分子生物学.docx
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分子生物学
分子生物学
第1章绪论
转基因（transgene）利用分子生物学手段将外源基因转移到某种特定生物体中，使其生物性状或机能发生部分改变。
分子生物学：
包括对蛋白质、核酸和多糖等生物大分子结构与功能的研究以及从分子水平阐明生命的现象和生物学规律。
功能基因组学（functionalgenomics）功能基因组的任务是进行基因组功能注释，并从整体水平上获得关于基因功能及基因之间相互作用的信息。
蛋白组学（proteinics）研究在细胞中与某些功能相关的或在某些条件下的一群蛋白质。
蛋白组：
一个基因组所表达的全部蛋白质。
蛋白组学的研究内容：
蛋白质分离和鉴定，翻译后修饰，蛋白质功能的确定。
比较基因组学：
利用生物在进化上的亲缘关系，来比较它们与人类之间的相似与相异。
生物信息学：
以生物大分子为研究对象，以计算机为工具，运用数学和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指数级增长的生物信息数据的一门科学。
~~~主要研究内容：
1.生物信息的收集、存储、管理与提供2.基因组序列信息的提取和分析3.功能基因组相关信息分析4.生物大分子结构模拟和药物设计5.生物信息分析的技术与方法研究6.应用发展研究
基因和基因组数据库：
EMBL、GENEBANK和DDBJ是国际上三大主要核酸序列数据库。
蛋白质数据库：
PIRandPSDSWISS-PROTPROSITEPDB
功能数据库：
KEGGDIPASDBTRRDTRANSFAC
第2章核酸的结构
种类
分布
功能
DNA
原核生物：
核质区
遗传信息载体
真核生物：
95%在细胞核，5%在线粒体和叶绿体
RNA
tRNA
原核生物：
细胞质
真核生物：
75%在细胞质，15%在线粒体和叶绿体，10%在细胞核
携带、转移氨基酸
mRNA
肽链合成的模板
rRNA
核糖体的主要成分
sRNA
snRNA（smallnuclearRNA,核内小RNA）
调控基因表达、转录后加工，控制蛋白质合成及参与生物分子组成。
snoRNA（smallnuclearRNA，核仁小RNA）
scRNA（smallcytopiasmicRNA，胞质小RNA）
antiRNA（antisenseRNA，反义RNA）
生物的遗传物质
DNA作为主要的遗传物质。
（肺炎双球菌实验和噬菌体侵染实验）
DNA作为遗传物质的特征：
1.物理和化学性质稳定2.贮存并表达遗传信息3.能把遗传信息传递给后代
4.能产生可遗传的变异
核酸的基本组成：
核苷酸
DNA作为遗传物质的优点（自然选择的优势）
1.储存遗传信息量大2.AT.GC互补，形成双螺旋结构，具有复制、转录遗传的稳定性
3.核糖的2’-oh脱氧，在水溶液中的稳定性高于RNA4.可以突变，从而不断进化
DNA的结构
一级结构
二级结构（双螺旋模型）
特点：
1.DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋。
2.磷酸骨架在双螺旋的外侧，碱基与轴线垂直
3.碱基配对时，必须是一个嘌呤，另一个是嘧啶
4.DNA双螺旋有大沟和小沟的存在
影响双螺旋结构稳定性的因素：
1.碱基对之间形成的氢键2.碱基堆积力（非特异性结合力）3.正负电荷的作用
反向重复序列：
又称回文序列，指在双链DNA中某些区段含有两个结构相同，但方向相反的序列。
三级结构（超螺旋结构）
四级结构（在细胞核内DNA以核小体为基本单位形成染色质）
DNA的变性：
双螺旋DNA溶解成单链的现象，也称溶解。
DNA的复性：
变性DNA在一定条件下重新恢复双链的过程，也称退火。
变性过程表现在：
单链DNA粘度下降，沉降速度加快，A260nmUV值上升
增色效应：
在DNA的变性过程中，紫外吸收（260nm）值增大
减色效应：
在DNA复性过程中，紫外吸收（260nm）值减小
DNA变性后增加25--40%而RNA变性后，约增加1.1%
TM：
使DNA双螺旋结构解开一半的链时的温度
影响Tm值的因素：
1.在ATCG随机分布的情况下，GC%越高，Tm值越大Tm=69.3+041（G+C）
2.GC%含量相同的情况下，AT形成变性核心，变性加快，Tm值小。
3.片段的长度，大片段的双链DNA分子之间的比较（片段长短对Tm值的影响较小，与组成和排列有关），小于100bp的双链DNA分子比较（片段越短，变性越快，Tm值越小）
4.变性剂（如尿素、酰胺等）
5.介质中的离子强度
6.极端PH条件的影响
核酸的杂交：
