可溶性糖的测定.docx

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可溶性糖的测定

实验1可溶性糖的测定

一、实验目的

1．学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。

2．学习721型分光光度计的原理和操作方法。

二、实验原理

总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。

蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。

其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糖醛衍生物后与蒽酮（C14H10O）缩合成蓝色化合物。

溶液含糖量在150μg/ml以内，与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。

蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接作用，样品不必经过水解。

三、实验器材

1．试管（或具塞试管）2.吸量管及试管架（1ml、10ml）3．沸水浴4.冰浴

5．721型分光光度计

6．蒽酮试剂

称取100mg蒽酮溶于100ml98%硫酸溶液（A.R）中，用时配制。

7．葡萄糖标准溶液（100μg/ml）200ml

精确称取100mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定容至1000ml。

8．样品溶液200ml可自选待测物制成样品溶液。

举例：

称取500g市售白薯（或淀粉），洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆，4层纱布压滤、弃滤液溜渣，将渣放于烘箱内80～85℃烘干后，再用植物粉碎机（微型）研细，过筛，取100目筛下物为待测样品。

取样品在烘箱内105℃烘干，恒重后，精确称取1～5g，置于锥形瓶中，加入80ml沸蒸馏水，放入沸水浴。

不时摇动，提取0.5h。

取出立即过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤，合并滤液。

冷却至室温，用蒸馏水定容至100ml。

9．白薯。

四、实验步骤：

1．制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，编号后按下表操作。

编号

试剂（ml）

葡萄糖标准液（100μg/ml）

H2O

蒽酮试剂

1.0

0.1

0.9

0.2

0.8

0.3

0.7

0.4

0.6

0.4

0.8

0.2

每管加入葡萄糖标准液和水后立即混匀，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂后，同时置于沸水浴中，准确加热7min，立即取出置冰浴中迅速冷却。

待各管溶液达室温后，用1cm厚度的比色皿，以第一管为空白，迅速测其余各管的光吸收值。

然后以第2～7管溶液含糖量μg为横坐标，吸光度（OD620）为纵坐标，画出含糖量与OD620值的相关标准曲线。

2．测定样品的含糖量取4支试管按下表操作。

编号

试剂（ml）

样品溶液

H2O

蒽酮试剂

1.0

10.0

1.0

10.0

1.0

10.0

1.0

10.0

其他操作与制作标准曲线相同。

将第2～4管测出的OD620平均值，根据OD620平均值从标准曲线上查出相应的含糖μg数，再换算成100g样品中总糖的含量。

五、思考题：

用蒽酮比色法测定样品中糖含量时，应注意什么？

为什么？

实验2氨基酸的总量测定和纸层析分离鉴定

Ⅰ甲醛滴定法测定氨基氮

一、实验目的

初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。

二、实验原理

氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：

是弱酸，完全解离时pH为11～12或更高，若用碱滴定—NH3+所释放的H+来测量氨基酸，一般指示剂变色减小于10，很难准确指示终点。

常温下，甲配合能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使—NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH9.0左右）。

因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。

如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。

如样品是多种氨基酸的混合物，如蛋白水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。

但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度。

随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表示水解作用已完全。

三、实验器材

25ml锥形瓶，3ml微量滴定管，吸管。

0.1mol/L标准甘氨酸溶液：

准确称取750.7mg甘氨酸，溶解后定容至100ml。

0.1mol/L标准氢氧化钠溶液

酚酞指示剂：

0.5%酚酞的50%乙醇溶液

中性甲醛溶液：

在50ml36～37%分析纯甲醛溶液中加入1ml0.1%酚酞乙醇水溶液，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。

此试剂在临用前配制。

如已放置一段时间，则使用前需重新中和。

四、实验步骤

1．取3个25ml的锥形瓶，编号。

向第1、2号瓶内各加入2ml0.1mol/L的标准甘氨酸溶液和5ml水，混匀。

向3号瓶内加入7ml水。

然后向3个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2ml甲醛溶液，再混匀。

分别用0.1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。

重复以上实验2次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的ml数。

取平均值，计算甘氨酸基氮的回收率。

甘氨酸氨基氮回收率%=

公式中实际测得量为滴定第1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液ml数的平均值与3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液ml数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以14.008。

