第三章 培养基.docx

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第三章培养基

第三章培养基Chapter3CultureMedia

BeginningofMicrobiology

►Almostexactly300yearsagoAntonvanLeeuwenhoekdescribedthefirstbacteriaseenthroughthemicroscope,thusprovidingthetechnicalbasisforstudyingthemorphologyofmicro-organisms

►Almostexactly300yearsagoAntonvanLeeuwenhoekdescribedthefirstbacteriaseenthroughthemicroscope,thusprovidingthetechnicalbasisforstudyingthemorphologyofmicro-organisms

伟大的科赫总结的“科赫三原则”:

细菌要恒定的与该病的病理症状有关；

能在病人中找到并分离，培养，纯化；放到健康的动物上也能引出相同的症状和病理特点。

Agar-AgarFrauHesse’s

contribution

Agar–Agar

►SolidmediumismadebyaddingAgar

►AgarisobtainedfromSeaweeds（NewZealandagarismore）

►Agarcontainlongchainpolysaccharides,Inorganicsaltsandproteinlikesubstance

►Meltsat980candsetsat420c

►UsedassolidifyingagentforculturemediainPetriplates,slants,anddeeps

►Generallynotdegradatedbybacteria

►Liquefiesat98°C

►Solidifies~42°C

►Agarismeltedbyboiling

►Liquidmediumcanbeconvertedintosolidbythe

additionofAgar（1%-2%）or

semisolidmedium（0.6%）

►UsedassolidifyingagentforculturemediainPetriplates,slants,anddeeps

►Generallynotdegradatedbybacteria

►Liquefiesat98°C

►Solidifies~42°C

►Agarismeltedbyboiling

►Liquidmediumcanbeconvertedintosolidbythe

additionofAgar（1%-2%）or

semisolidmedium（0.6%）

►Plate:

providelargesurfaceforisolationandobservationofcolonies

►Usingasterilelooporasterileswabstreakyoursampleonthepetriplate

►Importantletyoursterilizedloopcoolbeforeyoupickupyoursample

MediaandCulture

•Media:

Nutrients（agar,pHindicators,proteinsandcarbohydrates）usedtogroworganismsoutsideoftheirnaturalhabitats

•Culture:

Thepropagationofmicroorganismsusingvariousmedia

Culture　media

►Aculturalmediumisthesubstanceinwhichaspecificmicro-organismlivesandgrows.Itmustcontaintheessentialnutrientsneededforthemicrobetogrow.

►培养基是指维持微生物生长繁殖和产物形成的营养物质。

►工业发酵培养基是指提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。

►Culturemedium:

Nutrientspreparedformicrobialgrowth

►Sterile:

Nolivingmicrobes

►Inoculum:

Introductionofmicrobesintomedium

►Culture:

Microbesgrowingin/onculturemedium

►Agoodmediumisveryimportanttothesuccessofanindustrialfermentation.Themediumsuppliesnutrientsforgrowth,energy,buildingofcellsubstance,andbiosynthesisoffermentationproducts.

3.1培养基的类型

ClassificationofCulturemedia

►按纯度分类：

--合成培养基chemicallydefinedmedia:

compoundidentityandconcentrationofallcomponentsareknown.Moreexpensive,Syntheticmedia

--天然培养基chemicallyundefinedmedia:

ingredientsincludeoneormorechemicallycomplexsubstancessuchasproteinhydrolysatesandextracts.Cheaper,Crudemedia

SyntheticMedia

►Definedmediaaremediacomposedofpureingredientsincarefullymeasuredconcentrationsdissolvedindoubledistilledwateri.e.,theexactchemicalcompositionofthemediumisknown.Typically,theycontainasimplesugarasthecarbonandenergysource,aninorganicnitrogensource,variousmineralsaltsandifnecessarygrowthfactors（purifiedaminoacids,vitamins,purinesandpyrimidines.

►Thechoiceofdefinedorundefinedmediumisdependentuponitsapplication.

---Chemicallydefinedmediaareusefulinbiochemicalormetabolicstudiesoforganisms.

--Generallaboratorygrowthmediaandindustrialmediaareoftenchemicallyundefinedmedia.Suchas花生饼（peanutmeal）、蛋白胨（peptone）等。

一般不需外加微量元素（traceelements）、维生素等。

►按状态分类：

-Solidmedia：

suitabletocultureandpreservespeciesandspores;cultivatingfungi.

-Liquidmedia:

80%-90%water,industrialfermentationmedia.

