兔颞下颌关节盘前移位后凋亡调控信号Bcl2及Bax在髁突软精.docx

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兔颞下颌关节盘前移位后凋亡调控信号Bcl2及Bax在髁突软精

５２０Ｊｏｕｍａｌｏｆ０ｒａｌｓｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ，０ｃｔ．２００８，Ｖ０１．２４，Ｎｏ．５

兔颞下颌关节盘前移位后凋亡调控信号ＢｃＩ一２

及Ｂａｘ在髁突软骨细胞表达的研究

肖进ｈ

刘登峰１徐兴侨１詹静２谷志远３

３２５０２７；

（１．温州医学院附属口腔医院口腔颌面外科浙江温州

２．浙江大学附属绍逸夫医院口腔科；３．浙江大学附属口腔医院）

［摘要】

目的：

研究颞下颌关节盘前移位后凋亡调控基因ｂｃｌ一２及ｂ腿在髁突软骨细胞表达的变化。

方法：

１７只

日本大白兔随机分组，实验组行右侧颞下颌关节手术，人工造成颞下颌关节盘前移位，分别经１、２、４周后处死动

物，Ｗｅ９ｔ唧ｂｌｏｔ检测侧髁突软骨ｂｃｌ一２及ｂａ】【表达。

结果：

实验组较对照组ｂａ）【蛋白含量增加，且随着术后时间的

延长而增加。

ｂｃｌ一２蛋白则相反，实验组较对照组动物关节软骨内表达减少，且随着术后时间的延长而进一步递减。

结论：

在颞下颌关节盘前移位后软骨凋亡过程中ｂｃｌ一２／ｂ缸可能起一定调控作用。

［关键词】颞下颌关节关节盘前移位细胞凋亡Ｂｃｌ一２［中图分类号］

Ｒ７８２．６

Ｂ缸

［文献标识码］Ａ［文章编号］１６７１—７６５ｌ（２００８）０５—０５２０—０３

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Ｂｃｌ一２Ｂ胍

细胞凋亡是一个主动的、受多种基因调控、多种酶参与的复杂过程，涉及一系列信号传递系统的调节。

Ｂｃｌ一２家族是凋亡信号调节中最重要的基因家族，此家族成员按功能不同可分为抗凋亡和促凋亡两大类。

Ｂｃｌ一２和Ｂａ】【是此家族中两个最重要成员，它们表达量的变化对细胞存亡有重要影响。

研究发现Ｂｃｌ一２／Ｂ缸两种蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素…，Ｂｃｌ一２可与Ｂａ】【形成同源或异源蛋白二聚体．而特定的蛋白二聚体可作为细胞死亡信号通路上的分子开关。

通过研究我们已经明确了颞下颌关节盘前移位后关节软骨细胞凋亡增加，且与Ｆａｓ／Ｆ鹊Ｌ的相互作

作者简介肖进（１卯３一），男，安徽人．讲师，医学博士，主要从事口

腔颌面外科学临床和基础研究。

・通讯作者肖进，电话：

（０５７７）８８０６３０３Ｉ

用有密切关系。

但Ｂｃｌ一２、Ｂａ）【在颞下颌关节盘前移位后软骨细胞的表达及其变化等尚未见报道。

本实验对颞下颌关节盘前移位后关节软骨细胞表达Ｂｃｌ一２、Ｂａ）【进行研究，初步探讨颞下颌关节盘前移位后关节软骨细胞凋亡可能的调控因素。

ｌ材料与方法

１．１动物分组及模型建立

日本大白兔１７只，由

浙江大学动物实验中心提供，１年龄，雌雄不限，体重２．５—３．ｏｋｇ。

随机抽取其中２只作空白对照组，不作任何处理。

随机抽取模拟手术组大白兔６只，均分为３组，在其右侧颞下颌关节作模拟手术，但不移动关节盘，并于手术后１、２、４周分别处死各ｌ组。

其余９只作为实验手术组，均分为３组，作右侧颞下颌关节盘前移位模型，并分别于术后ｌ、２、４周处死。

动物模型建立如文献［２，３］。

ｊ

１．２标本制备、蛋白提取动物按期空气针静脉栓

口腔医学研究２００８年ｌＯ月第２４卷第５期

塞法处死，完整取得右侧颞下颌关节软骨，双蒸水漂洗，立即置入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，一８０℃储存。

储存的软骨组织生理盐水冲洗一遍，加５００ｍＬ蛋白质提取液并转移到匀浆器中，置冰水上研磨，４℃１２０００ｒ／

ｍｉｎ离心ｌＯｍｉｎ，转移上清到另一新离心管。

吸取

５０斗Ｌ蛋白，加ｌＯ斗Ｌ６×蛋白加样缓冲液。

１．３

Ｗｓｔｅｍｂｌｏｔｔｉｎｇ

１．３．１抗体及其工作浓度兔抗Ｂｃｌ一２、兔抗Ｂａ】【（ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，加拿大），工作浓度分别为１：

