学位论文一株猪链球菌的分离与鉴定.docx

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学位论文一株猪链球菌的分离与鉴定

毕业论文

一株猪链球菌的分离与鉴定

IsolationandidentificationofStreptococcussuis

目录

摘要：

1

前言3

1材料与方法4

1.1病原菌分离及镜检4

1.2相关试剂及培养基4

1.2.1相关试剂4

1.2.2培养基4

1.2.3标准菌株及实验动物5

1.3病原菌生化试验5

1.3.1糖发酵实验5

1.4药敏试验5

1.5病原菌PCR鉴定5

1.5.1引物5

1.5.2PCR模板的制备6

1.5.3PCR体系、条件及检测6

1.6病原菌毒力实验6

2结果与分析7

2.1镜检结果及分析7

2.2生化试验结果及分析8

2.3药敏试验结果及分析9

2.4PCR电泳结果及分析9

2.5毒力实验结果及分析10

3讨论12

参考文献13

致谢14

附录15

一株猪链球菌的分离与鉴定

摘要：

2型猪链球菌（Streptococcussuistype2，SS2）是一个重要的人兽共患病原菌，可引起猪败血症、脑膜炎及急性死亡，并可导致人感染并死亡。

猪链球菌2型感染已成为影响全世界养猪业的重要问题之一，全面了解猪链球菌的毒力和感染机制，有效预防和治疗2型猪链球菌感染已迫在眉睫。

本研究主要采用病料分离、镜检、PCR鉴定、药敏试验、生化试验、动物攻毒试验等对一株猪源链球菌进行分离鉴定，对其毒力、抗药性进行初步评估，为猪链球菌的深层研究提供参考依据。

关键词：

2型猪链球菌；鉴定；毒力

IsolationandidentificationofStreptococcussuis

DONGYa-li

Abstract:

Streptococcussuistype2（SS2）isanimportantswinepathogenandazoonoticagent。

Itcancausesepsis,meningitis,andacutedeathofpigs,andcanleadtohumaninfectionanddeath.Streptococcussuistype2infectionshavebeenoneoftheimportantquestionstothepigsindustryworldwide,ItisimminenttocomprehensivefingdingoutthevirulenceandinfectionmechanismsofStreptococcussuisandpreventionandtreatmentofSS2infectineffectively.Thisstudywithpurifiedmicroscopy,PCR,susceptibilitytesting,biochemicaltesting,drugtestingandotheranimalattackonthestreptococcusswinetype2toisolateandidentifieit.WeevaluatesomeofitsvirulenceandresistancetoprovidreferenceforthedeepresearchesofSS2.

Keywords:

Type2Streptococcussuis;Identification;Virulence

前言

猪链球菌病是链球菌属马链球菌兽疫亚种、马链球菌类马亚种、Lancefield分群中D、E、L群链球菌以及猪链球菌引起猪的疫病的总称,是一种常见的猪传染病，世界各国均有发生．危害性严重，也是一直困扰我国养猪业的重要传染病之一．猪链球菌（Streptococcussuis）是革兰阳性兼性厌氧球菌，是引起猪链球菌病最主要的病原,根据其荚膜多糖抗原性的差异分为35个血清型，其中猪链球菌2型（Streptococcussuistype2,SS2）是毒力最强、危害最严重、流行最广泛的血清型之一[1]。

可引起猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎、败血症及急性死亡等，也可感染人并致死，是一种重要的人畜共患病病原[2]。

