TLC薄层层析色谱技术原理与应用.docx
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TLC薄层层析色谱技术原理与应用
TLC（薄层层析色谱）技术原理与应用
一、薄层层析（TLC）简介
薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。
把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。
由于层析在薄层上进行故而得名。
薄层层析是一种微量、快速的层析方法。
它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。
还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。
根据分离的原理不同，薄层层析可以分为两类：
用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶；用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层，属于分配薄层层析。
吸附TLC→固定相为吸附剂→氧化铝、硅胶。
（较多用）
TLC→
分配TLC→固定相为液态（通常为水）→固定相吸附在支持剂上。
（一）吸附薄层的基本原理：
吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。
吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。
吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受被吸附成分的性质影响，更与展开剂的性质有关。
1.吸附薄层层析：
在硅胶薄层板上，样品中的两成分是两种结构近似的染料，在展开剂四氯化碳的作用下。
在展开剂和薄层板之间不断地产生吸附、解吸，再吸附，再解吸，……。
由于对氨基偶氮苯的极性比偶氮苯的极性稍强一些，层析的结果，对氨基偶氮苯受到的吸附作用稍强于偶氮苯，从而将两者分离。
展开结束以后，会在薄层板上形成两个斑点，混合物中的成分得以分离。
中药中的有效成分复杂多样，结构近似者不少。
特别是对未知结构的成分分析，设计并摸索出合理的层析条件是首要任务。
只有先设计出可用的层析条件，再经摸索改进，才可能对未知或者已知成分进行成功地分离。
然后才能谈得上进一步的分析研究。
要设计出合理有效的层析条件，必须熟悉薄层层析条件的选择的基本要领。
下面对薄层层析条件的选择做一初步介绍。
薄层层析的三项基本构成物质是：
样品组分、吸附剂、展开剂。
摸索层析条件，实际上是协调上述三者的关系，寻求一种能够有效分离样品组分的配合方案及实际操作要领。
很明显，一切层析都是针对分析任务，也就是围绕待分离的样品组分来进行调整适应的。
可见，层析条件的选择是以样品中的各组分为中心，适当调适展开剂的吸附剂的极性来实现的。
（二）薄层层析条件的选择：
1.概述：
吸附剂的选择：
薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。
主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀。
用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。
而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果。
展开剂的选择：
薄层层析，当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。
中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。
基本思路是根据待分离样品组分的极性来确定吸附剂的极性（类型、活化度）和展开剂的极性（主要溶剂、调节溶剂、辅助溶剂等）。
要协调、处理好吸附剂、展开剂、及被分离成分三者之间的关系，才能得到理想的薄层层析结果。
2.吸附剂：
对吸附剂的基本要求是颗粒细致（薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。
主要区别在于薄层层析要求吸附剂/支持剂的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀）、大小均匀（亦即有较大的表面积和适当的吸附活性）；不能与样品组分、样品溶剂、展开剂发生化学反应；更不能与溶剂及展开剂发生溶解。
（注：
实际操作中，可通过选择不同的活化温度对吸附剂活性进行调节）。
用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。
而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果。
最常用的吸附剂是＿＿＿和＿＿＿＿。
另外，市场上还有氧化镁、硅酸镁、碳酸镁、硅藻土、活性炭等。
其中，只有活性炭是非极性吸附剂，其余均是极性吸附剂。
它们对水和极性大的化合物吸附能力强。
（1）氧化铝：
化学式为Al2O3，国产层析用氧化铝有碱性、中性、酸性三种，以中性氧化铝应用较广。
氧化铝的特点：
A:
氧化铝为吸附力较强的极性吸附剂，它适用于中性或者碱性的亲脂性化合物的分离。
通常氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关。
含水越多，吸附活性越小，吸附能力越小。
氧化铝根据其含水量多少将其活性划分为五级。
B:
氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关
（2）硅胶：
表达式为SiO2?
