酶制剂生产与应用.docx

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酶制剂生产与应用

第一章概述

第一节酶制剂的定义

一、酶制剂的定义

从生物（包括动物、植物、微生物）中提取的具有生物催化能力的酶，辅以其他成分，用于加速加工过程和提高产品质量的制品，称为酶制剂。

二、酶制剂的分类

1.从形态上分类

从形态上可以将酶制剂分为固体酶制剂和液体酶制剂。

2.按酶制剂在应用领域上的分类

按酶制剂的应用领域可以分为:

用于工业生产上作为催化剂的工业酶制剂，如-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、天冬氨酸酶、富马酸酶等;

2.按酶制剂在应用领域上的分类

用于饲料中提高动物消化率的酶制剂，又称饲料酶制剂;

用于食品生产加工的酶制剂，又称为食品酶制剂;

用于临床检测的诊断酶制剂;

用于化学分析的酶分析制剂;

用作药物的药物酶制剂;

用于洗涤剂的洗涤酶制剂等。

3.按酶的来源不同分类

按酶的来源不同，可将酶制剂分为植物酶制剂、动物酶制剂和微生物酶制剂。

4.按酶生产加工方法的不同分类

针对应用的需要，可将酶分为游离酶制剂、固定化酶制剂、酶试纸、酶电极等。

5.按酶的组成成分分类

根据酶制剂中所含酶种类的多少可分为单一酶制剂（只含有一种酶，如淀粉）和复合酶制剂。

复合酶制剂由一种或几种单一酶制剂为主体，加上其他单一酶制剂混合而成，或由一种或几种微生物发酵获得。

复合酶制剂可利用各种酶的协同作用，降解各种底物，最大限度地达到酶制剂的作用。

6.按酶的含量分类

根据酶制剂中酶的浓度，可将酶分为普通酶和浓缩酶。

普通酶具有价格低、效果好等优点。

浓缩酶颜色较深，具有成本较低、用量少的特点。

第二节酶分析

一、反应速率用来测定催化活性

酶作为生物催化剂，提高了反应的速率或允许该反应进行。

因此，可以检测底物的转化率υ来确定酶的催化活性。

酶动力学的各个方程中，底物的浓度保持在一个远远高于米氏常数的水平上，这样，所有的酶都被底物所饱和，反应以恒速即最大速率进行。

因此，酶的催化活性与所用的酶量线性相关。

在酶的活性的测定中，往往要设法达到这一条件。

二、单位定义

酶活单位最初是由第一个发现酶并对酶进行描述的研究者来定义的。

因此在一些较早的文献中，酶的活性以任意各种形式来表示，如吸光度的变化、还原基团的增加，以mg或µg表示的被转化底物的数量。

这些参数和各种时间单位，如1min、30min或1h。

1961年，世界生物化学协会酶学委员会用国际单位U来定义酶的活性，定义为在优化的标准条件下，1U即每分钟催化1mol的底物的量。

有关酶基本的国际单位（SI），世界临床化学家协会数量和单位专家小组以及国际理论和应用化学联合会临床化学数量和单位委员会定义了一个基本单位，katal，定义为测定体系中，每秒钟催化1mol的转化反应速率所需要的酶的数量，但这个单位并不常用。

每一次测定中必须标明温度。

通常，在0～40℃范围内，温度每提高10℃酶催化反应的速率会变为2倍。

而为获得可重复性的结果，必须精确控制温度，并保持其恒定。

但由于许多实际的原因，对于许多酶反应的监控并不能够通过消耗的底物或生成的产物的化学计量来实现。

因此，对于某一特定的酶，它的催化活性也许根本不能用国际单位来表示。

在分子生物学中，大部分的酶的单位定义相当随意。

例如，限制性内切酶（E.C.3.1.21.3-5）的酶活定义为：

在一定的温育条件下，酶使DNA某一特定键断裂，在电泳后可以检测到的精确数量（通常1g）的DNA时酶的催化活性。

还有其他一些定义这些酶活的参数，如以微克、纳摩尔、吸光度单位或者是碱基对的数目来表示的核酸降解以及核苷在核酸分子中的结合，由于一些实际的原因，不同的时间周期如1min、10min、30min或60min被选作参考。