2ml乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘14.088。

即为加入理论量的mg数。

2．取未知浓度的甘氨酸深液2ml，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。

计算每ml甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg数。

氨基氮（mg/ml）=

式中：

未为滴定待对测液耗用标准NaOH溶液的平均ml数。

对为滴定对照液（3号瓶）耗用标准NaOH溶液的平均ml数。

mol/LNaOH为标准NaOH溶液的真实摩尔浓度。

五、思考题

选用酚酞指示剂，为什么滴定的是氨基？

Ⅱ氨基酸的纸层析法分离鉴定

一、实验目的

通过氨基酸的分离，学习纸层析法的实验原理及操作方法。

二、实验原理

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

层析溶剂由有机溶剂和水组成。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：

Rf=

在一定的条件下某种物质Rf值是常数。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、实验器材

1．层析缸2.毛细管

3．喷雾器4.培养皿

5．试析滤纸（新华一号）

6、试剂：

（1）扩展剂：

4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。

将20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，加入0.1%的茚三酮。

取漏斗内的扩展剂约5ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。

（2）氨基酸溶液：

赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）各5ml。

四、实验步骤：

1．将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。

2．取层析滤纸（长22cm、宽14cm）一张。

在纸的一端距边缘2～3cm处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如右图。

3．点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。

每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。

4．扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。

将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。

待溶剂上升15～20cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

5．显色将滤纸取出，置烘箱中烘烤5min（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。

6．计算各种氨基酸的Rf值。

五、思考题：

1．何谓纸层析法？

2．何谓Rf值？

影响Rf值的主要因素是什么？

3．怎样制备扩展剂？

4．层析缸中平衡溶剂的作用是什么？

实验3核糖核酸的分离、组分鉴定与定量分析

一、实验目的

学习从酵母中分离RNA和鉴定RNA组分的方法，并用苔黑酚法测定RNA的含量。

二、实验原理

RNA和DNA分别存在于细胞质和细胞核中，分离提出核酸，首先要将细胞破碎制成匀浆、使核酸充分提取出来。

酵母核酸中RNA含量较多。

RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。

但蛋白质的存在干扰核酸的测定，因此在沉淀中加入95%乙醇溶液洗涤，以除去蛋白，由此可得到RNA的粗制品。

RNA在硫酸煮沸液中可水解成核糖、嘌呤硷、嘧啶硷和磷酸，可分别进行鉴定。

核苷酸核糖+（嘌呤碱or嘧啶碱）+磷酸。

当含有核糖的RNA与浓盐酸及3.5——二羟基甲苯在沸水浴中加热后，有绿色复合物产生。

这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成醛糖，后者再与3.5——二羟基甲苯作用产生绿色络合物。