亲缘关系相近的不同来源DNA单链或DNA单链与RNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程。
原核生物mRNA的结构特点：
1.多顺反子：
一分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息，可以作为几种蛋白质的模板，能翻译出几种蛋白质。
2.mRNA5’端五帽子结构，3’端无多聚A的尾巴3.一般没有修饰碱基
真核生物mRNA的结构特点：
1.5’端有帽子结构2.3’端多数带有多聚A的尾巴
3.分子中可能有修饰碱基，主要是甲基化4.分子中有编码区和非编码区
思考题：
简述DNA双螺旋结构模型的特点
DNA作为遗传物质有何结构
DNA的拓扑异构体如何相互转化
RNA与DNA有何区别
引起DNA变性的主要因素有哪些？
DNA复性必须满足哪两个条件？
反向重复序列，分子杂交，超螺旋结构，核小体，DNA的拓扑异构体，DNA变性和复性
第三章基因与基因组的结构
基因（Gene）是DNA分子上的一段序列，一个基因包括一个蛋白质或RNA的全部编码序列和编码区之外对编码区转录功能所必要的非编码的调控区。
结构基因：
编码蛋白质的基因;可被转录生成mRNA，进而翻译成蛋白质，表现出相应性状。
工具基因：
只转录成RNA，不再翻译成蛋白质；为蛋白质合成提供必要的工具。
如rRNA、tRNA基因
基因组（Genome）是一种生物染色体内全部遗传物质的总和，包括构成基因和基因之间区域的所有DNA。
进化程度越高，基因组越复杂。
原核生物基因组：
环状或线状的双链DNA分子所含有的全部基因，有的还包括染色体外的质粒基因组。
原核生物的基因结构特点：
1基因组较小，编码区和非编码区组成，非编码DNA比例较少，无内含子；
2结构基因多为单拷贝，rRNA基因多拷贝；
3有些基因之间可以形成重叠基因；
4有操纵子结构，多顺反子
重叠基因（overlappinggene）：
共同使用同一DNA序列，但编码两种不同蛋白质的基因。
核基因组：
真核生物单倍体染色体所含的一整套基因。
基因组的特点：
1.基因组较大，结构复杂，位于细胞核中，为双链线状，并与蛋白质结合形成染色质，而且染色体数目往往不是一条，而是多条;
2.编码序列仅占基因组DNA的一小部分，绝大多数为非编码序列；
3.基因组中存在大量的重复序列。
重复序列在人基因组中约占50％；
4.真核基因多为割裂基因，含有内含子;
5.转录产物为单顺反子mRNA，即一条mRNA只能翻译成一种蛋白质。
割裂基因（不连续基因）：
在基因编码蛋白质的序列中插入与蛋白质编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。
外显子（exon）：
编码的DNA序列，即被表达的DNA区段
内含子（intron）：
不编码的DNA序列
外显子与内含子连接区特征：
内含子两端序列之间没有广泛的同源性和互补性；
连接区高度保守，几乎每个内含子5‘端起始两个碱基为GT，3’端最后两个碱基为AG，即5‘GT…….AG3’
内含子的功能：
调控RNA的剪接，增加DNA储存信息量
影响基因的表达调控
有助于变异和进化
卫星DNA（satelliteDNA）:
分布于染色体上异染色区域，由长串联重复序列组成。
小卫星DNA（minisatelliteDNA）:
由中等大小的串联重复组成，主要分布于染色体末端区域。
微卫星DNA（microsatelliteDNA）:
由2-6个bp单位组成的串联重复序列，分散于整个核基因组。
如TGTG……TG=（TG）n
基因家族（Genefamily）：
真核生物基因组中功能相似、结构具有同源性的一组基因。
持家基因（housekeepinggene）：
在不同种类的细胞中均表达，功能对于每个细胞都必需，占基因总数90％。
奢侈基因（luxurygene）：
仅在特定的细胞类型中表达；占基因总数10％
假基因（pseudogene）：
核苷酸序列与编码某一蛋白质的基因相似，但不具功能，不能转录形成成熟mRNA或不能翻译出功能蛋白质。
重复的假基因：
已有基因在结构上发生较大变化而失去功能后形成
加工的假基因：
没有启动子和内含子，在3端有一段延伸的短A-T碱基对序列，似poly（A）尾巴，两侧有正向重复序列。
转座子（transposonableelements,TEs）：
从基因组上的一个位置转移到同一条染色体或另一条染色体的另一个位置，引起相应控制性状的改变。
线粒体DNA（MitochondrialDNA,mt-DNA）：
存在线粒体内，分布于细胞质中，多聚集在需能部位。
线粒体DNA基因组特征：
分子结构简单：
共价闭合的环状双链DNA；
结构基因排列紧密，除调控区外无内含子和转座子；
编码区含有37个基因，