XH2O。
层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。
特点：
A：
硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。
如对有机酸、挥发油、萜类、皂苷、黄酮、蒽醌、氨基酸等成分的分离适用，不能用于生物碱等碱性物质的分离。
B：
硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。
由于结构的决定作用，氧化铝的活化温度可以很高（150℃－160℃），而硅胶的活化温度却不能太高（105℃－110℃）。
一旦超过500℃，硅醇基会相互脱水而失活。
C：
硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。
根据样品的酸碱性和极性大小确定了吸附剂以后，正确选择展开剂也是保证层析较好的分离的重要条件。
3.展开剂：
展开剂：
薄层层析中用来将样品展开的溶剂。
展开：
用极性适当的溶剂浸润已经点了样品的薄层板一端，凭借毛细作用带动样品在薄层板上移动，最终使样品分离的操作过程。
展开剂常是由两种或者两种以上的溶剂铵一定的比例组成的溶剂系统。
简称溶剂系统或展开所用的溶剂。
“展开剂”＝“溶剂系统”＝“溶剂”；“展开”＝“展开过程”
4.被分离成分：
被分离成分：
分析任务所要完成分离的样品中的有效成分。
被分离成分的极性决定于其母核结构类型及官能团极性。
如果吸附剂活性和展开剂活性固定不变的条件下，被分离成分的极性越大，吸附剂对其作用越强，展开距离越短；被分离成分极性越弱，吸附剂对其作用越大，展开距离越大。
一些基团的极性相对大小顺序已经在课本P31列出。
当然，具体物质的极性大小判断时，还要结合分子结构的具体情况进行判断。
总之，选择层析条件时，必须针样品中对被分离成分的极性，试行判断或确定吸附剂种类和活性，再探索配制展开剂。
在选择层析条件时，必须根据样品、展开剂、被分离物质三方面缩合考虑。
历史上吸附层析出现最早，是由俄国生物学家茨维特用碳酸钙作为固定相，石油醚作为流动相来分离植物色素的。
除了吸附层析之外，另一经典的层析法是以液体作为固定相的液相层析。
液体固定相（多为水）被吸附在固态载体物质上，这些载体物质多是一种多孔性物质。
这些液态固定相被载体固定在柱中，就成为液－液分配柱层析。
（三）分配薄层层析：
用极性溶剂吸苷在固体支持剂上所形成的混合物，铺成薄层（或装柱），然后活化、点样（或上样），再用极性较弱的展开剂（或洗脱剂）进行展开。
分配层析的一般原理：
在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配，由于各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。
以CS表示某成分在固定相中的浓度，Cm表示某成分在固定相中的浓度。
则
分配系数：
K＝CS/Cm
载体应该具备的基本条件：
中性、多孔粉末、无吸附活性、在洗脱剂之中不溶解；所能够吸收固定相的量，最好能达载体本身重量的50%以上；能使流动相自由的通过载体所吸收的固定相，并且不改变溶剂系统的组成。
能够满足这些条件的载体是硅胶、硅藻土、纤维素粉等。
分配层析所用的固定相一般为水及各种水溶液（酸、碱、盐与缓冲液）、甲酰胺、低级醇（亲水性）等。
分配层析所用的流动相选用与水不溶（或微溶）的有机溶剂。
如石油醚、苯、卤代烷类、脂类、酮类（如丁酮）、醇类（丁醇、戊醇）等或者它们的混合物。
分配层析对混合物中各成分的分离，主要决定于各成分分配系数的差异，一般说来，对于种类成分均能适用，特别能适用于水溶性、亲水性物质而又稍能溶于有机溶剂中者。
这样就恰好弥补了一般吸附层析（如氧化铝吸附层析适用于亲脂性物质）的不足。
但是，由于分配柱层析样品处理量较少，因此，如能用吸附柱层析解决问题时，常优先使用氧化铝或硅胶吸附柱层析。
一般分配层析的条件可以由PC来摸索，再应用于分配柱层析。
（四）薄层的制备：
1．基板的规格和构成：
5×15㎝、5×20㎝、10×10㎝、20×20㎝大小的玻璃板或者不锈钢板、塑料板。
2．薄层板的分类：
软板（制板时不加粘合剂）、硬板（制板时加入粘合剂）。
3．软板的制备：
详见P32。
4．硬板的制备：
详细演示、介绍手工铺板，了解薄层涂铺器的使用方法。
（五）薄层层析的操作步骤：
1．点样：
A:
样品的溶解：
将样品溶于展开剂极性相近、挥发性高的有机溶剂。
B:
薄层点样：
用毛细管（0.5mm以下）或用专业点样器进行点样。
点样的要求：
样点位置应在距离底边1-1.5cm处；点样量适当；样点直径小于2-3mm；间隔反复点样；多个样点时，间隔为2cm且处于同一条直线上。
经验做法：
可先在PC或TLC点上不同量的样品，并展开、显色后观察分离情况，以此确定最佳样品用量。
2．展开：
当样点上的溶剂充分挥干后，将薄层放置在密闭容器中，使适当的展开剂从薄层的一端向另一端进行浸润展开的过程。
要求：
