《乳与乳制品 乳脂肪中植物脂肪的测定》编制说明.docx
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《乳与乳制品乳脂肪中植物脂肪的测定》编制说明
《乳与乳制品乳脂肪中植物脂肪的测定》编制说明
引言
乳制品中加入植物脂肪的现象较为普遍，特别是在各类配方奶粉中基本都加入一定量的植物油，以调节不饱和脂肪酸的含量。
但一些乳制品如全脂奶粉、脱脂奶粉等标准中规定不得加入任何植物脂肪。
近几年来，一些企业为降低成本，追求暴利而用植脂末代替乳脂肪、以动物水解蛋白代替乳蛋白、以糊精类物质代替乳糖等方式掺入乳粉中的造假现象。
基于此种原因，我中心于近年来陆续开展了这三类物质的检测技术研究，并分别建立了定性或定量的检测方法，为严厉打击掺假、造假行为提供技术支持。
并于2007年通过全国乳品标准化中心向国家标委会提出了制定该标准的申请。
1、任务来源、起草单位、验证单位和主要起草人
任务来源：
国家标准化管理委员会
任务编号：
20071137-T-469
起草单位：
国家乳制品质量监督检验中心
归口单位：
全国乳品标准化中心
验证单位：
国家乳制品质量监督检验中心，青岛圣元营养乳品有限公司，内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，农业部乳品质量监督检测中心（哈尔滨）
主要起草人：
2、制定标准的必要性和意义
2.1维护消费者健康的需要
乳制品的掺假、造假会严重危害消费者的健康。
一是用其他物质替代如成分后其营养价值大幅降低。
因乳脂肪、乳蛋白等都是极易被人体吸收利用的营养物质，掺入其他成分就大大降低甚至不含有乳成分，而掺入的其他成分如植脂末等人体易于吸收利用的多不饱和脂肪酸很少；二是若使用价格低廉的饲料级原料时可能带入重金属等有害物质，会对人体健康造成严重影响。
2.2国家政府部门食品安全监管的需要
我国自实施食品质量安全市场准入制度以来，对规范食品质量安全生产、保护广大消费者的利益等起到了极为重要的作用。
在全脂乳粉等乳制品中明确规定不得使用非乳成分进行生产；在食品生产许可证审查细则中明确规定不得使用费食品级原料等。
违规使用其他原料或添加剂都是政府食品监管机构严厉打击的一种掺假造假行为。
近年来国家质检总局也陆续接到举报说，在山东、河北等地，个别企业使用动物水解蛋白、植脂末等物质掺入乳粉中生产全脂乳粉。
为此我中心于2007年第四季度针对举报中提到的问题执行了一次全国的大包装乳粉的专项监督抽查任务，并按时完成了任务。
在这项任务中涉及的技术问题如动物水解蛋白、糊精类物质、植脂末等的测定目前无相应的国家标准，全部根据我们多年的研究并形成相应的检测方法后，经国家质检总局批准后使用的。
所以建立完善的技术标准体系对政府执法而言非常重要，本标准的制定就是为政府执法提供技术法规的支持。
对食品安全监管起到非常重要的作用。
2.3完善国家标准的需要
在国际标准中，测定乳制中植物脂肪的标准有ISO3594-1976:
Milkfat-Detectionofvegertablefatbygas-liquidchromatographyofsterols（Referencemethod）、ISO3595-1976:
Milkfat-Detectionofvegertablefatbythephytosterylacetatetest、FIL-IDF32:
1965DetectionofVegertablefatinmilkfatbythephytosterylacetatetest。
但因这些标准制定的较早，受当时仪器设备的限制，已不适于现在工作的需要。
特别是我国现有的检测方法标准中，缺失这个标准。
这也是完善食品检测方法国家标准的需要。
3、起草过程
3.1前期工作
2006年，根据企业的要求及国家有关执法部门执法的需要，针对乳制品的掺假现象，我们开始立项开展“乳制品中植物脂肪的鉴定”方法研究。
根据谷乳脂肪与植物脂肪成分的差异，首先我们搜集了国内外相关文献方法及相关标准后，组织技术人员研究制定了技术路线，并开展了研究工作。
首先我们针对能否对植物脂肪进行定量的问题进行了研究，发现因植物油的种类不同（如大豆油、棕榈油等）、品种不同（色拉油、豆油等）无论采用脂肪酸组成的差别还是采用植物甾醇地含量都无法进行定量。
定性可靠方法就是根据植物油中含有的特征组分，据此我们确定采用植物甾醇来鉴定。
