常用标本制备技术.docx
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常用标本制备技术
常用标本制备技术
一、常用光镜标本制备技术
1•切片标本的制备:
常用的切片方法为石蜡切片,其制备程序如下:
⑴取材从动物身体割取所需的新鲜组织一小块(厚度约
0.5厘米)。
手术愈快愈好,以防组织的死后变化。
⑵固定把切取的小块组织,迅速投入预先配好的固定液[如10%福尔马林、
0.5%娥酸、包氏液、岑克氏液、卡氏等固定液]中固定,使组织细胞的蛋白质变性,组织块硬化,以保存组织细胞原有的形态。
⑶冲洗(洗涤)组织块自固定液取出后,须经流水冲洗或乙醇洗涤,使组织中含有的固定液全部除去,直至洗净为止。
⑷脱水的目的在于除去组织中的水分。
因为组织中的水分和石蜡是不相溶的,为不使组织块在脱水时产生收缩,所以一定要经过各级浓度的脱水剂(如乙醇等)将水分脱净。
⑸透明组织块脱水后,须经既可和乙醇相混,亦可作石蜡溶剂的透明剂(如二甲苯)透明,使组织中的乙醇被透明剂所替代,才能浸蜡包埋。
⑹浸蜡是将包埋剂(石蜡)透入整个组织的过程。
石蜡透入组织需要一定的温度(石蜡熔点)。
所以浸蜡都在恒温箱中进行。
⑺包埋制备一定形状的容器(如纸盒等),倒入熔化的石蜡,迅速夹取浸透石蜡的组织块放入盒内,待表面石蜡凝固后立即将容器投入水中,使它凝固成蜡块。
⑻切片组织块经上述处理后,不仅变硬,且有石蜡支撑,可用切片机将包埋组织的蜡块切成薄片,一般厚度是5〜8微米。
⑼贴片把由切片机切下的蜡条,分割成小段,分别排放于滴有蒸镭水的载玻片上,在展片台上微热,使皱褶的蜡片伸展平正。
(10)烘片把贴有蜡片的载玻片置于45弋恒温箱中,烘烤3〜4小时,使切片干燥。
(11)脱蜡与复水组织切片的脱蜡等过程是在染色缸中进行的,因此须预先准备洁净的染色缸,并分别放入二甲苯、各级浓度的乙醇及染料溶液,按顺序贴好标签。
染色前须先进行脱蜡和复水,即用二甲苯溶去切片上的石蜡后再经各级浓度乙醇(自高浓度到低浓度)下行到水的过程。
因为没有经过复水处理的切片不能用水溶性染料染色,所以在染色前必须再度复水。
脱蜡与复水的步骤如下:
切片浸入二甲苯3〜10分钟T二甲苯+纯乙醇(1:
1)T纯乙醇T95%乙醇T80%乙醇T70%乙醇T50%乙醇(以上每级乙醇停留的时间约2〜5分钟)今蒸馆水2分钟。
(12)染色切片染色以后可增加组织细胞结构的对比度。
常用的生物染料是苏木素和伊红,简称H.
E.染色。
苏木素是一种碱性染料,经苏木素染色的结构呈蓝紫色(如细胞核)。
组织中可被碱性染料着色的结构称嗜碱性。
伊红是一种酸性染料,被伊红染色的结构呈红色或粉红色(如细胞质)。
可被酸性染料着色的结构称嗜酸性。
H.