可用比色法测定

绿色复合物在670nm有最大光吸收，故光吸收值与浓度成正比。

三、实验器材

1、器材：

匀浆机、离心机、试管、烧杯、水浴锅。

2、试剂：

酵母、酸性乙醇、95%乙醇、碱液、FeCl3浓HCl液、苔黑酚。

四、实验步骤

1、酵母RNA的提取：

取酵母1.0g（5片）

加0.04MNaOH8ml

倒入10ml塑料离心管中，离心（3000rpm）10min

倾入小烧杯中缓慢加入10ml酸性乙醇转移至10ml塑料离心管中离心3min（3000rpm）

加5ml95%乙醇（或乙醚）

得RNA粗品。

去上清液,

洗涤沉淀RNA离心3min（3000rpm）

2、水解RNA：

将沉淀RNA转移到玻璃管中+10ml1.5MH2SO4

3、RNA组分鉴定：

①嘌呤碱：

取水解液1ml+浓氨水（5滴）+1mlAgNO3，观察嘌呤银化合物的絮状沉淀。

②核糖：

取1ml水解液+2ml苔黑酚三氯化铁溶液

10min观察颜色变化（亮绿色）

③磷酸：

取1ml水解液+1ml定磷试剂10min

观察颜色变化（蓝色）

4、RNA含量测定

（1）按下表加样操作

标准管

样品管

空白管

RNA标准液

0.5ml

RNA样品水解液

0.5ml

蒸馏水

0.5ml

FeCl3浓HCl液

2ml

苔黑酚：

0.2ml

摇匀

沸水浴10min

取出冷却后670nm比色测定

OD1

OD2

OD3

（2）结果计算。

RNA标准液为0.3mg/ml。

1g酵母片提取RNA的总体积为10ml。

（OD1-OD3）/（OD2-OD3）=C标/C样

RNA含量（mg/g）=C样×10/w

实验4维生素C的定量测定

一、实验目的

1．学习维生素C定量测定法的原理和方法。

2．进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技术。

二、实验原理

测定维生素C（抗坏血酸）的化学方法，一般是根据它的还原性。

本实验即利用维生素C的这一性质，使其与2，6-二氯酚靛酚作用，其反应如下：

2，6-二氯酚靛酚钠盐的水溶液呈现蓝色，在酸性环境中为玫瑰色，当其被还原时，则脱色。

根据上述反应，利用2，6-二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有维生素C的样品溶液。

开始时，样品液中的维生素C立即将滴入的2，6-二氯酚靛还原脱色，当样品液中维生素C全部被氧化时，再滴入2，6-二氯酚靛酚就不再被还有原脱色而呈玫瑰色。

故当样品液用2，6-二氯酚靛酚标准液滴定时，溶液出现浅玫瑰色时表明样品液中的维生素C全部被氧化，达到了滴定终点。

此时，记录滴定所消耗的2，6-二氯酚靛酚标准液量，按下述公式计算出样品液中还原型维生素C的含量。

计算公式：

维生素Cmg数/100g样品=

式中：

VA为滴定样品提取液所用的2，6-二氯酚靛酚的平均ml数；

VB为滴空白对照所用的2，6-二氯酚靛酚的平均ml数；

S为1ml2，6-二氯酚靛酚溶液相当于维生素C的mg数；

W为10ml样品提取液中含样品的g数。

三、实验器材

1．研钵2．吸量管（10ml）3．容量瓶（50ml）4．锥形瓶（50ml）

5．微量筒定管（5ml）6．漏斗7．纱布8．滤纸9．药物天平

10．绿豆芽11．10%盐酸溶液1500ml

12．2，6-二氯酚靛酚溶液2000ml

称取0.21g碳酸氢钠，0.26g2,6-二氯酚靛酚溶于250ml蒸馏水中，稀释至1000ml。

过滤，装入棕色瓶内，置冰箱内保存，不得超过3d。

使用前用新配制的标准抗坏血酸溶液标定。

取5ml标准抗体坏血酸溶液加入5ml偏磷酸-醋酸溶液。

然后用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定，以生成为微玫瑰红色持续15s不退为终点。

计算2，6-二氯酚靛酚溶液的浓度，以每ml2，6-二氯酚靛酚溶液相当于抗体坏血酸的mg数来表示。

13．标准抗坏血酸溶液

准确称取纯抗坏血酸结晶50mg溶于偏磷酸-醋酸溶液室容到250ml。

装入棕色瓶，贮于冰箱内。

14．偏磷酸-醋酸溶液

称取偏磷酸15g，溶于40ml冰醋酸和450ml蒸馏水所配成的混合液中。

过滤。

贮于冰箱内，此液保存不得超过10d。

四、实验步骤

制备含维生素C的样品提取液。

称取30g绿豆芽（37℃发芽3-7d）置研钵中研磨，放置片刻（约10min），用2层纱布过滤，将滤液（如混浊可离心）滤入50ml容量瓶中。

反复抽提2-3次，将滤液并入同一容量瓶中。

最后，用酸化的蒸馏水定容，混匀，备用。

量取样品提取液10ml于锥形瓶中。

用微量滴定管，以2，6-二氯酚靛酚溶液滴定样品提取液，呈微弱的玫瑰色，持续5s不退为终点，记录所用2，6-二氯酚靛酚的ml数。