植物甾醇主要有四个组分，即菜油甾醇、菜子甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇。
其中只有β-谷甾醇是所有植物油中所共有的成分，却含量除个别植物油（菜子油）外，β-谷甾醇的含量较高，即时精炼的植物油（如色拉油）中也残留少量的β-谷甾醇，在现代仪器水平条件下都能被准确检出。
据此我们气相色谱法进行测定经实验证明基本可行。
而后对此方法进行优化后，组织相关技术人员开始按照国家标准制定的要求对方法进行验证，对方法的适用范围、采用的标准、验证方法等方面进行了分析和确认，目前已完成了实验室验证工作。
验证后认为此方法操作简单、准确、快速，并通过制备乳粉中加入及未加入植物油的样品进行测定后证明：
该方法能准确进行定性测定，特别是采用质谱检测器可利用现有质谱库，不需标准物质就可通过谱库检索后进行定性。
基本符合制定国家标准的条件，并于2007年向国家标委会提出立项的申请。
3.3实验室间验证工作
2008年6月28-30日全国乳品标准化中心在青岛组织召开了标准制修订工作会议后，将我们提交的标准文本作了详细的研讨，专家一致认为：
此方法对于鉴定乳脂中植物脂肪技术可靠、操作简单等，并制止通过了下一步的验证工作。
根据会议精神，我们立即统一制备了三个水平的标准样品。
邀请了全部通过CNAS认可的实验室青岛圣元营养乳品有限公司，内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，农业部乳品质量监督检测中心（哈尔滨）等单位进行了实验室间的验证工作。
通过统计分析各个实验室的检测数据，鉴定结果完全一致。
参加验证的实验室一致认为：
该方法用于测定乳制品乳脂中植物脂肪的测定，其结论准确可靠，操作简单、快速等特点。
并将方法整理成为征求意见稿。
4.制定标准的原则和依据。
目前测定乳脂中植物脂肪的测定方法有三个国际标准，都是上世纪七十年代制定的：
ISO3594-1976:
Milkfat-Detectionofvegertablefatbygas-liquidchromatographyofsterols（Referencemethod）、ISO3595-1976:
Milkfat-Detectionofvegertablefatbythephytosterylacetatetest、FIL-IDF32:
1965DetectionofVegertablefatinmilkfatbythephytosterylacetatetest。
这三个标准都是定性的方法，以测定植物甾醇作为特征指标判定是否含有植物脂肪。
其中两个为化学方法，操作繁琐、准确定较差；另一个为气相色谱法，但因当时无毛细管气相色谱法，采用的是填充柱的方法。
从标准提供的色谱图等资料看：
由于该方法柱效较低、分离度差、检出限低等已无法满足测定加入含有痕量β-谷甾醇的精炼油等植物脂肪的测定。
但现在的毛细管柱气相色谱法柱效、检测器灵敏度等仪器性能的大幅度提高等可以满足测定要求。
但测定依据仍引用上述三个国际标准的方法进行判定植物脂肪。
气相色谱与相信色谱-质谱联用仪对绝大多数质检机构及大中型企业而言是较为常用的仪器设备，所以在制定该标准时结合这一特点同时将两种方法都写入标准。
其中将GC-FID方法为定量测定β-谷甾醇方法；GC-MSD方法即可定性也可定量测定β-谷甾醇。
由于该标准中只能定性判定乳脂中是否含有植物脂肪的成分，所以在测定中只要确定含有β-谷甾醇即可做出判定，无论对β-谷甾醇定性或定量，检测结果都是检出或未检出植物脂肪。
所以若采用GC-MSD方法测定时，可直接用总离子流图通过库检索的方式即可判定是否为β-谷甾醇的成分，无须再通过标准品进行定型或定量。
对已具备GC-MS的单位测定植物脂肪时在五标准品的情况下也可开展植物脂肪的测定工作，这可省却购买标准品的时间与费用。
考虑到这一因素，在本次制定该标准时，只将GC-MS的定性方法写入标准，为检测等机构提供了更加准确、快速的方便条件。
5标准主要条款的说明
5.1标准名称
《乳与乳制品乳脂肪中植物脂肪的测定》。
5.2范围
以乳或乳粉等为主要原料，经加工制成的各类乳与乳制品。
5.3样品的处理方法
植物甾醇在油脂中分子量较大，样品经加碱皂化后将油脂中的脂肪酸形成水溶性的盐；然后用石油醚提取植物甾醇后通过净化、浓缩后就可用于测定。
由于植物甾醇化学性质稳定，在强碱及加热的条件下都不会分解。