E.染色的程序如下:
将已浸入水中的切片取出放入苏木素染液5〜10分钟T自来水洗2分钟T
0.5%盐酸水分色数秒种(在显微镜下检查核褪至浅红色,细胞质及结缔组织近无色)T蒸馆水1分钟T
0.1%氨水(蓝化)1分钟T自来水冲洗5〜10分钟T蒸馅水1分钟T50%乙醇T70%乙醇T80%乙醇T90%乙醇(以上每级乙醇停留的时间约2〜5分钟)T
0.5%伊红(95%乙醇溶液)2〜5分钟T95%乙醇分色(在显微镜下检查核呈蓝紫色,细胞质及结缔组织呈粉红色)T95%乙醇轻洗(洗净玻片上剩余的伊红染液)。
(13)脱水已染色的组织切片,为了长久保存,又须再经各级浓度的乙醇脱水。
即将上述已被染色的组织切片依次放入95%乙醇1分钟T纯乙醇(I)1分钟T纯乙醇(□)2〜5分钟。
(14)透明的目的是除去组织切片中的乙醇,因组织中的乙醇不与树胶相溶,所以必须
用透明剂除去乙醇后才能封藏。
即将上述已脱水的组织切片依次放入二甲苯+纯乙醇(1:
1)2〜5分钟T二甲苯(I)2〜5分钟T二甲苯(□)2〜5分钟。
(15)封固在切片上滴加中性树胶,用盖玻片进行封固,保存备用。
机体内有些结构成分,需经硝酸银处理(镀银或银染)时可使硝酸银还原,形成银的微粒附着在组织结构上,呈棕黑色,称这种性质为亲银性。
有些组织结构本身不能使硝酸银还原,需加还原剂使硝酸银还原,称此为嗜银性。
此外,为了显示某些特殊结构成分,还可应用各种特殊染色方法,如雷锁辛品红染色液显示弹性纤维等。
在制作较硬组织(如骨组织等)或较大组织器官(如眼球)等切片,为了减轻因石蜡包埋所产生的收缩,可用火棉胶(celloidin)代替石蜡进行浸透包埋,再进行切片染色。
为了较好地保存细胞内的酶活性,可选用冷冻切片。
它是将组织在低温条件下快速冻结,直接切片,进行染色。
2、涂片、铺片、磨片标本的制备:
血液等液体材料,可直接在玻片上涂片,干燥后再进行固定和染色。
疏松结缔组织和肠系膜等薄层组织,可在玻片上撕开展平,制成铺片,待干燥后进行固定和染色。
骨和牙等坚硬组织除用酸(如稀硝酸等)脱钙后再按常规制成切片处,还可直接研磨成薄的磨片进行染色观察。
二、大体解剖技术操作规程及其注意事项
(一)大体解剖标本的收集与防腐固定处理
1、收集标本时,须登记死者的死亡原因、性别、年龄等,办妥自愿捐献手续、家属签字等手续,免留后患。
若系无主尸体亦须在公安、保卫部门办妥有关手续。
2、进行消毒处理,避免传染病蔓延。
3、进行固定防腐注射,配制5%—10%的甲醛溶液作颈总动脉与股动脉灌注,按照标本大小选择注射剂量。
如注射溶液过浓,解剖时容易造成肌纤维及血管断裂,过淡时标本容易腐败。
温度高时注射5%左右溶液,温度低时注射10%左右溶液。
根据季节气温的不同在5%-10%之间浮动。
4、注射完后标本在注射台上保留一到两天,使其毛细血管中溶液渗均匀,再行放入3%—5%的甲醛溶液中保存。
5、每具标本注射后必须在尸池中浸泡六个月后,方可进行大体解剖,如解剖过早则不易保存。
6、若收集标本须作铸型标本用,宜将标本即时放血,取材越新鲜越好。
剩余部分作局部注射保存。
若作关节韧带等标本,取材后马上将肌肉等及时剥离,以防腐败发臭。
收集腐败标本后可作沙埋腐蚀后取骨架为标本。
(二)大体标本解剖
1、将收集保存六个月以上的标本捞出、冲洗后,放入尸体台即可进行解剖。
2、解剖前必须将银、钳、剪、刀等工具准备完好,方可动手操作。
视其操作部位,必须熟悉所作部位解剖层次结构,用圆刀切开皮肤并剥离之,用尖刀或剪等修洁神经、血管、肌肉等结构。
大体标本制作之关键在于熟悉层次结构和熟练的操作技巧。
否则易切断或破坏相关结构,且制作的标本不美观。
若作系解教学标本宜采取两侧分别以深、浅层制作。
完成后放入本院配制之保存液中待用。
(三)特殊标本制作
1、铸型标本
(1)根据所取材料,按需要处理。
(2)配制好铸型剂并加不同染料(一般示红色动脉,示静脉蓝色,示胆道绿色,示神经黄色等)。
(3)分别采取不同腐蚀法,腐蚀后冲洗,装瓶保存。
2、包埋标本