猪链球菌病是对当今养猪业造成危害的一个重要疾病。

病猪的鼻液、尿液、血液、肌肉、内脏和关节液均可检出病原体。

未经过无害化处理的病死猪肉、内脏和废弃物是散播本病的重要传染源。

呼吸道是主要传播途径。

本病一年四季均可发生，但以4-10月份发病较多，常为地方性流行，短期可波及全群，发病率、病死率很高[3,4]。

1954年在英国从暴发败血症、脑膜炎和关节炎的乳猪中分离得到一株α2溶血猪链球菌。

Elliot（1968）将此菌命名为荚膜2型猪链球菌。

之后,该菌在澳大利亚、美国、丹麦、日本、泰国、新加坡及欧洲和北美洲的许多国家导致猪只发病。

1990年初广东省某猪场暴发疑似猪2型链球菌,1998-1999年江苏省部分猪饲养集中地区的猪群中连续2年在盛夏季节突然暴发流行猪链球菌病,经鉴定病原菌为猪链球菌2型,在该病流行期间有25人感染发病,死亡14人。

据报道,死者都是处理过病猪的工人或是接触过病猪肉的人群,呈散发型,表现为职业危险。

之后通过禁止宰杀、调运等一系列综合性防制措施使疫情得到了控制,这说明人是通过与病猪接触而感染上的,未发现人与人之间的传播。

2005年7月在四川省某地突然暴发该病,到目前为止已有38人死亡。

台湾、泰国等国家和地区也有关于人感染患脑膜炎、死亡或治疗后导致永久性耳聋后遗症的报道。

在自然条件下,猪通过鼻咽黏膜和扁桃体感染,而人大多直接与猪或野猪有接触史,通过皮肤伤口感染的[5]。

本次试验所用病料来源的仔猪发生以关节肿胀、运动障碍为主要临床表现，部分病例在耳部、腹部出现紫斑的病例。

剖检可见关节周围水肿，心内膜有针尖大小的出血点。

从症状、病变上怀疑是猪链球菌引起的。

由于猪链球菌病是多种不同群的链球菌引起的不同临床症状类型的传染病的总和。

因此，本病的确诊要先对其病原进行鉴定。

虽然理论上有很多药物能治疗猪链球菌病,但随着抗菌药物的广泛使用以及临床中不合理用药,使得病原菌的耐药现象日趋严重。

本次实验，主要是从病死猪的脏器病料采集菌种，挑选并验证出猪链球菌，检验其部分抗药性及致病性以为进一步防治猪病及深层科研提供基本信息和材料。

1材料与方法

1.1病原菌分离及镜检

2011年4月采集病死猪的脑、肺、肝等组织,无菌接种于普通绵羊血平板。

获得细菌后染色、镜检、纯化,获得1株疑似菌株，命名为DYL-22。

并进行溶血试验[6]。

其中，染色用的是革兰氏染色，染色、镜检、纯化步骤为：

（1）涂片：

①取载玻片一张，拭净；

②用灭菌的接种环取生理盐水一滴，放于载玻片中的中央

③挑取血平板上直径0.1毫米--1.0毫米、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的单个菌落。

④将接种环上的细菌加到载玻片的水滴内，磨匀，涂成直径约1cm大小的薄薄菌层。

（2）干燥：

将玻片置于空气中，使其自然干燥。

（3）固定：

手持玻片一端，让菌膜的朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。

（4）染色：

①初染：

加草酸结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染1-2分钟，水洗；

②媒染：

滴加碘液冲去残水，并保持碘液覆盖1分钟，水洗；

③脱色：

加95％酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。

如此重复2-3次（约30秒），水洗。

④复染：

加番红花红，染色约1分钟，水洗，干燥。

（5）镜检：

干燥后用显微镜观察。

革兰染色阳性、成对或有链状排列的球形细菌为可疑菌落。

（6）纯化：

37℃纯培养可疑菌落,24h后再次进行革兰染色,对镜检为革兰染色阳性、成对、短链球菌,接种于无菌血平皿37℃培养24小时后,置于4℃冰箱保存备用。

1.2相关试剂及培养基

1.2.1相关试剂和仪器

PremixTaq、DNADL-2000Marker（均购自TaKaRa公司），DNA提取试剂盒（购自北京百泰克生物技术有限公司），生化试验试剂盒（购自杭州天和微生物试剂有限公司），药敏纸片，超纯水，超净工作台，PCR仪，琼脂糖凝胶电泳仪及凝胶成像系统，显微镜，紫外分光光度计，高压蒸汽灭菌器