在皂化条件上，我们选用常用的氢氧化钾-乙醇进行，造化温度采用70℃、80℃、90℃及沸水浴分别造化一小时，对测定结果进行比较后认为在沸水浴条件下既不破坏甾醇、又能使脂肪皂化更彻底，制备的样液杂质较少。
所以选用沸水浴皂化1小时的条件。
用有机溶剂萃取，一般选用正己烷、石油醚、乙醚等。
经实验这三种溶剂都可用于萃取甾醇，但考虑到石油醚价格低廉、更易浓缩吹干等，选用石油醚作为萃取试剂。
一般萃取一次其萃取率可达95%，二次就可打99%以上，所以整个萃取2-3次即可。
在旋转蒸发器上蒸发浓缩可以采用刚好将石油醚吹干后用正己烷溶解残渣并转移定容至10ml混匀后即可转入GC瓶中上级测定。
5.4色谱柱及条件的选择
5.4.1色谱柱的选择：
由于甾醇分子量较大，相对于其他组分保留时间较长，只要能将四种甾醇能有效分离就可满足测定要求。
首先我们选用了非极性的通用性毛细管柱HP-5。
经试验不但能将待测液中其他组分分离，同时这四种甾醇及相似的杂质都可实现基线分离。
且该色谱柱使用寿命较长、重现性好、价格低廉等特点。
5.4.2色谱条件的选择
为保证样品在进样口能全部气化，采用的气化温度较高为300℃；柱温箱的温度开始采用梯度升温的方式：
起始温度100℃，20℃/min速率升温至180℃，30℃/min升至230℃；保持1min，30℃/min速率升至280℃，保持5min。
分离度也较好，但时间较长。
后根据甾醇的性质，改为280℃恒温的条件分离同样达到了分离要求，且缩短了仪器的平衡时间，测定时间缩短至15min内，确定采用恒温280℃方式。
由于样品中甾醇含量的波动较大，特别是对加入经过精炼的植物油，其豆甾醇较正常的植物油要低得多。
所以进样方式采用不分流进样。
GC-MSD测定标准及全脂奶粉、婴幼儿奶粉中
植物甾醇总离子流图及质谱图
图一、植物甾醇及胆固醇标准样品总离子流图
图二|、胆固醇（Cholesterol）质谱图
图三|、豆甾醇（Sigmasterol）质谱图
图四、β-谷甾醇（β-Sitosterol）质谱图
图五、婴幼儿奶粉样品总离子流图
图六、菜子甾醇（Brassicasterol）质谱图
图七、菜油甾醇（Campesterol）质谱图
图八、奶油样品总离子流图
GC-FID的β-谷甾醇标准、样品色谱图
图九、β-谷甾醇标准色谱图
图十、1号样品（全脂奶粉）色谱图β-谷甾醇未检出
图十一、2号样品（婴幼儿配方奶粉）β-谷甾醇含量为22.4mg/100g
图十二、3号样品（婴幼儿配方奶粉）β-谷甾醇含量为6.4mg/100g
5.5分析结果的计算
气相色谱法质谱或氢火焰离子化检测器测定乳制品中植物脂肪是以β-谷甾醇为特征指标来判定是否含有植物脂肪的成分。
由于乳制品中添加的植物油种类等的不同，β-谷甾醇含量差距较大，无法通过该组分定量的方式准确测定植物脂肪的含量。
只能对其进行定性。
为便于实验室根据仪器设备及试剂测定植物脂肪，我们制定了两种测定方法：
一是毛细管气相色谱分离后用质谱检测器测定；二是采用氢火焰离子化检测器测定。
这两种方法即可对β-谷甾醇进行定性测定，又可进行定量测定。
前者只要有GC-MSD可不需要β-谷甾醇的标准品也可通过质谱库检索的方式检测植物脂肪；而后者就需β-谷甾醇标准品才能测定。
所以在标准中我们将两种检测方式都被列入，以便检测时选择使用。
5.5.1GC-MSD法测定植物脂肪的结果分析：
目前质谱检测技术是非常成熟的技术，都配备有标准的质谱库，这为许多化合物的定性分析提供了极大的方便。
我们在制定该标准时依据国际相关标准中测定乳脂肪中的植物脂肪只能定性的特点，首先选用了GC-MS的方法测定植物脂肪。
可对所有植物甾醇物质一一进行确认。
我们同时测定了多种植物油及奶粉、配方奶粉等多个样品，在采用标准质谱库进行检索定性的同时，我们同时测定了标准β-谷甾醇通过保留时间进一步确定其可靠性。
结果列于表1。
GC-MSD测定植物甾醇结果
样品名称
胆固醇
菜油甾醇
菜子甾醇
豆甾醇
β-谷甾醇
大豆油
未检出
检出（匹配度88%）
检出（匹配度99%）
检出（匹配度98%）
检出（匹配度99%）
大豆色拉油
未检出
检出（匹配度90%）
检出（匹配度96%）
检出（匹配度95%）
检出（匹配度98%）
花生油
未检出
检出（匹配度85%）
检出（匹配度96%）
检出（匹配度95%）
检出（匹配度90%）
棕榈油
未检出
检出（匹配度81%）
检出（匹配度98%）
检出（匹配度95%）
检出（匹配度85%）
核桃油