三、吸光度法

基本的考虑因素。

由于吸光度法技术上简单可靠，所用仪器价格合理，因此是目前酶活测定中首选的方法之一。

当底物或产物是有颜色的，或者是在紫外区有光吸收的，吸光度法就可以非常快速和方便地进行，因为吸光产物的出现速率或者消失速率可以用分光光度法来跟踪检测。

催化活性z对应于每分钟的吸光度的变化为：

z=（△AV×100）/εd△t

式中，V是测量体积，L;t是时间，min；z的单位是mol/min，对英语前面章节里给出的国际单位制U的定义。

四、荧光光度法

荧光光度计的方法很少用于粗酶或者是纯酶制备中催化活性的检测。

由于它具有很高的灵敏度，可以用于器官或者组织区域的微量酶的测定。

总体上，这种方法的灵敏度是吸光光度法的1000多倍。

五、发光法测定

发光法应用荧光、磷光以及化学发光等作为检测器体系。

活的生物体中观察的化学放光称作生物体发光。

生物体发光是由成为荧光素酶的酶类催化产生的，这类酶的底物即虫荧光素，被转化为发光产物。

在发光法中，单位时间内反应体系发射的光子数目可以由特殊设计的仪器——照度计来测量，这类仪器是以单光子探测器为基础的，通常是光电倍增管。

由来源于萤火虫的荧光素酶催化的反应就是一个例子，萤火虫荧光素4-单加氧酶（ATP水解酶）

ATP+D-虫荧光素+O2→氧合虫荧光素+AMP+pp+CO2+0.9hν

在该反应中，ATP作为底物被消耗掉，光子在562nm的波长处发射。

每摩尔的虫荧光素的量子产量是0.9爱因斯坦，也即消耗掉一分子ATP，大约发射1个光子。

因此该反应适合用来测定ATP，从而测定那些能够催化ATP消耗或者是ATP生产的反应的那些酶。

为借助于萤火虫的生物发光来检测酶的活性，光强度必须在几分钟内呈线性增加，而且必须严格正比于酶的催化活性。

这些测定条件在测定肌酸激酶的催化活性时，已经得到了实现。

磷酸肌酸+ADP→肌氨酸+ATP

其他依赖于NAD（P）的反应可以通过来源于发光细菌的生物发光来跟踪检测。

六、辐射线测定

当使用一些放射性标记的底物时，一些酶的活性就可以得到高灵敏度的测定了。

这种技术广泛应用于分子生物学领域以检测：

（1）放射性标记的核苷结合入不溶于酸的核苷酸或者多核苷酸（DNA或RNA聚合酶）；

（2）放射性标记的DNA的分解（核酸外切酶Ⅲ）；

（3）放射性标记的磷酸基团从-32P-ATP到多核苷酸的5-羟基端（多核苷酸激酶）的转移；

（4）载体基质上放射性标记的焦磷酸盐之间的交换（T4DNA连接酶）。

标记最常用的同位素是32P,14C，3H，用的较少的是35S。

七、电位测定法

pH敏感的玻璃电极可以用于测定那些产生或消耗质子的反应。

出于这个目的，利用反滴定法保持pH的恒定，所需要的酸或碱的消耗量就可以被测定。

电极控制着自动滴定器，这个概念就是BUCHER描述的pH-stat技术。

一个典型的例子是脂肪酶（E.C.3.1.1.3）[9001-62-1]催化活性的测定。

某脂（甘油三酯）被该酶水解，生产的脂肪酸被NaOH在pH-stat的模式下反滴定中和。

甘油三酯+H2O→甘油二酯+脂肪酸

橄榄油作为底物，和含有脂肪酶的稀释样品溶液混合温育，混合物在恒定pH下滴定。

纪录器标绘出了NaOH的消耗量随时间的变化曲线，所得到的斜率与酶的催化活性相关。

其他的例子如木瓜蛋白酶（E.C.3.4.22.2）[9001-73-4]的测定和葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4）[9001-37-0]的测定。