(1)取出所需材料修洁凉干(有条件可抽空包埋)。
(2)按需要选择好包埋材料。
(3)包埋造型。
3、xx标本制作
(1)按要求进行标本取材。
(2)xx>涂色。
(3)装瓶、保存(若标本上涂色彩,不宜保存在本院配方的保存液中,以防脱色,仍须保留在5%-10%的甲醛溶液中)。
三、人体骨骼标本双氧水法制作
(一)目的
利用局解后的废旧材料制作人体骨骼标本
(二)材料
经防腐固定的局解后尸体标本、工业用双氧水、汽油和带盖标本箱。
(三)方法
1、取材:
取骨质无损的标本,整体的或局部的均
可。
2、软组织处理:
将大块软组织包括筋膜、肌肉、内脏、脑等除掉后,常温下浸入5%・10%的双氧水中,利用双氧水放氧产生气泡的机械作用使软组织松动,15・30天后取出,用清水冲洗后将骨膜撕掉,但韧带、关节囊、软骨、肌腱、骨间膜等可按需修洁保留(如做散的骨标本,则可
将这些软组织很容易地清除掉)。
3、脱脂:
将上述材料凉干后入汽油中脱脂4个月。
注意材料要干燥,容器要密封,中途更换1次汽油即
可。
4、清洁和保存:
将脱脂后的材料置通风处让汽油挥发,然后浸入1%的洗衣粉内将表面的油渍洗净,再用清水冲洗干净。
之后,置阴凉干燥处风干(为防止肋骨缩水变形,可用木条或有机玻璃支撑固定,待干后拆掉),涂刷清漆两遍即可保存。
(四)结果及评价
制作出的骨骼标本洁净美观,结构完整,骨的连结自然真实,骨间膜、椎间盘、肋软骨、耻骨间盘、韧带、关节囊、关节软骨等牢固地与骨连结在一起,胸廓,骨盆,脊椎等完全保持了其本来形态。
采用双氧水浸泡处理软组织,有以下优点:
(1)双氧水放氧产生氧泡的物理作用使与骨结合紧密的软组织松动,与骨较易分离,而干燥后这些软组织与骨的结合又变得紧密牢固了。
(2)经双氧水浸泡后骨标本脱脂效果很好。
(3)低浓度的双氧水对骨质的腐蚀性小,在常温下进行,处理的时间容易
控制。
四、辣根过氧化物酶(HRP)法操作规程
(一)实验目的
探讨某一针灸穴位区传入神经元的节段性分布。
(二)药品和试剂
HRP:
SigmaTypeIVRZ:
3.2
硝普钠(xx化学试剂厂)
联大茴香胺(XX化学试剂厂)
过氧化氢(XXXX化工厂)
(三)仪器设备与材料
100ml量筒、分析天平、500ml量筒、1000ml烧杯、2000ml烧杯、家免饲养笼、50山微量注射器、精密试纸、普通光学显微镜,等。
四)实验对象
本院动物室提供的家兔,体重2000±20go
(五)实验环境
室温18〜25°C,相对湿度60%〜75%o
(六)操作步骤
1.主要溶液的制备
(1)20%HRP液20山、HRP粉末5mg加20山生理盐水即此液。
(2)2%多聚甲醛加
1.25%戊二醛
0.1M磷酸缓冲液(PH
7.4)。
10.1M磷酸缓冲液的制备:
I液:
NaH2PO4・H2O
27.6g加蒸憎水稀释至1000mlo
II液:
Na2HPO4-12H2O
71.6g加蒸憎水稀释至1000ml.
取I液190ml、II液810ml混合后加蒸镭水稀释至2000ml即得
0.1M磷酸缓冲液(PH
7.4)。
22%多聚甲醛
0.1M磷酸缓冲液的制备:
20g多聚甲醛加
0.1M磷酸缓冲至1000ml即得此液。
32%多聚甲醛
1.25%戊二醛
0.1M磷酸缓冲液的制备:
25%戊二醛50ml溶液加2%多聚甲醛
0.1M磷酸缓冲液至1000ml即得。
(3)Tris液的配制
1取
3.6ml冰醋酸加蒸镭水至300mlo
2取
4.08g无水醋酸钠加蒸馅水至150mlo
3取上液①279ml和上液②126ml混合,即为Tris液。
4混合后用精密试纸测其PH为
4.4则可用。
(4)0・D法中有关溶液配制
1A液的配制取
O.lMTris液10ml、
0.2%明明胶液50ml、硝普钠200mg加蒸馅水至100mk联大茴香胺80mg加蒸镭水至40ml、
1.5%H2O
20.8ml混合即得A液。
2B液的配制取
O.lMtris液10mk
0.2%明胶液50ml、硝普钠8g、蒸镭水140ml混合即得B液。