-Semi-solidmedia:

liquidmedium+agar

主要用于鉴定细菌、观察细菌运动特征等。

ClassificationofCulturemedia

Basedontheconsistency:

Liquid--Peptonewater,Nutrientbroth

Semisolid--Nutrientagar

Solid--Bloodagar,Serumagar

►按用途分类

斜面培养基、种子培养基和发酵培养基

1.斜面培养基　（slantmedia）

►供微生物细胞生长繁殖或保藏菌种用的固体培养基。

细菌、酵母等斜面培养基，霉菌、放线菌生产孢子的孢子培养基。

►作用：

供给细胞生长繁殖所需的各类营养物质。

富含有机氮源。

►斜面培养基宜加少量无机盐，必要的生长因子

►孢子培养基（sporemedia）:

供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基。

►要求：

使菌体迅速生长，产生较多的优质孢子，不易引起菌种发生变异。

►基本配制要求：

⑴notrichinnutrition,especiallyorganicnitrogensource.

⑵optimalmineralsaltconcentration

⑶optimalpHandhumidity

生产上常用斜面培养基：

►由葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基。

►麸皮（bran）、大米（rice）、小米（millet）孢子培养基；

►大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因它们含氮少、疏松、表面积大，是较好的孢子培养基。

水分控制在21％－25％。

2、种子培养基　inoculummedia

►种子扩大培养的目的是短时间内获得数量多、质量高的大量菌种，以满足发酵生产需要

►要求：

营养比较丰富和完全，氮源和维生素的含量要高些。

►一般种子培养基中各种营养物质浓度不需太高

►可添加易被吸收利用的碳源和氮源，如葡萄糖、酵母粉（yeast）、蛋白胨

►通常不要求积累产物

►一般种子培养基常包括有机氮源和无机氮源

►最后一级的种子培养基的成分最好接近发酵培养基。

3、发酵培养基productionmedia

►供菌体生长、繁殖和合成产物之用。

►要求：

既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体迅速合成所需产物。

►配制：

其组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还需有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等。

3.2发酵培养基的成分及来源

Compositionofmediaandtheirsources

►微生物需从外界吸收营养物质，经过一系列生物化学反应，获得能量并形成新的细胞物质，同时排出废物。

►微生物种类繁多，营养物质需求和利用不同。

►从细胞物质成分分析可知，水占80%左右。

►20%干物质中，炭素约占50%、氮素约占5%-13%、矿物质约占3%-10%。

►配制培养基时需有足够的碳源、氮源、水和无机盐。

还可添加生长因子。

Basicrequirementsofculturemedia

►Nutrients

-Energysource

-Carbonsource

-Nitrogensource

►Mineralsalts–Sulphate,phosphates,chlorides&carbonatesofK,Mg&Ca.

►AsuitablepH–7.2–7.4

Accessorygrowthfactors

-TryptophanforSalmonellatyphi

3.2.1碳源carbonsources

►Carbonsourceisoneofmaincompositionofmedium.

►Thefunctionsare:

providingcarbonsandenergy;thecomponentsforsynthesisofproducts.

►Thesecanincludesimplesugars,complexcarbohydrates,alcohols,aminoandotherorganicacids,andshort-chainlipids.

常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇。

蛋白质、氨基酸也可用作碳源。

3.2.1.1糖类sugars

►Sugarsusedmainly:

glucose,molasses（糖蜜）,dextrin（糊精）.

►Glucose:

mostmicrobescanutilizeit.

速效碳源、

highconcentrationspeedrespirationupDOnoenoughintermediates（中间产物）accumulationinhibitinggrowthandsynthesis

►molasses（糖蜜）

►Beet（甜菜）andcanemolassesareby-productsofthesugarindustry.

►containing50%-75%fermentablesugars,mainlysucrose.Alsocontainingnitrogenouscompounds,vitaminsandminerals.

►Cheaper

Starchanddextrin（糊精）

►Starch:

----widelyusedinfermentationindustry

---starchhydrolyzeusingmicrobialamylase（淀粉酶）dextringlucose

-Mostcommonusedstarches:

corn,wheat,potatostarches.Alsousingcornflour.

--advantages:

缓效碳源、cheaperthanglucose

3.2.1.2油和脂肪oilsandfats

►Oilandfatsarealsousedascarbonsourcesbecausesomemicrobescontainlipase（脂肪酶）

►Fatglycerol（甘油）andfattyacids

oxidizeCO2+water,releasingmuchenergy

►ProvidingenoughO2isimportant.