1.2.2培养基

①液体马丁培养基（以200ml为例）

称取10.7g改良马丁液体培养基粉（53.5/L）溶于200ml超纯水，高温高压灭菌后，凉至60℃左右分装至试管中，每管3-5ml，4℃保存。

②固体马丁培养基（以300ml为例）

称取16.05g改良马丁液体培养基粉（53.5/L）溶于300ml超纯水，加入5.5g琼脂粉，高温高压灭菌后，凉至60℃左右倒平皿，直径9cm的平皿每皿15-20ml，4℃保存。

③血平皿培养基（以300ml为例）

称取16.05g改良马丁液体培养基粉（53.5/L）溶于300ml超纯水，加入5.5g琼脂粉，高温高压灭菌后，凉至60℃左右，加入4%血清和0.1%的裂解血，混匀倒平皿。

4℃保存。

1.2.3标准菌株及实验动物

猪链球菌2型标准菌株C55606（购自中国兽医药品监察所），实验动物：

家兔。

1.3病原菌生化试验

1.3.1糖发酵实验

将实验菌株分别接入葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、β-半乳糖苷（ONPC）、菊糖、阿拉伯糖、鼠李糖、肌醇、卫矛醇、甘露醇、山梨醇、木糖等生化试剂管中密封37℃培养24h，观察实验结果[7,8]。

1.4药敏试验

按标准纸片琼脂扩散法（K-B法）操作，将药敏纸片贴在划满病原菌种的血平皿上，保持纸片间适度距离,37℃温箱24小时。

本次实验共用9种药物：

新霉素（N）、阿米卡星（AN）、庆大霉素（GM）、头孢曲松（CRO）、阿莫西林（AMS）、左氧氟沙星（LVF）、磺胺甲恶唑（SMX）、氟苯尼考（F）、磷霉素（FOS）。

（药敏纸片购于北京兰伯瑞生物技术有限公司）。

1.5病原菌PCR鉴定

本实验所做的PCR鉴定内容，主要目的在于检验菌株DYL-22是否含有gdh基因。

猪链球菌的谷氨酸脱氢酶属于GDH蛋白家族，在细胞表面表达[9]。

核酸序列分析表明，GDH基因包括一个开放性阅读框，编码448个氨基酸残基，在细胞表面表达，酶活性是NAD（P）H依赖型，作用底物为L一谷氨酸，其编码基因在SS2（2型猪链球菌）中保守存在。

SS2的GDH有保守的抗原性，能与感染有毒猪链球菌的猪的血清反应，可作为检测猪链球菌的重要标志性抗原[10,11]。

若获得gdh基因，则证明该菌株为猪链球菌，而且极有可能为2型猪链球菌。

1.5.1引物

根据参考文献[12]合成猪链球菌2型特异性引物,分别为gdh688a：

CCATGGACAGATAAAGATGG,gdh689b：

GCAGCGTATTCTGTCAAACG.

1.5.2PCR模板的制备

①将菌株接入液体培养基，37℃摇床培养16小时后，按照百泰克的DNA提取试剂盒使用说明书进行DNA提取：

②取0.5-2ml培养菌液，10000rpm，离心30s，弃上清，收集菌体，尽可能吸净上清。

③加入200ul缓冲液RB重悬洗涤细胞，10000rpm，离心30s,弃上清后将细胞吹打重悬于200ul缓冲液RB中。

④加入50-100ullysozyme（溶菌酶）（10mg/mlin10mMTris-HCl,PH8.0）颠倒混匀，37℃温浴1h。

10000rpm离心2分钟，弃上清后将细胞吹打重悬于200ul缓冲液RB中。

⑤加入200ul结合液CB，立即剧烈颠倒充分混匀，再加入20ul蛋白酶K（20mg/ml）溶液，充分混匀，70℃放置10min。

⑥冷却后，加入100ul异丙醇，剧烈颠倒充分混匀，此时可能出现絮状沉淀。

⑦将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。

加入500ul抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。

⑧加入700ul漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃废液。

加入500ul漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃废液。

将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量出去漂洗液，一面漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