八、电导测定法

原则上，所有酶的反应只要能够引起总离子流动性的变化，就能够通过电导测定法来测定。

这样，使用未修饰的弹性蛋白作为底物，胰肽酶（elastase，E.C.3.4.21.36）的胰肽水解活性已得到了测定。

其他的一些应用也有报道。

反应中肽键的断裂导致质子的释放。

九、量热法

许多酶反应会放出热，因此引起人们对量热（量焓的）法的兴趣。

在合适的实验安排下，温度传感器用作测定酶催化活性的装置。

根据这种方法，分析化学出现了一个新的领域。

以前称为微量热法，现在大家所熟知的称为热焓测量法。

这种方法主要应用于研究领域。

十、旋光测定法

旋光测定法很少被使用，一定程度上是因为其不方便性。

但是在测定变旋酶（mutarotase，E.C.5.1.3.3）[9031-76-9]的催化活性时确是必需的，该酶催化-葡萄糖和-葡萄糖之间的转化平衡。

十一、测压法

测压法是生物化学中的经典方法之一，它不再用于酶的常规测定。

以前，葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase）和精氨酸酶（arginase,E.C.3.5.3.1）[9000-96-8]以及其他的一些酶是用这种方法测定的。

十二、黏度测定法

黏度测定法在酶活检测中在实际上已经被摒弃了。

例如，以前纤维素酶（cellulase，E.C.3.2.1.4）[9012-54-8]的活性是通过单位时间黏度的变化来测定的。

现在纤维素酶的测得是通过显色法反应来测定。

纤维素→低聚糖+n葡萄糖→红色染料

十三、比浊法

浊度法能够拥有不同酶的测定。

例如，用溶菌酶[胞壁质酶（muramidase），E.C.3.2.1.17]裂解细菌细胞壁。

使用标准的底物悬浮液（藤黄微球菌（Micrococcusluteus）的干芽孢），25℃在450nm处测定吸光度的降低。

十四、固定化酶

固定化酶用于在分析化学中，并在化学品、医药品以及食品的生产中用作催化剂，它们还可以作为研究结合酶的简单明确的模型。

由于固定化酶的特殊结构，需要采用专门的测定法。

除了需要不同于可溶酶的最佳条件外，孔径、孔径分布、机械和化学结构、基质的稳定性和结构异界用作固定化酶的催化活性等等，都必须考虑到。

对于不可溶酶至少有两种不同的测定步骤：

一个是在容器中搅拌悬浮，另一个是利用填充床和柱反应器。

这样的测定条件非常接近于工业应用中所使用的条件。

酶的活性检测可以连续或者是分批测定。

电导分析法，电势测定法以及旋光测定法比光度测定法更适合用于检测，因为那些测定方法可以使反应能够被连续跟踪检测，而不需要添加另外的指示酶、辅酶或者第二个底物。

一个例子就是固定化青霉素酰胺酶（penicillinamidase,E.C.3.5.1.11）[9014-06-6]的测定。

青霉素G+H2O→6-氨基青霉素+乙酸苯酯+H+

十五、电泳

对于测定核酸酶，尤其是限制性内切酶的催化活性，电泳是必不可少的一个工具。

它也用于其他一些基因工程中重要的酶，如DNA甲基化酶。

限制性酶催化DNA的特异性切割，如大肠杆菌（Escherichiacoli）的噬菌体λDNA的切割，该DNA是基因工程中一个典型的底物。

该DNA被切割成一些确定长度的小片段。

对于所有的DNA片段，每个碱基对所带的负电荷是相同的，因此根据片段的长度来分离。

对于每一个特异的酶-底物反应，仔细地优化条件，就可以通过电影将切割产物完整地的或不完全切割的分子相分离。

电泳通常使用高质量的琼脂糖凝胶作为载体材料。

对于每一个分辨率问题，都需要一个特定的琼脂糖浓度，如对于大片段，采用相对较低的琼脂糖浓度（每100mL0.5g），对于小片段，则采用相对高一些的琼脂糖浓度（每100mL1.62g）。

当必须要分离很小的片段时，则可以用聚丙烯酰胺作为替代的载体材料。

分离的DNA片段可以通过瑛姑染料溴化乙锭染色来进行观察。

在电泳后，将胶片至于一个单独的容器中染色，用来标记DNA片段，或更容易的做法，胶片染色后直接在胶和缓冲液中（如1g/ml）进行电泳，将DNA片段进行标记。

当胶片在长波长（如366nm）的紫外灯照射下，分离的DNA片段就变得可见并可以拍摄图片了。

例如，限制性酶HindⅢ的电泳检测简单描述如下，见图10。

（1）单位定义在0.025mL体积内，完全切割1gλDNA的HindⅢ催化活性为一个单位。

反应在0.025mL的一定缓冲液混合物中进行，37℃温育60min后结束。

（2）测定