１５００及１：

１０００。

山羊抗Ａｃｔｉｎ购买于（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ，美国），工作浓度为ｌ：

２０００。

二抗为鼠抗兔ＩｇＧ，工作浓度为ｌ：

２０００；Ａｃｔｉｎ的二抗为抗羊ＩｇＧ，工作浓度为１：

２０００。

１．３．２

ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔｔｉｎｇ用５％的脱脂奶粉室温封

闭２ｈ，加入一抗，一抗按照不同抗体稀释，室温结合

２

ｈ。

用ＴＢＳＴ洗膜室温洗膜３次，每次１０ｍｉｎ。

加

入二抗（１：

２０００），室温结合１ｈ。

用ＴＢｓＴ洗膜室温洗膜４次，每次１０

ｌＩｌｉｎ。

ＥＣＬ

ｓｏｌｕｔｉｏｎ显色，加底物

显色液，结合１ｍｉｎ，将膜速封，放人Ｘ光片盒，在暗室中放人Ｘ光胶片１ｍｉｎ，使胶片与膜接触曝光。

放入显影液中ｌ万方数据

ｍｉｎ，清水漂洗，放入定影液中，透明为止。

吹干，分析。

１．３．３图像分析及数据处理Ｂ—Ａｃｔｉｎ作为内参照，Ｂｉｏｓｅｎｓ６ｃ３００软件扫描，比较各组ｗｅｓｔｅｍ

ｂｌｏｔ—

ｔｉｎｇ各组结果相对光密度值。

实验数据结果采用石；ｔ５进行表示，￡检验比较两组之间差异，Ｐ＜０．０５为显著性水平。

２结果

２．１

Ｂｃｌ一２蛋白Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔｔｉｎｇ结果Ｂｃｌ一２分

子量约为２６ＫＤ，在电泳膜上相对处可见相应条带。

比较可见在免疫印迹的ＰＶＤＦ膜上正常对照组、模拟手术组颞下颌关节软骨细胞中Ｂｃｌ一２表达条带稍宽，手术后１周表达与正常对照组、模拟手术组相似；术后２周表达有下降，术后４周其表达进一步下降，见图ｌ。

Ｂ—ａｃｔｉｎ作为内参照，定量检测其表达。

正常对照组Ｂｃｌ一２表达的相对Ａ值为３２３６±１４９．５，模拟手术组为２９２０±３９４．６，颞下颌关节盘前移位手术后１周Ｂｅｌ一２表达为２８７７±１２６，手术后２周其表达相对Ａ值为２１８５±１８４．９，手术后４周则为１５０６±１８５．４。

￡检验对照组与模拟手术组之间差异无统计学意义；模拟手术组之间差异无统计学意义；对照组、模拟手术组与手术后ｌ周组之间差异无统计学意义；对照组、模拟手术组与手术后２周与手术后４周之间差异有统计学意义；手术后ｌ周与手术后２周、４周之间差异有统计学意义。

５２ｌ

ｌ：

正常对照组；２：

模拟手术组；３、４：

颞下颌关节盘前移位后１周；６：

颞下颌关节盘前移位后２周；７、８：

颞下颁关节盘前移位后４周

图ｌ

Ｂｃｌ一２在颗下颌关节软骨细胞中的表达情况

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正常对照组；２：

模拟手术组；３、４：

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颞下颌关节盘前移位后２周；７、８：

颞下颌关节盘前移位后４周

围２Ｂ“在颞下颌关节软骨细胞中表达情况

Ｆ毡．２

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２．２

Ｂａ】【蛋白Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔｔｉｎｇ结果Ｂａ】【分子量为

２ｌＫＤ，在电泳膜上相对处可见相应条带。

比较可见在免疫印迹的ＰＶＤＦ膜上正常对照组、模拟手术组颞下颌关节软骨细胞中表达相对较少，颞下颌关节盘前移位手术后１周关节软骨细胞中Ｂａｘ表达上调；术后２周表达明显增加，术后４周与术后２周相比表达进一步增加，见图２。

Ｂ—ａｃｔｉｎ作为内参照，定量检测其表达。

Ｂａ】【蛋白表达在正常对照组相对４值为２１５２±２５７．９，模拟手术组为２１８６±２０８．６，手术后ｌ周其表达为２６６８±７７．６，手术后２周为２８２６±６７。

手术后４周则为３１６９±９５。

８。

￡检验对照组与模拟手术组之间差异无统计学意义；模拟手术组之间差异无统计学意义；对照组、模拟手术组与手术后ｌ周、２周、４周各组之间差异有统计学意义；手术后１周与手术后４周、手术后２周与４周之间差异有统计学意义；手术后１周与２周组之间差异无统计学意义。