未检出
未检出
未检出
未检出
检出（匹配度95%）
麻油
未检出
检出（匹配度90%）
检出（匹配度98%）
检出（匹配度95%）
检出（匹配度98%）
植脂末
未检出
未检出
未检出
未检出
检出（匹配度96%）
稀奶油
检出（匹配度95%）
未检出
未检出
未检出
未检出
全脂奶粉
检出（匹配度99%）
未检出
未检出
未检出
未检出
婴幼儿奶粉
检出（匹配度99%）
检出（匹配度94%）
检出（匹配度95%）
检出（匹配度96%）
检出（匹配度83%）
上述鉴定结果表明：
植物油中全部可鉴定出含有β-谷甾醇，但其他植物甾醇如核桃油等则不含有。
所以确定以β-谷甾醇作为鉴定植物脂肪的特征组分。
通过标准β-谷甾醇的保留时间与质谱库检索相结合的方式，可确定若质谱的匹配度在≥80%时，可定性为β-谷甾醇。
若对β-谷甾醇进行定量测定，可采用选择离子扫描定量，监测离子为81m/z、105m/z、145m/z、414m/z。
现将测定结果列于表2。
不同测定方法测定β-谷甾醇结果比较（mg/100g）
样品名称
大豆油
大豆色拉油
花生油
麻油
棕榈油
核桃油
植脂末
稀奶油
婴幼儿奶粉
全脂
奶粉
GC-MSD法
262.8
150.3
247.1
245.9
16.0
134.3
19.7
未检出
56.0
未检出
GC-FID法
262.3
150.8
247.6
246.3
16.4
134.9
20.1
未检出
56.3
未检出
采用GC-MS定量测定的结果与采用GC-FID结果间无显著差异，即结果完全相符。
5.5.2GC-FID法测定植物脂肪的结果分析：
GC-FID几乎所有的实验室都具备，此方法测定乳脂中植物脂肪更加方便。
为此我们对用于GC-MSD测定的样品又采用了GC-FID进行了测定。
通过定量结果与GC-MSD基本一致，这里不再列出。
5.6最低检测限
根据GB/T5009.1-2003，中A2.2吸光法和荧光法中的计算方法。
计算检出限：
式中：
b－标准曲线回归方程中的斜率。
s—二次空白值的标准偏差;
K—根据一定置信度确定的系数,
GC-FID法确认样品中β-谷甾醇检出限为50µg/100g。
5.7回收率实验：
我们选择一个婴幼儿样品，添加不同水平的β-谷甾醇采用GC-FID进行了回收率实验结果列于表3：
β-谷甾醇回收率实验结果
水平
样品β-谷甾醇测定值（µg）
加标量（µg）
加标后测定值（µg）
回收率%
1
28.0
10.0
37.4
94.0
2
20.0
47.3
96.5
3
30.0
58.1
100.3
4
40.0
66.8
97.0
5
50.0
76.3
96.6
平均
96.9
5.8实验室间方法验证结果
为确定方法的可靠性，我们制备了三个水平的样品：
水平1为全脂奶粉（不含植物脂肪），水平2、3为婴幼儿配方奶粉。
共组织四家实验室对该方法进行验证。
结果如下：
5.8.1GC-FID方法验证结果
5.8.1.1β-谷甾醇测定结果
参加该项验证的实验室为三家：
青岛圣元营养乳品有限公司，国家乳制品质量监督检验中心，农业部乳品质量监督检测中心（哈尔滨）。
结果如下：
青岛圣元营养乳品有限公司结果：
测定次数
水平1
水平2
水平3
1
0.00
6.41
22.43
2
0.00
6.32
22.55
3
0.00
6.53
22.35
4
0.00
6.45
22.22
5
0.00
6.41
22.45
6
0.00
6.35
22.48
7
0.00
6.34
22.29
8
0.00
6.38
22.46
平均值
0.00
6.40
22.39
标准偏差
-
0.068
0.094
相对标准偏差CV%）
-
1.06
0.42
国家乳制品质量监督检验中心结果：
测定次数
水平1
水平2
水平3
1
0.00
6.13
22.03
2
0.00
6.12
22.21
3
0.00
6.03
22.35
4
0.00
6.25
22.22
5
0.00
6.31
22.01
6
0.00
6.15
22.23
7
0.00
6.06
22.09
8
0.00
6.12
22.36
平均值
0.00
6.15
22.19
标准偏差
-
0.093
0.134
相对标准偏差CV%）
-
1.51
0.60
农业部乳品质量监督检测中心（哈尔滨）：
测定次数
水平1
水平2
水平3
1
0.00
6.53
22.63
2
0.00
6.42
22.61
3