⑨取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100ul洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热），室温放置3-5min，12000rpm离心1min。

将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。

DNA暂时存放在4℃中，长期存放时放在-20℃环境。

1.5.3PCR体系、条件及检测

PCR反应体系（20ul体系）为：

PremixTaq10ul，模板1ul，上、下游引物各1ul，超纯水7ul，共20ul。

PCR反应条件为：

94℃变性5min，然后进入35个循环：

94℃1min、51℃1min、72℃1min，最后72℃延伸7min，PCR产物在4℃短暂保存。

琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6病原菌毒力实验

血平皿活化菌种，挑取单菌落，取链球菌接种于马丁汤（加4%血红素），37℃培养16-18h，进行活菌计数。

取马丁汤培养基液0.2ml（含菌4000万左右）静脉注射1.5～2.0kg家兔，接种2只家兔，同时进行活菌计数；设置空白对照2只，注射等量生理盐水。

家兔死亡后，剖解家兔，取心血接种血斜，37℃培养24h。

同时取家兔心血分装小试管，置-20℃保存[13,14]。

2结果与分析

2.1镜检结果及分析

将病料接种在鲜血培养基上，将各菌种纯化分离，观察可疑菌株生长良好，菌落呈圆形，光滑隆起透明，灰色的露珠状小菌落，并产生明显的β型溶血（如图1）。

将在鲜血培养基上的可疑菌落接种在麦康凯琼脂培养基上无细菌生长。

在普通培养基上有菌落生长但生长不良。

挑取鲜血培养基上的典型菌落，进行革兰氏染色、镜检，可见革兰氏阳性、短链状或单在的球菌，菌体直径0.1-0.2um（如图2）。

图1:

溶血实验

图2:

病原菌革兰氏染色放大倍数1000

2.2生化试验结果及分析

主要针对猪链球菌的糖发酵的生化试验，从图3、图4、图5中可以看出，葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖的生化试验管均由蓝紫色变成黄色，菊糖由浅色变成粉色，且这些变色的生化试验管均未发现有气体出现，由此可见，该病原菌可发酵以上5种糖类，但产酸不产气。

而ONPC、阿拉伯糖、鼠李糖、肌醇、卫矛醇、甘露醇、山梨醇、木糖等的生化试验管均未变色也未产生气体，说明该病原菌不能酵解以上糖类。

以上实验结果与预期实验结果基本一致。

图3：

病原菌接种0h

图4：

病原菌接种24h

图5:

病原菌接种24h

2.3药敏试验结果及分析

如图6：

药敏纸片从上顺时针分别是CRO（头孢曲松）、AN（阿米卡星）、N（新霉素）、FOS（磷霉素）、AMX（阿莫西林）、F（氟苯尼考）、LVF（左氧氟沙星）、SMX（磺胺甲恶唑）、中间为：

GM（庆大霉素）。

其中新霉素（N）、阿米卡星（AN）、庆大霉素（GM）、磺胺甲恶唑（SMX）对该病原菌无抑菌性或效果很微弱，其他药物抑菌环直径分别为：

头孢曲松（CRO）3.040cm，氟苯尼考（F）2.460cm,磷霉素（FOS）2.360cm，阿莫西林（AMX）1.610cm，左氧氟沙星（LVF）1.734cm。

说明，该病原菌对新霉素、阿米卡星、庆大霉素、磺胺甲恶唑敏感度低、抗药性强；对头孢曲松、氟苯尼考、磷霉素、阿莫西林、左氧氟沙星等敏感度高、抗药性弱，临床用药可供参考。

图6：

病原菌药敏试验

2.4PCR电泳结果及分析

PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，标准猪链球菌和分离株DYL-22均在700bp左右出现目的条带，与预期片段一致。