密闭容器可选用层析缸、标本缸、标本筒等；展开方式有上行法、下行法之分，展开方向有单向、双向、多次展开等。
详见P33。
注意事项：
先悬空饱和、再入液展开；样点不能泡在展开剂中；薄层浸入时不能歪斜进入。
3．显色：
用适当的方法或者适当的显色剂处理薄层，使其上可能已经分离的各成分斑点显示出来，以方便计算各个斑点的比移值，从而提供定性与定量的依据。
显色的基本步骤是：
一看、二照、三碘、四显，荧光背景也常见。
详见P34。
4．比移值的计算与定性、定量：
展开结束后，经过各种显色操作后，样品中各个成分的斑点可能出现了不同程度的分离，为了表达各成分的相对位置（极性）通常以比移值作为称量斑点位置的指标。
比移值的符号为Rf：
Rf＝（斑点中心与原始样点之间的距离）/（溶剂前沿与原始样点之间的距离）
注意事项：
薄层层析的Rf值受多种因素影响，即使严格按照实验要求做了，结果的重现性仍较差。
因此，薄层定性时常与标准品一起点样进行对比分析。
二、展开剂的选择与常见溶剂的极性
（一）展开剂的选择：
在吸附薄层中，化合物在吸附薄层上移动的速度与展开剂的极性有关。
展开剂的极性越大，化合物移动的速度越快，展开剂的极性越小，化合物的移动速度慢。
薄层层析要得到较好的展开效果，必须依据所要分离的样品来正确选择层析条件，对样品的极性进行认真研究，以确定及实验摸索适宜的吸附剂、展开剂。
当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。
中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。
但在实际工作中，经常需要利用溶剂的极性大小，对展开剂的极性予以调整。
通常先用单一溶剂展开，根据被分离物质在薄层上的分离效果，进一步考虑改变展开剂的极性。
Rf值最佳范围在0.3～0.5范围；可用范围在0.2～0.9。
如果Rf较大可适量加入极性较小的溶剂，以降低展开剂极性。
反之，加入极性大的溶剂。
（二）展开剂的极性
常用展开剂的极性次序可用溶剂的溶剂强度参数ε0来衡量。
溶剂的ε0越大，极性越强，洗脱能力越强。
反之越若。
常用溶剂的极性如下：
溶剂沸点溶剂强度参数ε0溶剂强度参数P`选择性组别
异辛烷990.010.1
正已烷690.010.1
叔丁基甲醚560.352.51
苯810.322.77
乙醚2.81
二氯甲烷400.423.15
正丙醇970.824.02
四氢呋喃660.824.03
乙酸乙酯770.584.46a
氯仿610.404.18
二氧六环1010.564.86a
丙酮0.665.16a
乙醇0.884.32
醋酸大6.04
乙氰0.655.86b
甲醇0.955.12
水很大10.28
Snyder根据溶剂的极性p`分成选择性不同的八组，因此若某一溶剂作展开剂分离效果不好。
则选择同组的另一种溶剂作展开剂就不会对色谱分离有明显的改变，而选择溶剂强度相同而选择性不同的组中的另一种溶剂可能改变色谱分离情况。
————文献来源何华，倪坤仪主编，自现代色谱分析，化工版2004.2第一版。
三）应用实例
1、药物及天然产物中的应用
根据本人的几年薄层层析经验，参考药典等国家药品标准和有关文献，将2000版药典一部里部分有代表性的对照品的薄层层实例按展开剂极性排序，并对其规律做一些分析。
以下的分析和介绍是总体描述性的，目的是快速、简便地选择展开剂。
如果想了解展开剂选择的各种理论，请参考其他专著。
选择展开剂，要依据溶剂极性和他们的混溶性，溶剂对被分析物的溶解性，以及被分析物的结构。
这里只讨论药典里通常使用的以硅胶为固定相主体的正相薄层，也不考虑板的活性。
列出溶剂极性参数表，方便以下比较展开剂。
环已烷:
-0.2、石油醚（Ⅰ类，30~60℃）、石油醚（Ⅱ类，60~90℃）、正已烷:
0.0、甲苯:
2.4、二甲苯:
2.5、苯:
2.7、二氯甲烷:
3.1、异丙醇:
3.9、正丁醇:
3.9、四氢呋喃:
4.0、氯仿:
4.1、乙醇:
4.3、乙酸乙酯:
4.4、甲醇:
5.1、丙酮:
5.1、乙腈:
5.8、乙酸:
6.0、水:
10.2
于溶剂混溶性，一般根据相似相溶原则，需要注意，极性相差大的不混溶，比如正己烷与甲醇。
多元展开剂，主体的两种溶剂不能混溶，就需要通过第三种溶剂来调和。
比如：
石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、环已烷和甲醇、水之类的。
一般正相色谱，固定相为极性，被分析物质的极性越大，需要极性更大的展开剂。
了解被分析物的极性可以通过分析其结构获得，很难获得它的极性指数。
物质分子化学结构中，通常由较极性部分和非极性部分两部分。
例如下面以苯丙烷为极性小部分，随着极性基团部分的增加，总体的极性就增加，展开剂极性也增加了。
依次为肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸。
相应展开剂分别为：
正己烷—乙醚—冰醋酸（5:
5:
0.1）、苯－冰醋酸－甲醇（30:
1:
3）、氯仿－甲醇－甲酸（9:
1:
0.5）、石油醚－乙酸乙酯－甲酸（3:
