植物组织培养报告四则.docx

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植物组织培养报告四则

（实验题目）

开题报告

姓名：

学院（系、所）：

学科专业：

导师姓名：

开题时间：

论文

题目中文垂吊矮牵牛再生体系的建立

英文Theestablishmentofpetunia'sregenerationsystem

论文工作计划简述（开题报告内容）

1、本论文课题国内外概况和文献综述：

矮牵牛,又名碧冬茄、灵芝牡丹,属茄科矮牵牛属的多年生草本植物.矮牵牛花大而色彩丰富,是装饰花坛、街道的理想花卉,广泛地应用于城市及园林绿化,是世界上最普及,销售量最大的花卉之一[1].

近年来矮牵牛在组织培养方面的研究发展很快,现将国内外研究概况分述如下。

1.外植体的选择

根据植物细胞全能性，理论上任何活组织在适宜的条件下都能发育成完整的植株。

但是，在不同生长状况下、发育阶段、生长环境和不同部位的外植体存在一定的生理生化差异，因此选择不同的外植体课影响组织培养的形态发生。

分别以叶片、茎尖、茎段、种子、花蕾、花药等作外植体获得再生植株[3-8],但从分化结果来看,茎尖作外植体最好,幼芽分化所需时间短，分化出来的幼芽健壮；其次为茎段，叶片不但产生愈伤组织少，而且产生幼苗所需时间长。

在茎尖和茎段试验中，前者无论在生长势或分化率方面都优于后者.由于茎尖数量有限，而叶片培养时间长，因此以茎段（包括茎尖）作为外植体是矮牵牛组培的最佳选择。

2.培养基和培养条件的选择

在基本培养基的选择上，主要用MS和1/2MS,其中MS主要用来培养愈伤组织及继代增殖,1/2MS主要用于生根培养.也有用NH培养基[6]和1/4MS培养基[9]对矮牵牛进行组培的.针对不同的要求，可以改变基本培养基中的营养成分及其含量。

目前为止,大部分组织培养研究者都用6-BA作为主要激素[4,6,10-11],至于使用量,不同的品种、不同的材料和不同的研究者得到了不同的结论.大部分研究者用BA或6-BA或NAA组合来诱导愈伤组织的产生，而且取得了良好的效果。

一般BA在1.0-3.2mg/L之间，NAA在0.1-0.2mg/L之间都能获得大量的愈伤组织，最常用的是BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。

也有用6-BA与IBA组合取得较好效果的。

培养条件的选择上，目前普遍使用的条件为：

PH值5.8，光照10-12h，温度20-28度，光照强度1000-2000lx。

3.组培苗移栽技术

组培苗移栽一般经过三个步骤：

首先，当根长至1cm以上，苗高约4-5cm时在自然条件下打开瓶口开始炼苗，炼苗时间约2-3d或7-8d，然后把苗取出，用温水洗干净根部粘附的培养基，移栽至消过毒的无水基质中，适当遮阴并控制环境温度：

10-20d后即可移栽大田或上盆。

虽然矮牵牛组织培养已经初步建立了快繁体系,为市场幼苗的需求做出了一定贡献,尚有许多问题值得继续研究.如取材污染率高,组织培养适应期长,工厂化

生产成本高等问题制约了矮牵牛组培苗工业化生产。

2、本论文课题的理论和实际应用意义：

基础理论：

1）植物细胞全能性

2）细胞分化、脱分化与再分化

3）器官发生和胚状体发生

实际意义：

垂吊矮牵牛大面积栽培具有地被效果，景观瑰丽、悦目，具有很好的市场价值。

植物组织培养以其繁殖系数大、繁殖周期短、有利保持亲本性状、成本较低、可周年进行生产等优点,为在较短时间内大量生产花卉植物,满足市场需求提供了可能.应用组织培养技术对矮牵牛进行快速无性繁殖,不仅可以保持其优良性状,使花色纯化,在短期内生产出大量整齐、均匀的健壮种苗,还可以进行周年生产,满足市场需求.

