白的浓度；另取10μL加等体积2×蛋白电泳载样液，行150g/LSDSPAGE凝胶电泳，BackMan光密度扫描仪进行薄层扫描，以确信目的蛋白的含量.

　　两型rhTNFα诱导细胞凋亡苏醒ZR751细胞，传代培育至对数生长期，胰蛋白酶消化，Hank's液终止消化，搜集细胞，并调整细胞数至2×108/L.将细胞分为3组，即ZR751对照组、wtrhTNFα和mt471rhTNFα处置组.培育基中放线菌素D的终浓度为μg/L，样品终浓度为mg/L，于加药后12h搜集细胞.将细胞分为两部份，一部份用于20g/L琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，另一部份用于流式细胞分析，以PBS洗涤细胞，RNase降解RNA,700mL/L乙醇固定，待用.检测时，PBS洗涤以弃除700mL/L乙醇，空干，碘化丙啶（PI）避光染色15min以上.PBS洗涤后，将细胞从头悬于1mLPBS中，用EPICSELITE,COULTER,USA型流式细胞仪分析比较两型TNFα诱导细胞凋亡的情形.

　　核蛋白的提取并定量按的处置方式苏醒并传代ZR751细胞，但样品终浓度别离为10μg/L和50μg/L，作用4h后搜集细胞，别离提取各实验组的细胞核蛋白质，操作按试剂盒说明书进行，即：

用PBS洗涤细胞，20μL细胞沉淀加入200μL细胞浆蛋白抽提试剂，振荡5s将细胞沉淀充分悬浮，加细胞浆蛋白抽提试剂B10μL.高速振荡5s，冰浴1min.4℃,12～16kg,离心5min，吸取上清至预冷的塑料管中，即为细胞浆蛋白.在沉淀中加入50μL细胞核蛋白抽提试剂，猛烈振荡15~30s，把沉淀完全悬浮.冰浴，每隔1~2min再高速猛烈振荡15~30s，共30min.4℃,12～16kg,离心10min，吸取上清至预冷的塑料管中，即为细胞核蛋白，紫外分光光度计下进行蛋白定量，-70℃冻存.

　　基于ELISA法的NFκB活性检测操作依照TransAMTMNFκBp65试剂盒说明书进行，简介如下：

加入3μg的细胞核蛋白抽提物，室温孵育1h，期间温和摇动96孔板，使之均匀地结合；用200μL的洗涤buffer洗涤3次，加入100μL以1∶1000稀释的NFκB抗体，勿摇动，室温下孵育1h；用200μL的洗涤buffer洗涤3次，加入100μL以1∶1000稀释的辣根过氧化物酶聚合的二抗，室温下孵育1h；用200μL的洗涤buffer洗涤4次，室温下每孔中加入100μL的展呈液，及时观看颜色的转变，直到培育基的颜色变成深蓝色时加入100μL的终止液，遇酸时，蓝色变成黄色，测定450nm下的A值.利用试剂盒中提供的突变寡核苷酸进行NFκB特异性结合为对照.

　　统计学处置：

以SPSS软件进行统计学分析，两实验组NFκB的活性检测分析采纳t查验，P<以为有统计学不同.

　　2结果

　　471rhTNFα与野生型rhTNFα的浓度由两样品的SDSPAGE结果及BackMan光密度扫描仪薄层扫描结果可知，目的蛋白的纯度为%和%；紫外分光光度法测定A280nm和A260nm吸光度值，可知wtrhTNFα蛋白的产量为g/L,mt471rhTNFα蛋白的产量为g/L.

　　诱导ZR751细胞凋亡的检测ZR751细胞在含有放线菌素D的培育液中，在mt471rhTNFα与wtrhTNFα处置组中，别离加入10μg/L的mt471rhTNFα与wtrhTNFα，别离经两样本作用12h后，进行细胞基因组DNA20g/L琼脂糖凝胶电泳.mt471rhTNFα组的细胞基因组DNA降解成不同倍数的180~200bp大小的片段，呈现明显的ladder状散布（Fig1）.

　　流式细胞仪检测ZR751细胞凋亡与对照组相较，尽管两实验组均有凋亡峰显现，但mt471rhTNFα诱导的凋亡峰面积占43%，wtrhTNFα诱导凋亡峰面积占25%,mt471rhTNFα诱导的凋亡峰面积高于同浓度wtrhTNFα诱导组，对照组未见凋亡峰.