6:
1）、醋酸丁酯－甲酸－水（7:
2.5:
2.5）。
（由于薄层板、比移值不同的原因，展开剂极性比较是相对的，并非绝对的后者大于前者）。
现在最重要的问题是，不同化合物，怎么定它的极性，又用什么标准来定它对应的展开剂呢？
以下分开讨论不同化合物极性情况及其对应的展开剂。
（1）极性较小的挥发性物质。
比如：
冰片：
石油醚（30～60℃）—醋酸乙酯（17:
3）、厚朴酚：
苯－醋酸乙酯（9:
1.5）、α-香附酮：
苯－醋酯乙酯－冰醋酸（92:
5:
5）、丹皮酚：
环己烷－醋酸乙酯（3:
1），这类化合物，以石油醚、正构烷和苯为体积百分数比较大的溶剂，通常起溶解和分离化合物的作用，而用醋酸乙酯为调节Rf（比移值）的溶剂。
为了减少拖尾之类其他相似相溶原则以外的影响，适当加入添加剂，如有机酸或者有机碱。
（2）极性较小的不挥发性物质。
比如：
β-谷甾醇：
环己烷－醋酸乙酯－甲醇（6:
2.5:
1）或者环己烷－丙酮（5:
2）、熊果酸：
甲苯－醋酸乙酯－冰醋酸（12:
4:
0.5）、齐墩果酸：
氯仿－甲醇（40:
1）、猪去氧胆酸：
氯仿－乙醚－冰醋酸（2:
2:
1）、大黄素：
苯—醋酸乙酯—甲醇（15:
2:
0.2）或者苯—乙醇（8:
1）、丹参酮ⅡA：
苯-醋酸乙酯-甲酸（40:
25:
4）、穿心莲内酯：
氯仿-无水乙醇（9:
1）、靛玉红、靛蓝氯仿－乙醇（9:
1）或者苯－氯仿－丙酮（5:
4:
1）。
这类物质展开剂极性比极性较小的挥发性物质洗脱力强一些，因为这类物质极性小的母核大，而极性大的基团通常可以形成氢键，比如羧酸、羟基。
以上物质，母核分子量减小、母核结构中不饱和健的增加（尤其是出现苯环），极性基团的增加，都使极性增加，展开剂极性也增大。
这个范围内的物质很多，一般展开剂大百分数的溶剂可以从环己烷—〉甲苯—〉二甲苯—〉苯—〉氯仿的顺序，按照极性要求选择。
这里注意，异丙醇、正丁醇极性指数也比较小，在这范围的化合物很少用，因为粘性大、展开慢，造成斑点扩散；另外，羟基的氢键作用力也有不利。
调节Rf值的溶剂，从醋酸乙酯—〉甲醇—〉丙酮—〉乙醇。
挥发性物质也有很多带羰基、羟基的，但从它的挥发性就可以明白，分子间作用力不强，另外，母核与石油醚、正构烷和苯的结构差异小，估计更容易脱离硅胶吸附，更快进入溶剂中，而不需要通过提高展开剂的极性。
（3）皂苷类。
人参皂苷：
氯仿－甲醇－水（65:
35:
10）10℃以下放置的下层溶液或正丁醇－醋酸乙酯－水（4:
1:
5）的上层溶液或氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水（15:
40:
22:
10）10℃以下放置的下层溶液、芍药苷：
氯仿－醋酸乙酯－甲醇－甲酸（40:
5:
10:
0.2）、黄芩苷：
醋酸乙酯－丁酮－醋酸－水（10:
7:
5:
3）、橙皮苷：
苯—醋酸乙酯—甲酸—水（1:
12:
2.5:
3）的上层溶液、葛根素：
氯仿－甲醇－水（14:
5:
0.5）、芦丁：
醋酸乙酯－甲酸－水（8:
1:
1）。
这类物质，由于存在糖的多羟基结构，苷元的结构影响变小。
展开剂中使用极性大的有机溶剂（氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇）和水。
乙酸和甲酸的使用，一方面增大展开剂极性，另外也可以抑制硅胶羟基的作用，减少拖尾。
由于混溶性和硅胶耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。
（4）极性大的小分子有机酸。
没食子酸：
氯仿－醋酸乙酯－甲酸（5:
4:
1）、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸、异绿原酸。
这类物质多数是苯乙烯母核的，这个结构的极性本身比较大，另外有酚羟基和羧酸基团，个别有多羟基配基。
皂苷的展开剂差不多，极性大。
注意甲酸通常指的是浓度85%左右的，含有水。
（5）含氮有机物。
盐酸小檗碱：
苯－醋酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液（12：
6：
3：
3：
0.6）（氨蒸气饱和）或正丁醇－冰醋酸-水（7:
1:
2）、麻黄碱：
氯仿－甲醇－浓氨试液（20:
5:
0.5）或正丁醇－冰醋酸－水（8:
2:
1）、甘草酸铵：
醋酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水（15:
1:
1:
2）。
由于NH2硅醇基的作用很强，在强极性展开剂加有机酸、有机碱扫尾。
对于极性化合物，使用正丁醇对斑点扩散影响较小，因为化合物和硅胶的作用强。
进行薄层分析基本可以根据母核、基团，选择相似的化合物对号入座。
当然，具体的条件优化则需要根据实际情况了。
遇到较困难的分离，需要使用到设计优化方法的，已经不属于本文讨论范围了。
2、有机合成中展开剂的选择