0.00
6.51
22.55
4
0.00
6.55
22.42
5
0.00
6.41
22.61
6
0.00
6.45
22.43
7
0.00
6.56
22.49
8
0.00
6.42
22.56
平均值
0.00
6.48
22.54
标准偏差
-
0.063
0.083
相对标准偏差CV%）
-
0.97
0.37
5.8.1.2精密度计算：
根据GB/T6379.2-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：
确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》进行统计计算重复性标准差与再现性标准差。
β-谷甾醇含量的单元平均值
实验室i
水平j
1
2
3
nij
nij
nij
青岛圣元营养乳品有限公司
0.00
8
6.40
8
22.39
8
国家乳制品质量监督检验中心
0.00
8
6.15
8
22.19
8
农业部乳品质量监督检测中心（哈尔滨）
0.00
8
6.48
8
22.54
8
β-谷甾醇含量的单元标准差
实验室i
水平j
1
2
3
sij
nij
sij
nij
sij
nij
青岛圣元营养乳品有限公司
（1）
0.00
8
0.068
8
0.094
8
国家乳制品质量监督检验中心
（2）
0.00
8
0.093
8
0.134
8
农业部乳品质量监督检测中心（哈尔滨）（3）
0.00
8
0.063
8
0.083
8
（1）、一致性和离群值的检查
科克伦检验：
n=8,p=3,科克伦检验5%临界值为0.707；1%临界着为0.793
对水平1，检验统计值=0
对水平2，实验室2的s最大：
Σs2=0.017242;检验统计值=0.502
对水平2，实验室2的s最大：
Σs2=0.033681;检验统计值=0.533
科克伦检验表明没有岐离值和离群值。
格拉布斯检验：
对单元平均值的格拉布斯检验
水平；
单个低值
单个高值
检验类型
1
0.00
0.00
格拉布斯检验统计量
2
1.104
0.813
3
1.023
0.966
岐离值
1.155
1.155
1.155
1.155
格拉布斯检验临界值
通过格拉布斯检验，未发现岐离值或离群值存在。
（2）、
srj和sRj的计算
实验室数p=3,重复次数n=8
水平2：
T1=Σni
=152.24
T2=Σni（
）2=966.1832
T3=Σni=24
T4=Σni2=192
T5=Σ（ni-1）sij2=0.12069
T5
sr2=————=0.0057
T3-p
T2T3-T12T3（p-1）
sL2=[————-sr2][————]=0.0289
T3（p-1）
T32-T4
sR2=sL2+sr2=0.0346
T1
mj=——=6.34
T3
水平3：
T1=Σni
=536.96
T2=Σni（
）2=12014.08
T3=Σni=24
T4=Σni2=192
T5=Σ（ni-1）sij2=0.235767
T5
sr2=————=0.0112
T3-p
T2T3-T12T3（p-1）
sL2=[————-sr2][————]=0.0295
T3（p-1）T32-T4
sR2=sL2+sr2=0.0407
T1
mj=——=22.37
T3
同理，分别计算水平2、3、4、5的：
sR2sr2列于表5
表5碘的mjsrjsRj计算值
水平j
Pj
srj
sRj
1
3
0
0
0
2
3
6.34
0.075
0.188
3
3
22.37
0.106
0.202
（3）、结论：
由于数据量较少，精密度与m间不存在明显的线性关系，测量方法精密度（以mg/100g表示）可引述如下（由于水平1β-谷甾醇未检出，计算时不予考虑）：
重复性标准差：
sr=0.0905
再现性标准差：
sR=0.195
根据GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：
化学分析方法》中附录D计算重复性限（r）和再现性限（R）:
重复性限（r）：
0.25
再现性限（R）：
0.55
β-谷甾醇统计结果
项目
水平1
水平2
水平3
参加实验室数目
3
3
3
可接受结果的数目
3
3
3
平均值（mg/100g）
0.00
6.34
22.37
重复性标准差
0.00
0.075
0.106
重复性变异系数
0.00
升级会员 