调控区（置换环或D-环）
mt-DNA的相对分子量低
大小一般在14-42kb之间，大多数动物在16-19之间；
与核DNA相比，mt-DNA所占质量比很小，不足1％。
进化速度快（mt-DNA结构基因）
mt-DNA聚合酶不具备校对修复能力；
碱基不配对频率高，复制易发生错误。
无组织特异性
正常个体不同细胞的mt-DNA具有高度均一性
核苷酸组成不均一
4种碱基组成偏离随机组成；
G+C的摩尔分数在15-50％间变化。
线粒体DNA的变异
mtDNA的变化随年龄增加而增加，因此认为mtDNA的突变与衰老有关。
mtDNA的突变率比细胞核DNA高5－10倍原因：
mtDNA缺少组蛋白的保护；线粒体中无修复DNA的操作能力；
线粒体进行大量氧化过程，产生随自由基可能损伤mtDNA。
（这些变异都可以母系遗传的方式传递到子代。
）
基因的命名
一般来说，基因的名称用斜体表示，而蛋白质的名称用正体表示。
如核糖体蛋白6基因（ribosomeproteinL6）：
RPL6，蛋白为RPL6
最常使用的命名方法：
用三个小写英文斜体表示基因的名字，加一个斜体大写字母表示不同的基因座。
如lac操纵子的基因座：
lacZ,lacY；其表达产物为lacZ,lacY。
酵母：
一般用三个大写斜体表示基因功能，后面的数字表示不同的基因座。
如啤酒酵母基因GAL4，其蛋白为GAL4。
线虫：
三个小写斜体表示突变型，如存在多个基因座，则在连字符后加数字。
如基因unc-86，蛋白UNC-86。
脊椎动物：
小写字母加数字。
人：
大写字母加数字。
基因MYC，蛋白MYC。
C值矛盾（C-valueparadox）
A生物体进化程度高低与大C值不成明显相关（非线性）
B亲缘关系相近的生物大C值相差较大
C生物内大C值与小c值相差极大（Euk.人体c=C/10）（Prok.Φx174c＞C）
C值大小与生物进化程度并不完全呈相关关系，基因组中存在许多不编码蛋白质的DNA序列。
DNA复制的基本规律
复制：
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。
DNA复制时以亲代的每一条DNA链为模板，按照碱基互补配对的原则，合成与其互补的DNA链，在子代DNA中，一条链来于亲代DNA，另一条链是新合成的。
DNA的这种复制方式称为半保留复制（semi-conservativereplication）
以3’→5’方向的亲代DNA作模板链,子代链在复制时连续进行，称为前导链（leadingstrand）。
（复制方向与解链方向一致）
以5’→3’方向的亲代DNA链为模板链,子代链不连续复制，称为滞后链（laggingstrand）。
（复制方向与解链方向相反）
DNA在复制时，由滞后链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段（Okazakifragment）。
冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000bp，而在真核生物中约为100-200bp。
半不连续复制：
前导链连续复制而滞后链不连续复制，就是复制的半不连续性。
DNA连接酶即将相邻的两个岗崎片段连接起来，并催化两者之间的3’5’-磷酸二酯键形成。
复制子（replicon）：
基因组中能独立进行复制的单位，称复制子或复制单位。
复制子中含有复制起点（origin，ori或复制原点）和复制终点。
真核:
多复制子，原核:
单复制子
复制叉（Replicationfork）：
染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点。
DNA复制方式：
新起始方式（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）
滚环式复制（rollingcirclereplication）D环复制（D-loopreplication）补
复制体（replisome）：
在DNA合成的复制叉上，由各种各样与复制有关的酶和辅助因子在DNA链上形成的复合体
与DNA复制有关的酶和蛋白质
1、拓扑异构酶（topoisomerse,TOPO）
拓扑异构酶对DNA分子的作用是断开DNA的双链或单链，释放紧张螺旋状态后再促使DNA单链或双链的连接。
即断开磷酸二酯键，旋转DNA释放螺旋紧张状态，然后重新以磷酸二酯键连接断开的DNA。
拓扑异构酶有两种，拓扑异构酶Ⅰ（topA）可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。
拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。