做有机合成时走板子是常有的事，展开剂的选择就至关重要了,选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：
石油迷<己烷<苯<乙醚
Petroleumether/Ethylacetate,petroleumether/Acetone,Petroleumether/Ether,Petroleumether/CH2Cl2,ethylacetate/MeOH,CHCl3/ethylacetate
展开剂的比例要靠尝试.一般根据文献中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。
展开剂的选择条件：
①对的所需成分有良好的溶解性；②可使成分间分开；③待测组分的Rf在0.2~0.8之间，定量测定在0.3～0.5之间；④不与待测组分或吸附剂发生化学反应；⑤沸点适中，黏度较小；⑥展开后组分斑点圆且集中；⑦混合溶剂最好用新鲜配制。
一般来说，弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成，再根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性，以达到好的分离效果，适合于生物碱、黄酮、萜类等的分离；中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离；强极性溶剂，由正丁醇和水组成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适合于极性很大的生物碱类化合物的分离。
很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。
我们在实验中，为了实现一个配体与其他杂质有效分离，曾经尝试了很多种的溶剂组合，最后才找到石油醚—EtOAc—HCOOH（5.5：
3.5：
0.1）混合溶剂。
一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例（或者加入第三种溶剂）,达到最佳效果；如果没有分开的迹象（斑点较“拖”），最好是换溶剂。
对于在硅胶中这种酸性物质上易分解的物质，在展开剂里往往加一点点三乙胺，氨水，吡啶等碱性物质来中和硅胶的酸性。
（选择所添加的碱性物质，还必须考虑容易从产品中除去，氨水无疑是较好的选择。
）分离效果的好坏和所用硅胶和溶剂的质量很有关系：
不同厂家生产的硅胶可能含水量以及颗粒的粗细程度，酸性强弱不同，从而导致产品在某个厂家的硅胶中分离效果很好，但在另一个厂家的就不行。
溶剂的含水量和杂质含量对分离效果都有明显的影响。
温度，湿度对分离效果影响也很明显，在实验中我们发现有时同一展开条件，上下午的Rf截然不同展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑在进行薄层层析时，首先应该知道未知化学成分的类型，其极性的大致归属，从提取液或从色谱柱的流动相极性可知，另外某样品里含多种化学成分先按极性不同大致分，然后细分，对于分离未知的化学物质，展开剂的选择也是一个摸索的过程，不应该仅仅从展开剂考虑，多因素综合衡量！
溶剂：
层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。
在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。
洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。
如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。
在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。
溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。
然后渐增大溶剂的极性。
这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。
如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。
溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。
介电常数高，洗脱能力就大。
以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。
对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。
3．被分离物质的性质：
被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。
在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分
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