3、论文的基本内容、结构框架以及要突破的难点：

一、仪器及用品：

试剂瓶、电子天平、烧杯、量筒、移液管、玻璃棒、容量瓶、培养皿、PH计、记号笔、高压灭菌锅、超净台

二、配置培养基

（1）MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L

（2）MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L

（3）MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L

（4）壮苗培养基：

MS

（5）生根培养基：

MS+IBA0.5mg/L

上述培养基均为100ML固体培养基，2.5%蔗糖，0.85%琼脂，PH5.8

三、材料与方法

1.取材、消毒与接种

取垂吊矮牵牛的幼嫩叶片及带顶芽的茎段，用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗

2-3遍，在超净工作台上用75%酒精浸泡30S，再用10%次氯酸钠溶液浸泡9min，

用无菌水冲洗3次，用消毒滤纸吸干表面水分，将幼嫩叶片切成0.5*0.5左右大小，

与带顶芽的茎段一起分别接种于

（1）-（3）号培养基中培养，光照10-12h，温度20-28度，光照强度1400-1600lx

2.快速繁殖

将已分化出芽的愈伤组织分割切小，转接入

（1）号培养基中，可以获得大量的丛

生芽。

3.生根与移栽

将带有大量丛生芽的愈伤组织转入不含激素的MS培养基中，丛生芽不再增

殖，而是起到壮苗的作用，以利生根。

当试管苗长到2cm左右时，切下转入生根

培养基中。

将生根的苗打开封口膜在室内炼苗1-2天，小心取出苗，转泥炭土栽培。

注意事项及难点：

1）灭菌条件的度量,矮牵牛包被短毛，灭菌困难，易污染。

2）培养条件的控制。

3）干扰因素的排除。

4、论文计划及进度：

实验第一周，配置愈伤组织诱导所需的

（1）-（3）三个梯度培养基。

实验第二周，进行接种。

实验第三周，将愈伤组织转接

（1）号培养基，获取丛生芽。

并配置4号MS培养基。

实验第四周，将带有大量丛生芽的愈伤组织转接入4号培养基，进行壮苗培养。

实验第五周，将试管苗转入生根培养基，进行生根培养。

实验第六周，进行炼苗以及移栽。

实验期间定期观察培养基凝固情况、是否长菌、愈伤组织生长情况，及时处理褐化、玻璃化等外植体。

并做好观察记录，需记录的信息如下表

日期培养箱条件观察结果处理事项备注

5、主要参考文献：

[1]瞿素萍.矮牵牛的组织培养研究.西南农业大学学报,2001,23（05）:

4472448

[3]王贤荣.早樱种系的分类及其观赏价值.南京林业大学学报:

自然科学版,2000,24（06）:

44246

[4]谢利锁.野生早樱嫩枝扦插繁殖技术研究.林业科技开发,2002,16（02）:

20222

[5]李继华.扦插的原理和应用.上海:

上海科学技术出版社,1987:

31233

[6]王振师,周丽华,曾雷.绯寒樱的扦插繁殖.中南林学院学,2005,25（03）:

82284

[7]孟新法,周维燕.吲哚丁酸酸对苹果矮化砧离体快繁生根的影响.北京农业大学学报,1982,（02）:

25227

[8]DumanoGH,AygunAA,GunesNT,etal.Effectoftiming,IBAandPutrescineonrootingandshootinginPyrus

elaeagrifoliapallsoftwoodcuttings.HortSic,1999,69（11）:

1237

[9]林伯年,内昭作（日）,沈德绪.园艺植物繁育学[M].上海:

上海科学技术出版社,1994:

177

[10]SageeO.InvolvementofrootingfactorsandfreeIAAintherootabilityofcitrusspeciesstemcuttings.HortSci,

1992,51（34）:

1872195

[11]高新一,王玉英.植物无性繁殖实用技术.北京:

金盾出版社,2003:

74286

开题报告概况（包括单位、地点、出席人数及对论文工作计划提出的意见和建议）：

指导教师意见：

签名：

年月日

指导组召集人意见：

签名：

年月日

植物组织培养实验报告

一实验目的

让植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。

二实验原理

植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。

植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。

这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。

植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（IAA）和6–苄基氨基腺嘌呤（6–BA）的比例，决定了根和芽的分化。

三实验器材

（一）试剂

乙醇、IAA或2，4–D、HgCl2（或次氯酸钠）、6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA）

MS培养基

（二）仪器设备

培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL），烧杯，量筒，培养皿，超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，橡皮筋等

三实验步骤

1.配制培养基

（1）愈伤组织诱导培养基：

MS培养基（蔗糖含量为10g/L，2,4–D含量为2mg/L，琼脂10g/L）。

（2）试验培养基：

在MS培养基中按表33–1加入IAA和6–BA。

吲哚乙酸先用少量0.1mol/LNaOH溶解，6-苄基氨基腺嘌呤先用少量0.1mol/LHCl溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。