裹ｌ各组Ｂｃｌ一２与ＢⅡ之间比值

ＴｈｂＩｅｌ

Ｔｈｅ

ｒ丑ｔｉｏｏｆ

Ｂｃｌ一２／Ｂａｘｉ±ｓ

２．３

Ｂｃｌ一２／Ｂａｘ比值各组Ｂｃｌ一２与Ｂａｘ之间比

值呈逐渐减小的趋势，见表ｌ。

３讨论

本研究中我们观察到Ｂｃｌ一２在颞下颌关节盘

前移位后软骨细胞中表达减弱，且随着时间延长减

５２２

弱更加明显；Ｂａｘ在软骨细胞中表达则与此相反，手术组较对照组及模拟手术组表达增高，且随着时间延长增加更加明显。

颞下颌关节盘前移位后Ｂｃｌ一２／Ｂ缸比例减小，提示Ｂｃｌ一２及Ｂａｘ参与了颞下颌关节盘前移位后软骨细胞凋亡的调控。

Ｂｃｌ一２家族中抑制和促进细凋亡两类蛋白的比例决定了细胞在受到凋亡刺激信号时是否发生凋亡。

研究发现Ｂｃｌ一２／Ｂａ）【两种蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，在Ｂｃｌ一２表达较少的情况下，Ｂａ）【之间形成同源二聚体，促进凋亡发生，当Ｂｃｌ一２表达过量时，Ｂｃｌ一２和Ｂａｘ分子形成异源二聚体，抑制凋亡发生¨’４ｏ。

Ｂｃｌ一２的表达受到复杂的调控。

ｂｅｌ一２基因在转录和蛋白质翻译等各个阶段都受到严格的调控。

Ｂｃｌ一２基因有两个启动子，其中主要起作用的是第一个启动子（ｐｍｍｏｔｅｒ１，ｐ１）”Ｊ。

研究发现在

ｂｃｌ一２启动子区存在一个受ｐ５３间接调控的位

点∞Ｊ，它的激活可以抑制ｂｃｌ一２的Ｐｌ转录活性。

进一步的研究显示在一些不表达ｐ５３基因的细胞中，如果给予外源性ｐ５３会导致ｂｃｌ一２ｍＲＮＡ及其蛋白质水平下降，说明ｐ５３对ｂｃｌ一２的表达起负调万方数据

控作用。

此外，ｐ５３基因还可以与ｂａ）【基因的顺式作用元件结合从而上调其表达＂Ｊ。

Ｃ—Ｍｙｂ则可以正调控ｂｃｌ一２的表达。

Ｂｃｌ一２蛋白的翻译及翻译后修饰也是调节其表达，从而也是调控细胞调亡的关键因素之一。

Ｃａｓｐａｓｅｓ是在细胞凋亡过程中起关键作用的蛋白酶家族，它们对ＢｃＩ一２家族的蛋白质具有重要的酶解修饰作用，从而达到调节作用。

ｂｃｌ一２等的表达也受到细胞因子的调控¨Ｊ。

颞下颌关节盘前移位后关节内应力等环境的改变如果长期存在，可能会导致凋亡信号产生并启动，与此同时多种基因表达发生变化，研究表明ｐ５３、ｃ—ｍｙｃ等在变性的关节软骨细胞中表达明显高于正常一．１０Ｊ。

这些可能都会引起ｂｃｌ一２基因家族在其转录、翻译等阶段即开始适应新的变化了的环境，从而启动其新的表达方式。

颞下颌关节盘前移位后ｃａｓｐ鹊ｅｓ表达的增高对ｂｃｌ一２基因家族的表达也有重要影响。

Ｂｃｌ一２及Ｂａｘ在细胞凋亡过程中起重要的调控作用。

颞下颌关节盘前移位后软骨细胞凋亡增加，本研究发现颞下颌关节盘前移位后Ｂｃｌ一２在软骨细胞表达减弱，且随着时间的延长而更加明显，Ｂａｘ的凋亡则与此相反。

提示Ｂｃｌ一２与Ｂ戕参与了颞下颌关节盘前移位后软骨细胞凋亡的调控。

Ｂｃｌ

Ｊ叫咖ｌ“０ｒａｌ

ｓｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ，０ｃｔ．２００８，Ｖ０１．２４，Ｎｏ．５

一２及Ｂａｘ本身在其基因的转录、翻译及蛋白质的表达等阶段也受到复杂、精确的调控，推测颞下颌关节盘前移位后关节内环境的改变、细胞因子的释放、ｃ鼬ｐａｓｅｓ的增加等都对Ｂｃｌ一２及Ｂａｘ的表达产生影

响。

因此进一步的研究是必要的，如凋亡信号与

Ｂｃｌ一２及Ｂａｘ基因互相影响的机制，Ｂｃｌ一２基因家族表达的调控因素以及干预其基因的表达是否会产

生治疗效果等等。

另外，力学因素对软骨细胞已有

所影响¨１｜，其中是否有凋亡基因的参与，也有待进一步研究。

参考文献

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［收稿日期：

２００８一ｏＩ一２３】（本文编辑李四群）