2、解链酶（helicase）
促进DNA分子两条互补链分开，利于复制叉前进。
Rep蛋白与前导链模板结合，沿模板3´5´随着复制叉行进;
解链酶（DnaB蛋白）结合在后滞链模板，沿模板5´3´随着复制叉行进；
3、单链DNA结合蛋白（singlestrandDNAbindingprotein,SSBP）
与单链DNA结合，稳定其构象，防止形成双链结构，利于DNA复制；
保护新合成的单链DNA，免于其被核酸酶水解。
4、引物酶（primase）
在DNA复制中催化合成RNA引物的酶
引发体（Primosome）:
引物合成酶与各种蛋白质因子构成的复合体，负责RNA引物的合成
5、DNA聚合酶（DNApolymerase）
以dNTP为底物
需要提供合成模板
不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3‘-OH
催化DNA合成的方向是5`→3`
具有5`→3`或3`→5`核酸外切酶活性
6、DNA连接酶（DNAligase）
冈崎片段形成后，DNA聚合酶I（5-3’外切活性）除去RNA引物，DNA连接酶再来封闭DNA的缺口。
原核生物DNA的复制包括：
1、起始2、延伸3、终止
DNA新链，其化学反应的本质是生成磷酸二酯键。
真核生物的DNA复制包括引发、延伸和终止三个阶段
特点：
DNA复制时，染色质结构发生改变，核小体解开；
真核生物染色体DNA含有多个复制起点；
DNA在全部复制完成之前，各个复制起点不能开始新一轮的复制；
多个复制子，冈崎片段短，复制叉行进的速度慢等
端粒（telomere）：
指一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构
DNA损伤：
指在生物体生命过程中DNA结构发生的任何改变。
DNA复制产生的损伤
（1）复制中的碱基错配
（2）碱基的互变异构移位（tautomericshift）碱基各自的异构体间可以自发发生变化（烯醇式与酮基间互变，氨基与亚氨基互变），进而使碱基配对方式发生改变A=CT=G上述配对发生在DNA复制时，会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误损伤.
（3）DNA聚合酶的“打滑”DNA复制时，不论模板链或新生链有时会发生碱基的“环出”loopingout现象，引起一个或多个碱基的缺失或插入。
（4）碱基的脱氨基作用（deamination）碱基的环外氨基自发脱落，C变为U，A变为次黄嘌呤（H），G变为黄嘌呤（X）。
复制时，U与A配对、H和X都与C配对会导致子代DNA序列的错误变化。
（5）碱基丢失自发水解使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落，即脱嘌呤和脱嘧啶。
哺乳类动物细胞，在37ºC下，20h内DNA链自发脱去嘌呤约1000个，嘧啶约500个。
物理因素引起的DNA损伤
（1）紫外线引起的DNA损伤DNA受到紫外线（260nm）照射时，同一条链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，TT,CC,CT之间都可形成二聚体
（2）电辐射引起的DNA损伤主要包括x-射线，γ射线以及宇宙射线，其能量比紫外线大，能穿透组织。
化学因素引起的DNA损伤
（1）烷化剂对DNA的损伤一类亲电子的化合物，很容易与生物体中大分子的亲核位点起反应。
（2）碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤其结构与正常的碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基渗入到DNA链中而干扰DNA复制合成。
嵌入染料
DNA修复（repair）：
是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。
DNA损伤修复的重要性
DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要；
修复DNA损伤的能力是生物能保持遗传稳定性所在；
DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的，因此生物才会有变异、有进化。
（1）直接修复（directrepair）
光修复（lightrepair）修复机制：
在可见光（300~600nm）活化之下，由光复活酶（photoreactivatingenzyme,PR）催化胸腺嘧啶二聚体分解为单体。
主要是低等生物的DNA损伤修复的方式.