2.培养基灭菌

将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至pH5.8，趁热分装于100mL三角烧瓶中，每瓶约20mL。

待培养基冷却凝固后，用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121℃（1kg/cm2）下灭菌20min。

取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。

接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。

3.诱导产生愈伤组织

（1）取健壮的玫瑰、菊花茎数段，每段约5cm长，于烧杯中用0.1%氯化汞（升汞）浸泡20min，取出用无菌水洗3～4次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌30min），用解剖刀切成5mm厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种4片，接种后扎好瓶口。

（2）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在25℃温室中，每星期检查l～2次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶，3～4周后产生愈伤组织。

（3）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放1～2块，仍培养在25℃温室中，每周1～2次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。

长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。

四实验结果

因为时间有限及实验严密性等问题，大部分都失败了，但是仍然有小部分分化发育了出来。

已经证明了植物组织能够经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。

植物组织培养实验报告

一实验目的

让植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。

二实验原理

植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。

植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。

这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。

植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（IAA）和6–苄基氨基腺嘌呤（6–BA）的比例，决定了根和芽的分化。

三实验器材

（一）试剂

乙醇、IAA或2，4–D、HgCl2（或次氯酸钠）、6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA）

MS培养基

（二）仪器设备

培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL），烧杯，量筒，培养皿，超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，橡皮筋等

三实验步骤

1.配制培养基

（1）愈伤组织诱导培养基：

MS培养基（蔗糖含量为10g/L，2,4–D含量为2mg/L，琼脂10g/L）。

（2）试验培养基：

在MS培养基中按表33–1加入IAA和6–BA。

吲哚乙酸先用少量0.1mol/LNaOH溶解，6-苄基氨基腺嘌呤先用少量0.1mol/LHCl溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。

2.培养基灭菌

将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至pH5.8，趁热分装于100mL三角烧瓶中，每瓶约20mL。

待培养基冷却凝固后，用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121℃（1kg/cm2）下灭菌20min。

取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。

接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。

3.诱导产生愈伤组织

（1）取健壮的玫瑰、菊花茎数段，每段约5cm长，于烧杯中用0.1%氯化汞（升汞）浸泡20min，取出用无菌水洗3～4次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌30min），用解剖刀切成5mm厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种4片，接种后扎好瓶口。

（2）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在25℃温室中，每星期检查l～2次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶，3～4周后产生愈伤组织。

（3）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放1～2块，仍培养在25℃温室中，每周1～2次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。

长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。

四实验结果

因为时间有限及实验严密性等问题，大部分都失败了，但是仍然有小部分分化发育了出来。

已经证明了植物组织能够经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。

植物组织培养实验及实习指导

杨玲编

西南林学院生物技术教研室

目录

实验一、母液的配制和保存……………………………………………2

实验二、培养基的配制与灭菌………………………………………….5

实验三、外植体消毒与初代培养的建立……………………………….7

实验四、继代与增殖培养………………………………………….9

实验五、生根培养…………………………………………………11

实验六、植物茎尖脱毒培养………………………………………13

实习试管苗的炼苗与移栽……………………………………..15

实验一、母液的配制和保存

一、实验目的

通过配制MS培养基母液，掌握贮备液的配制和保存方法。

二、原理

配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存。

使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。

以MS培养基为例，所需配制的母液为：

大量元素母液（母液Ⅰ，浓缩20倍）、微量元素母液（母液Ⅱ，浓缩200倍）、铁盐母液（母液Ⅲ，浓缩200倍）和有机化合物母液（母液Ⅳ，浓缩200倍）等。

三、实验材料、试剂和仪器设备

1．试剂

NH4NO3,KNO3,CaCl2•2H2O,MgSO4•7H2O,KH2PO4,KI,H2BO3，MnSO4•4H2O,ZnSO4•7H2O,Na2•MoO4•2H2O,CuSO4•5H2O,CoCl2•6H2O,Na2•EDTA•2H2O，FeSO4•7H2O，烟酸，甘氨酸,盐酸硫胺素,肌醇,盐酸吡哆醇,蒸馏水

2．仪器设备

冰箱，天平，酸度计或pH试纸，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒（1000ml，100ml，25ml），容量瓶（1000ml，500ml，100ml），磨口试剂瓶（500ml，1000ml），药勺、称量纸、酸度计或pH试纸，滴管、玻璃棒，电炉，微波炉