►常用的油：

豆油、菜子油、猪油、鱼油、棉子油等。

3.2.1.3有机酸organicacids

►Somemicrobescanuseorganicacidsascarbonsources,suchaslacticacid,citricacid,aceticacid.

►pHofculturalmediumwillincrease.

CH3COONa+O22CO2+H2O+NaOH

3.2.1.4烃和醇类hydrocarbonandethanol

►石油及裂解产物如正烷烃也可用作carbonsources.

►自然界中能同化乙醇的微生物和能同化糖质的微生物一样普遍。

3.2.2氮源nitrogensources

►氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和合成含氮代谢物。

►常用的氮源可分为：

有机、无机氮源两类。

►有机氮源organicnitrogensources

常用的:

花生饼、棉子饼、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。

organicnitrogensourcesmicrobialproteinaseaminoacidsmetabolizedbymicrobes.

►organicnitrogensourcescontainrichproteins,peptides,aminoacids,vitaminsandgrowthfactors.

►在含有机氮源的培养基中，微生物常表现出生长旺盛、菌丝或细胞浓度增长迅速的特点。

►有些微生物对氨基酸有特殊的需求。

如缬氨酸可提高红霉素的发酵单位。

玉米浆CornsteepLiquor

►Cornsteepliquoristhewaterextractby-productresultingfromthesteeping（浸泡）ofcornduringthecommercialproductionofcornstarchandothercornproducts.

►玉米浆是一种优良的氮源，因为它含有丰富的氨基酸（丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等）、还原糖、磷微量元素和生长素。

►Ofthe50%solidsofcornsteepliquor,nearlyhalfislacticacid.Therestincludesaminoacids,glucoseandotherreducingsugars,salts,vitamins,andprecursors（前体）suchasthoseforthepenicillinmolecule.

►Thehighlacticacidcontentofcornsteepliquorresultsfromthegrowthoflacticacidbacteriaduringitsmanufacture.

►Thisvariationincomposition,attimes,canleadtopoorreproducibilityofanindustrialfermentation.

尿素urea

►Ureaisalsoacommonlyusednitrogensource.

►Itsfeature:

---singlecomponent,nohasnutritionalfeatureofcomplexnitrogensources;

---cheaper,oftenusedinproductionofpenicillinandglutamicacid（谷氨酸）.

►yeastextract（酵母抽提物）

►Peptones（蛋白胨）

►有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是产物的前体。

►缬氨酸、半胱氨酸和-是合成青霉素和头孢菌素的主要前体；甘氨酸可作为L-丝氨酸的前体等。

无机氮源inorganicnitrogensource

►常用的：

氨水（ammonia）、铵盐（ammonium）和硝酸盐（nitrate）

►Microbescanutilizeitfaster.速效氮源

►Afteritisutilized,thepHofmediumwillbechanged.

（NH4）2SO42NH3+H2SO4

NaNO3+4H2NH3+2H2O+NaOH

►生理酸性物质：

NH4酸性物，硫酸铵

►生理碱性物质：

NO3碱性物，硝酸钠

►正确使用生理酸碱性物质

►Exceptusingasanitrogensource,ammoniaisoftenusedtoadjustpHofmedia.Stirringisnecessary.

►无机氮源的影响：

硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素

3.2.3无机盐及微量元素

mineralsaltsandtraceelements

►Mineralsaltsandtraceelementsareneededwhenmicrobialcellsgrowandreproduce.

►Mostcommonmineralsaltsandtraceelements:

磷（phosphorus）、镁（magnesium）、硫（sulphur）、钾（potassium）、钠（sodium）、铁（iron）、氯（chlorine）、锰（manganese）、锌（zinc）、钴（cobalt）、钙（calcium）等。

►作为微生物细胞生理活性物质组成或生理活性作用的调节物。

►Whentheirconcentrationislow,theyshowastimulationfunctionforcellgrowandproductsynthesis.Whentheirconcentrationishigh,theywillinhibitthecellgrowth.

►Theiroptimalconcentrationsdependonthespeciesandstrainsofmicroorganisms.

无机盐成分一般所用的浓度范围（见书上表）

►Theseelementsareaddedintoculturalmediaintheformoftheirsalts.

►Exceptsyntheticmedia,cobalt钴,copper,iron,manganese锰,zinc,molybdenum钼arenotaddedintocrudemedia.

►Phosphoruselementisonecomponentofnucleicacidsandproteins;onecomponentofATP,energytransfer.

►Phosphoruscanstimulat