整个滴定过程不要超过2min。

另取10ml用10%盐酸酸化的蒸馏水做空白对照滴定。

样品提取液和空白对照各做3份。

计算结果

五、思考题

试述本实验介绍的2，6-二氯酚靛酚滴定法的优缺点。

（附）碘滴定法

原理

铜盐（硫酸铜或醋酸铜）与过量的碘化钾进行反应形成碘化铜。

碘化铜不稳定，随即分解为碘化亚铜和游离的碘。

2CuSO4+4KI→2CuI2+2K2SO4

2CuI2→Cu2I2+I2

释放出来的碘可氧化L-抗坏血形成脱氢抗坏血酸和碘化氢。

反应继续进行，直到溶液里的L-抗坏血酸被碘合部氧化为止。

剩余的微量和碘与淀粉指示生成蓝色，终点明显。

本法简单，快速，可准确测定L-抗坏血酸25μg的量。

对抗坏血酸纯品进行测定的结果表明实验误差不超过±2%。

试剂

（1）标准0.01mol/L硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液或0.01mol/L醋酸铜[Cu（CH2COO）2·H2O]溶液：

精确称取0.2497g硫酸铜或0.1996g醋酸铜加水定容至100ml。

（2）30%和50%碘化钾水溶液（w/v）

（3）1%可溶性淀粉指示剂溶液（w/v）

（4）偏磷酸-醋酸溶液取15g偏磷酸溶于40ml冰醋酸和450ml蒸馏水的混合液中，在冰箱中过滤，滤液保存在冰箱中。

超过10d需重新配制。

操作

1．测样准备

（1）药品片剂取10个药片称量，小心研碎，精密称取相当于1片重量的片粉，以偏磷-醋酸溶液溶解，于100ml量瓶中定浴，摇匀后过滤。

（2）注射液取1ml注射液用偏磷酸-醋酸溶液稀释定容到100ml。

（3）食品取50g或20g蔬菜或水果，加仿磷酸-醋溶液到200ml，搅匀3mih后过滤，滤液放入碘量瓶中。

2．滴定精确量取一定体积的样品溶液（如5ml）于100ml碘量瓶中，加10ml30%KI溶液（抗坏血酸稀溶液含量于1mg时可用50%KI溶液）。

再加数滴演粉指示剂溶液。

随即用标准硫酸铜溶液（0.01mol/L）进行滴定。

边滴定边振摇，直至显示出蓝色，记录滴定量。

再做一个空白试验，在计算前，需将样品的滴定量减去空白试验的滴定量得V。

计算

L-抗血坏酸含量（mg/每份）=V×c

V=0.01mol/L标准硫酸铜溶液的ml数。

C=0.88，即1ml0.01mol/L标准硫酸铜溶液相当于0.88mg抗坏血酸。

实验5酶的制备、活力及功能测定

Ⅰ酶的特性

一、实验目的

通过实验加深对酶的性质的认识。

二、实验原理

1、酶的催化作用受温度的影响。

在最适温度下，酶的反应速度最高。

大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。

酶对温度的稳定性与其存在形式有关。

有些酶的干燥制剂，虽加热100℃，其活性并无明显改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。

低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。

2、pH对酶活性的影响：

酶的活力受环境pH的影响极为显著。

不同酶的最适pH值的不同。

本实验观察pH对唾液的淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。

3、酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。

氯离子为唾液淀粉梅的活化剂，铜离子为其抑制剂。

4、酶具有高度的专一性。

本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的一专性。

淀粉和蔗糖无还原性。

唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。

蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。

用Benedict试剂检查糖的还原性。

三、实验器材

1．器材

（1）试管及试管架

（2）恒温水浴（3）冰浴（4）沸水浴

2．试剂和材料：

A、

（1）0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液150ml需新鲜配制

（2）稀释200倍的唾液50ml

用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，0.5min后使其流入量筒并稀释200倍（稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整），混匀备用。