M空白标准DYL-22

750

1000

2000

100

250

500

图7：

病原菌gdh基因PCR检测结果

2.5毒力实验结果及分析

攻毒家兔在36h左右，出现呼吸困难症状，72h左右死亡。

剖检：

典型的肺炎、脑膜炎、心肌出血、肠系膜出血、脾脏肿大坏死，肾脏出血坏死等；空白对照，观察两周后健活。

图8：

左为肺脏病变出血，右为健康家兔的肺部

图9：

脑部病变—主要病变现象为大脑出血水肿，脑部沟回不清

图10：

左为心肌病变，右为健康家兔心肌

图11：

左为肾脏病变，右为健康家兔肾脏

3讨论

猪链球菌通常在猪的扁桃体定居,可分为35个血清型,在致病性血清型中2型的致病力最强,发病率高,流行范围广,其次是1型和9型.

镜检菌落形态和溶血现象与链球菌相符；生化试验结果中，除ONPC和菊糖外，其他试剂管的情况符合预期情况；通过PCR检测该病原菌确带有gdh基因，gdh基因为猪链球菌特征性基因，因此，该病原菌为猪链球菌。

经过的动物攻毒试验，家兔各器官出现明显猪链球菌2型感染症状----肺脏病变出血、肠系膜淋巴结出血、脾脏肿大、脑部出现出血水肿、心肌和肾脏病变。

猪链球菌是革兰氏阳性菌,理论上很多药物对其有疗效。

但近年来由于抗生素的滥用,如在动物饲料中长期添加抗生素用于促进生长及预防和治疗疾病,发生疾病后未经兽医诊断就盲目大量使用多种抗生素等,不仅治疗成本提高,而且产生了大量耐药菌株,使得疾病难以控制。

因此，对病猪或可疑猪采取药物防治时，对于药物的选用应最好通过药敏试验来确定，防止抗生素使用不当或经常使用而产生耐药性。

在对该链球菌进行药敏试验时，观察结果可见，头孢曲松（CRO）、氟苯尼考（F）、磷霉素（FOS）、阿莫西林（AMX）、左氧氟沙星（LVF）对该菌的抑制效果很明显，如科学用药将能起到很好的效果。

其次，每年定期用链球菌弱毒活菌苗接种。

猪链球菌病血清型较多,不同猪场发生猪链球菌病的血清型可能不一样,对药物的敏感性也不一样。

同一个血清型,即使在同一个猪场不同时期、猪只的不同生长阶段对药物敏感性也可能不一样。

因此,定期对菌株进行耐药性监测也是控制和治疗猪链球菌病的必要措施。

参考文献

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致谢

在此论文撰写过程中，首先，我要特别感谢我的指导老师老师和老师，在各位老师的细心指导下，我圆满结束了实习任务，顺利完成了毕业论文，同时感谢老师们的谅解与包容，没有老师的帮助也就没有今天的这篇论文。

感谢山东省滨州畜牧兽医研究院为我提供了美好的实习、学习和生活环境。

求学历程是艰苦的，但又是快乐的。

感谢关心我支持我的同学们和朋友们，感谢等好朋友，感谢你们在我遇到困难的时候帮助我，给我支持和鼓励。

感谢学校领导、老师们，感谢你们给予我的帮助与关怀。

本文参考了大量的文献资料，在此，向各学术界的前辈们致敬！

附录

胶回收DNA（百泰克胶回收DNA试剂盒）快速操作流程：

1紫外灯下从琼脂糖凝胶中割下含有目标片段的胶块，称重。

2加入胶块重量3-6倍的BufferB2,50℃水浴5-10分钟，间或混匀，直至胶块完全融化。

3将融化好的溶液全部移入吸附柱中，8000×g离心30秒，倒掉手机观众的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

4向吸附柱中加入500ulWashSolution（洗涤液）9000×g离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中

5重复步骤④一次。

6将空吸附柱和收集管放入离心机，9000×g离心1分钟。

7在吸附膜中央加入15-40ulElutionBuffer（洗脱液），室温静置1-2分钟9000×