四、实验方法

1.大量元素母液的配制

配制时先用量筒量取蒸馏水大约800ml，放入1000ml的烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：

NH4NO3,KNO3,KH2PO4,MgSO4.7H2O,CaCl2.2H2O，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入1000ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，然后，倒入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

2.微量元素母液的配制

按照配方表中用量用电子天平分别依次称取MnSO4•4H2O，ZnSO4•7H2O，H2BO3，KI，NaMoO4•2H2O，CuSO4•5H2O，CoCl2•6H2O，按制备母液Ⅰ的方法逐个溶解。

（钼酸钠难溶解，可在室温下用蒸馏水溶解后再加入到微量元素母液中。

）定容至1000ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

3.铁盐母液配制

把FeSO4•7H2O和Na2•EDTA•2H2O分别置于450ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解。

保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2•EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后把pH值调到5.5，加蒸馏水到最终容积1000ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。

在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4℃冰箱中保存备用。

4.有机化合物母液的配制

按配方表中用量依次称取：

维生素B1，烟酸，甘氨酸，维生素B6，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

5.植物生长物质母液的配制

NAA母液：

准确称量10mg，先用少量1mol/LNaOH溶液完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为0.1mg/ml的NAA母液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。

6-BA母液的配制方法相似，母液浓度为2mg/ml。

请注意细胞分裂素的溶解方法。

五、实验报告

按照实验报告格式要求及各组在实验中的配制溶液情况，完成报告撰写。

附：

MS培养基母液配方

成分数量（mg/L）成分数量（mg/L）

母液Ⅰ母液Ⅱ

NH4NO333000MnSO4•4H2O4460

KNO338000ZnSO4•7H2O1720

KH2PO43400H2BO31240

MgSO4•7H2O7400KI166

CaCL2•2H2O8800Na•MoO4•2H2O50

母液ⅣCuSO4•5H2O5

肌醇20000CoCl2•6H2O5

烟酸100

维生素B1100母液Ⅲ

甘氨酸400FeSO4•7H2O5560

维生素B6100Na2•EDTA•2H2O7460

实验二、培养基的配制与灭菌

一、实验目的

学习用母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法。

二、原理

组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。

三、实验材料、试剂和仪器设备

1．试剂

琼脂，蔗糖，蒸馏水，NAA，6-BA，1mol/LHCl，1mol/LNaOH

2．仪器设备

天平，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒（1000ml，100ml，25ml），移液管（10ml，5ml，2ml，1ml，0.5ml），药勺，称量纸，玻璃棒，吸耳球，滴瓶，酸度计或pH试纸，培养瓶，封口膜，耐热橡皮筋，线绳，高压灭菌锅，微波炉，电炉，标签纸，记号笔

四、实验步骤

1.培养基的配制

培养基组成：

MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂（pH5.8）

①将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。

本实验需配制的培养基所需吸取的各种母液的用量如表1所示：

母液名称母液浓度扩大倍数500ml培养基吸取量

大量元素20

微量元素200

有机成分200

铁盐200

NAA0.1mg/ml

6-BA2mg/ml

②取50ml烧杯一个，用量筒量取大量元素母液，然后用各母液专用移液管分别吸取微量元素母液，有机母液、铁盐母液和生长物质母液，置于烧杯中备用。

③取500ml烧杯一个，加入300ml蒸馏水，称量琼脂4g倒入烧杯中，将烧杯置于电炉上或微波炉内加热，待琼脂完全溶化后，加入15g蔗糖，充分溶解后，将准备好的大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素母液混合液倒入烧杯中，用蒸馏水将装过母液混合液的烧杯洗三遍，一并倒入500ml烧杯中，并加蒸馏水定容。

④充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为5.8。

⑤把培养基分装到广口瓶中，每瓶约50ml。

用封口膜封好瓶口。

贴上标签，注明培养基名称，配制者姓名和配制日期，待灭菌。

2.培养基灭菌（灭菌条件：

121℃，15分钟）

①检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。

把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。

②盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。

③灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。

④刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。

放置在水平桌面上自然冷却。

在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。

经检查没有杂菌生长的方可使用。

要求：

每人准备培养基2瓶。

提前准备实验三所需的无菌材料。

五、实验报告

附：

稀酸和稀碱的配制方法

1mol/LHCl

取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至100ml，即为1mol/LHCl。

1mol/LNaOH

称取氢氧化钠4g，加入蒸馏水100ml，即为1mol/LNaOH。

实验三、外植体的消毒与