　　不同实验组ZR751中的NFκB活性实验中，咱们选择了不同的TNFα浓度处置ZR751细胞，实验结果可知（n=3）当两型rhTNFα以浓度为10μg/L作用于ZR751细胞4h后，与对照组A均值±相较，wtrhTNFα和mt471rhTNFα处置组的NFκB活化均有增加，其A均值别离为±和±,wtrhTNFα处置组的NFκB活化增加量高于mt471rhTNFα处置组（t=,P=）；当两型TNFα浓度增高到50μg/L时，wtrhTNFα处置组的增加量明显增多其A均值为±，而mt471rhTNFα处置组仅有轻度升高，A均值为±，两实验组间有显著不同（t=,P=）；当样品的浓度为100μg/L时，专门是mt471rhTNFα处置组的细胞有明显的死亡，未见到明显的NFκB活性改变；另外，两个实验组均未见到NFκB活化量随TNFα作历时刻的延长而增加，在必然浓度范围的TNFα作用下，细胞NFκB的活化有剂量依托性.　　3讨论

　　咱们在取得高纯度和高活性mt471rhTNFα的基础上，对两型TNFα诱导肿瘤细胞凋亡的能力及相关机制进行了初步比较研究.研究发觉，mt471rhTNFα杀伤肿瘤细胞的作用是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡实现的，与wtrhTNFα相较，mt471rhTNFα诱导ZR751细胞发生凋亡的作用明显增强.分析mt471rhTNFα诱导凋亡能力增强的要紧因素可能与以下因素有关：

第一，TNFα作用于不同亚型的受体（TNFR1和TNFR2）能够激活不同的信号传导途径.已有的研究报导mt471rhTNFα由于在N端进行了缺失突变和氨基酸置换，与TNFR1的亲和力显著提高，对TNFR2的亲和力降低［1］.存在于大部份细胞表面的TNFR1是一个含有死亡域（deathdomain）的受体，接头蛋白TNFRⅠ相关死亡域蛋白（TRADD）与TNFR1分子的胞内死亡域部份相结合，而TRADD随后又引发的另一个接头蛋白Fas相关死亡域蛋白（FADD）的招募，因此形成了诱导凋亡的信号传导复合物，此复合物通过caspase8的活化启动了凋亡.第二，要紧表达在髓性细胞和受刺激的T或B淋巴细胞表面的TNFR2，能够激活NFκB，具有抗凋亡的作用并引发全身毒副作用［5,6］.为了进一步分析本实验中肿瘤细胞的凋亡是不是与NFκB的活化有关，咱们采纳TRANSAMNFκB转录因子测定试剂盒，此法较凝胶分析更为灵敏，它是以ELISA为基础，将NFκB的p65亚单位结合位点的共有序列，即5′GGGACTTTCC3′包被于96孔板上，细胞核蛋白中转录因子NFκB的活化形式能够与此寡核苷酸特异性结合，而识别转录因子的一抗那么与转录因子结合，再用抗IgG偶联物和显色反映，容易患到定量的结果.实验中，wtrhTNFα处置组的NFκB的活化量显著高于mt471rhTNFα处置组，此结果证明了mt471rhTNFα与TNFR2的结合力降低，使NFkB的活化受到抑制这一假想.wtrhTNFα在与TNFR1或TNFR2结合时并无明显的选择性，它与受体结合后不仅介导凋亡信号的发生，同时也具有部份活化NFkB的作用，因此，wtrhTNFα只能够引发轻微的凋亡；而mt471rhTNFα与TNFR2的亲和力降低，造成NFκB的活化量明显减少，引发大量的靶细胞发生凋亡，因此mt471rhTNFα可能具有更强的抗肿瘤作用.研究以为，NFκB是一种普遍散布的多效性的核因子［7,8］，它能够调剂一些编码细胞因子、细胞黏附分子和生长因子的基因表达［9］，为大部份肿瘤细胞提供有重要意义的生存蛋白，如IAP家族、survivin蛋白等；激活凋亡抑制基因的转录，如cmyc，CD40L等，抑制了肿瘤细胞的凋亡而增进其生存.目前，NFκB已经成为人们紧密关注的抗癌药物医治的靶点.咱们推测mt471rhTNFα是通过下调NFκB的抑凋亡能力，而拥有了相对较强的抑制细胞生长、诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力.值得注意的是细胞凋亡并非只是线性通路，而更可能存在凋亡信号分子彼此阻碍的环性通路.尤其是半胱天冬氨酸酶、线粒体膜Bcl2家族和细胞色素C间存在的彼此作用，使得上游分子和下游分子的凋亡信号能够呈环形级联放大，也能够由一些抑制凋亡的分子如Bcl2等阻断这种环形放大的级联效应，从而有效地抑制凋亡［10］.因此，究竟mt471rhTNFα是不是存在其它诱导肿瘤凋亡的机制，有待于咱们进一步的研究.

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