（3）磺化钾-磺溶液

将碘化钾20g及碘10g溶于100ml水中。

使用前释释10倍。

B、

（1）新配制的溶于0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液250ml

（2）稀释200倍的新鲜唾液100ml

（3）0.2mol/L磷酸氢二钠溶液600ml

（4）0.1mol/L柠檬酸溶液400ml

（5）碘化钾-磺溶液50ml

（6）pH试纸pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8四种

C、

（1）0.1%淀粉溶液150ml

（2）稀释200倍的新鲜唾液150ml

（3）1%氯化钠溶液50ml

（4）1%硫酸铜溶液50ml

（5）1%硫酸钠溶液50ml

（6）碘化钾-碘溶液100ml

D、

（1）2%蔗糖溶液

（2）溶于0.3%氯化钠的1%淀粉溶液150ml（需新鲜配制）

（3）稀释200倍的新鲜唾液100ml

（4）蔗糖酶溶液100ml

将啤酒厂的新鲜酵母用水洗涤2-3次（离心法），然后放在滤纸上自然干燥。

取干酵母100g，置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨提取约1h，再加蒸馏水使总体约为原体积的10倍。

离心，将上清液保存于冰箱中备用。

（5）Benedict氏试剂200ml

无水硫酸铜17.4g溶于100ml热水中，冷却后稀释至150ml。

取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600ml水共热，溶解后冷却并加水至850ml。

再将冷却的150ml硫酸铜溶液倾入。

本试剂可长久保存。

四．实验步骤

1、淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。

糊精按其分子的大小，遇碘可呈现蓝色、紫色、暗褐色或红色。

最简单的糊精遇碘不呈现颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。

在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现现的颜色来判断。

取3支试管，编号后按下表加入试剂：

管号

淀粉溶液（ml）

稀释唾液（ml）

煮沸过的稀释唾液（ml）

1.5

—

1.5

—

1.5

—

摇匀后，将1、3号两试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放入冰水中。

10min后取出（将2号管内液体分为两半），用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。

记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10min后，再用碘液实验，结果如何？

2、操作

取4个标有号码的50ml锥形瓶。

用吸管按下表添加0.2mol/L磷酸氢二钠溶液0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.0-8.0的4种缓冲液。

锥形瓶号码

0.2mol/L

0.1mol/L

5.15

6.05

7.72

9.72

4.85

3.95

2.28

0.28

5.0

5.8

6.8

8.0

从4个锥形中各取缓3ml，分别注入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶液2ml和稀释2ml。

向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1min。

将各试管中物质混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。

待向第4管加入唾液2min后，每隔1min由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴磺化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度。

待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1-2滴碘化钾-碘溶液。

添加碘化钾-碘溶液的时间间隔，从第1管起，亦均为1min。

观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。

3、操作

管号

0.1%淀汾溶液（ml）

1.5

稀释唾液（ml）

0.5

1%硫酸铜溶液（ml）

0.5

—

1%氯化钠溶液（ml）

—

0.5

—

1%硫酸钠溶液（ml）

—

0.5

—

蒸馏水（ml）

—

0.5

37℃恒温水溶、保温10min*

碘化钾-碘溶液（滴）

2—3

现象

*保温时间可根据人唾液淀粉酶活力调整。

解释结果，说明本实验第3管的意义。

4．操作

（1）淀粉酶的专一性

管号

1%淀粉溶液（滴）

—

2%蔗糖溶液（滴）

—

稀释唾液（ml）

—

煮沸过的稀释唾液（ ml）

—

蒸馏水（ml）

—

37℃恒温水浴15min

Benedict试剂（ml）

沸水浴2-3min

现象

解释实验结果（提示：

唾液除含淀粉酶外还含有少量麦芽糖酶）。

（2）蔗糖酶的专一性

管号

1%淀粉溶液（滴）

—

2%蔗糖溶液（滴）

—

蔗糖酶溶液（ml）

—

煮沸过的蔗糖酶唾液（ ml）

—

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