紫外线损伤：
DNA链两个相邻嘧啶间以共价键相连形成嘧啶二聚体。
紫外线损伤DNA的切除修复（高等动物）
（2）切除修复（excisionrepair）
是一种广泛存在的修复机制，由多种酶参与，可适用于多种DNA损伤的修复。
切除修复机制的基本过程是：
将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。
方式：
碱基切除修复和核苷酸切除修复
（3）重组修复（recombinationrepair）
复制起始时尚未修复的DNA损伤部位先复制再修复。
也称为复制后修复。
复制时由于复制酶系统在损伤部位不能通过碱基配对合成子链，因此复制出的子链出现一空缺。
（4）SOS修复
SOS反应：
细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急状态下，为求生存而出现的应急反应。
修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-pronerepair）
（5）错配修复系统（Mismatchrepairsystem）
（1）识别错配的碱基对；
（2）对错配的一对碱基要能准确区别哪一个是错的，哪一个是对的；
（3）切除错误的碱基，并进行修复合成。
遗传密码:
DNA（或mRNA）中的核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系称为遗传密码。
密码子（codon）：
mRNA上每3个相邻的核苷酸编码蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子或三联体密码（tripletcodon）
起始密码（initiationcodon）:
AUG
终止密码（terminationcodon）:
UAA,UAG,UGA
开放读码框（openreadingframe,ORF）：
从mRNA5’端起始密码子AUG到3’端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放读码框。
遗传密码的基本特征：
1.连续性：
编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。
如插入或缺失一碱基，可造成移码突变。
2.简并性：
同一个氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称密码子的简并性（degeneracy）。
对应于同一种氨基酸的不同密码子称同义密码子（synonymouscodon）。
大多数简并性表现在密码子的第三个核苷酸上，即第一、二个核苷酸确定后，第三个核苷酸可变。
意义：
简并密码子越多，生物遗传的稳定性越大，氨基酸出现频率越高。
3.变偶性：
转运氨基酸的tRNA的反密码需要通过碱基互补与mRNA上的遗传密码反向配对结合，但反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。
意义：
密码子第三位突变仍能表达出正确的氨基酸；可减少tRNA的种类。
4.偏爱性：
同一物种中，编码同一氨基酸的密码子的使用频率不同。
不同物种间（原核和真核生物），编码同一氨基酸的密码子的使用频率也不同。
密码子的使用频率与tRNA的数量有关
5.通用性和变异性：
蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。
动物细胞的线粒体DNA（mtDNA）、支原体及少数纤毛类原生动物的编码方式与通用密码子有所不同。
6.密码子的防错系统：
密码子中即使一个碱基被置换，其结果是仍然编码相同的氨基酸，或是以性质最接近的氨基酸取代。
核糖体的活性位点：
mRNA结合位点：
与mRNA结合，位于30S亚基上
A位：
即氨酰基位（aminoacylsite），或称受位，每次延长，氨基酰tRNA就加入到A位上。
P位：
即肽酰基位（peptidylsite），或给位，肽酰tRNA占据的位置，肽链转位至此，延长继续。
E位：
排出位（exitsite），空载的tRNA从此位点被排出
蛋白质的翻译过程：
肽链合成的方向：
氨基端（N端）羧基端（C端）
由多种蛋白因子和RNA分子参与
包括氨酰－tRNA复合物的形成，翻译的起始，延伸和终止过程,核糖体的释放
氨基酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNAsynthetase，AARS）：
存在于胞液中，催化一个特定的AA结合到相应的tRNA分子上。
每种氨基酰tRNA合成酶对相应氨基酸以及携带氨基酸的数种tRNA具有高度特异性，保证tRNA能够携带正确的氨基酸对号入座，被称为“第二遗传密码”
氨基酰-tRNA的表示方法：
Ala-tRNAAlaSer-tRNASerMet-tRNAMet
起始肽链合成的氨基酰-tRNA真核生物：
Met-tRNAiMet原核生物：
fMet-tRNAifMet
2.翻译的起始：
肽链合成起始阶段，是指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物的过程。
需要起始因子（IF或eIF）和ATP、GTP参与。
翻译的起始是mRNA能忠实翻译的关键步骤，也是调节蛋白质合成的部位。
（1）原核生物翻译的起始
1.核糖体大、小亚基分离;
2.mRNA在小亚基定位结合；
S-D序列：
又称核糖体结合位点（ri
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