3C液的配制取
O.lMtris液20ml、
0.2%明胶液100ml>蒸慵水280ml混合即可得C液。
2.定穴及针入xx:
根据《针灸学》[1]、《兽医针灸手册》[2]确定。
3.动物分组、xx及HRP引入方式:
将实验用家兔随机分成5组,即穴区组\神经干组、切断神经组、切断血管组和空白对照组。
用2%戊巴比妥纳、接40mg/kg体重,进行腹腔麻醉。
穴区组、切断神经组、切断血管组,均在家兔某一目标穴区直接注射20%HRP液20山,神经干组在家兔目标穴区下神经干内注射20%HRP液20川,空白对照组则在家兔目标穴区直接注射20山生理盐水。
4.动物灌注:
注射后4〜5天进行,开胸经左心室\升主动脉插管,同时剪开右心耳灌注如下药液:
(1)0〜4°C柠檬酸钠速灌300mlo
(2)0〜4°C生理盐水速灌1000mlo
(3)0〜4°C2%多聚甲醛
1.25%戊二醛
0.1M磷酸缓冲液1000mlo前300ml速灌。
后700ml缓慢滴入。
全过程约40分钟。
(4)0〜4°C10%蔗糖
0.2M磷酸缓冲液800mL前300ml速灌。
后500ml缓慢滴入。
约30
分钟。
5.取材:
取出两侧相应节段(据大体解剖学而定)全部脊神经节,并放入10%蔗糖
0.1M磷酸缓冲液内。
置冰箱内过夜。
6.冰冻切片厚40〜50微米,并收集于
0.1M磷酸缓冲液中。
7.成色反应(O・D法,有关A液、B液、C液配制见上)
(1)0〜4°C蒸馆水冲洗切片三次。
(2)放入A液30分钟(置冰箱)。
(3)0〜4。
(2蒸憾冲洗切片三次。
(4)放入B液30分钟(置冰箱)。
(5)0〜4°C蒸馆水冲洗切片三次。
(6)放入C液中(置冰箱)。
8.蛋白甘油贴片
9.1%中性红复染,脱水透明,最后中性树胶封片,光镜下观察。
(七)实验结果及评价(以〃上巨虚〃穴区为例)
1.未注射侧的情况:
所有的实验动物在未注射侧的切片上,各脊神经节都未出现标记细胞。
2.五组实验动物在脊神经节出现标记细胞的情况
(1)穴区组在切片上,可见注射侧脊神经节L4〜S2节段中都出现了标记细胞,以L7〜S2节段的标记细胞为最多。
占总数的83%,其次为L
2、L
5、L4节段。
腰段以L7为最多,占总数的40%;紙段以S1为最多,占总数的26%。
其它各节段都未出现标记细胞。
(2)神经干组在切片上,可见注射侧在脊神经节L1〜S3节段中出现了标记细胞。
以L7〜S2节段的标记细胞为最多。
占总数的
68.2%,其次为L
5、L
4、L
3、S
3、L
2、L
1、腰段以L7为最多,占总数
31.3%o段以S1为最多,占总数的21%。
其它各节段都未出现标记细胞。
(3)切断神经组、空白对照组在切片上各脊神经节都未出现标记细胞。
(4)切断血管组在切片上可见注射侧脊神经节L4〜S2节段中都出现了标记细胞,以L7〜S2为最多。
占总数的
76.9%,其次是L
6、L
5、和L4。
腰段以L7节段为最多。
占总数的
31.7%,紙段以S1节段为最多,占总数的
2.4%。
其它各节段都未出现标记细胞。
3.大、中、小三型标记细胞在脊神经节内出现的情况
本实验用Leitz测微尺测定实验中所有出现细胞的大小,其穴区组、神经干组、切断血管组都能见到大、中、小三型标记细胞,且都以中、小型细胞为主,各占总数的
75.6%、
76.1%、74%,其中又以小型标记细胞为最多,各占总数的
42.1%、
43.5%、
40.4%。
4.标记细胞的形态:
实验中发现酶标细胞呈绿色,各酶标细胞颗粒密度不一,形态大多数为椭圆和圆形。
实验表明,家兔"上巨虚〃穴区的传入神经元支配节段(L4〜S2),短于其穴区下腓神经的传入神经元支配节段(L1〜S3):
标记细胞以中、小型细胞(尤其是小型细胞)为主,提示传导针感的纤维主要是中、细纤维;血管在HRP的运输过程中未起多大的作用,起作用的是神经,本研究为针刺“上巨虚〃穴治疗胃肠疾病的形态学提供了理论基础。
(九)注意事项:
灌注时应注意顺序和灌注液的温度、数量、灌注速度。