常用标本制备技术.docx

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常用标本制备技术

常用标本制备技术

一、常用光镜标本制备技术

1•切片标本的制备：

常用的切片方法为石蜡切片，其制备程序如下：

⑴取材从动物身体割取所需的新鲜组织一小块（厚度约

0.5厘米）。

手术愈快愈好，以防组织的死后变化。

⑵固定把切取的小块组织，迅速投入预先配好的固定液［如10%福尔马林、

0.5%娥酸、包氏液、岑克氏液、卡氏等固定液］中固定，使组织细胞的蛋白质变性，组织块硬化，以保存组织细胞原有的形态。

⑶冲洗（洗涤）组织块自固定液取出后，须经流水冲洗或乙醇洗涤，使组织中含有的固定液全部除去，直至洗净为止。

⑷脱水的目的在于除去组织中的水分。

因为组织中的水分和石蜡是不相溶的，为不使组织块在脱水时产生收缩，所以一定要经过各级浓度的脱水剂（如乙醇等）将水分脱净。

⑸透明组织块脱水后，须经既可和乙醇相混，亦可作石蜡溶剂的透明剂（如二甲苯）透明，使组织中的乙醇被透明剂所替代，才能浸蜡包埋。

⑹浸蜡是将包埋剂（石蜡）透入整个组织的过程。

石蜡透入组织需要一定的温度（石蜡熔点）。

所以浸蜡都在恒温箱中进行。

⑺包埋制备一定形状的容器（如纸盒等），倒入熔化的石蜡，迅速夹取浸透石蜡的组织块放入盒内，待表面石蜡凝固后立即将容器投入水中，使它凝固成蜡块。

⑻切片组织块经上述处理后，不仅变硬，且有石蜡支撑，可用切片机将包埋组织的蜡块切成薄片，一般厚度是5〜8微米。

⑼贴片把由切片机切下的蜡条，分割成小段，分别排放于滴有蒸镭水的载玻片上，在展片台上微热，使皱褶的蜡片伸展平正。

（10）烘片把贴有蜡片的载玻片置于45弋恒温箱中，烘烤3〜4小时，使切片干燥。

（11）脱蜡与复水组织切片的脱蜡等过程是在染色缸中进行的，因此须预先准备洁净的染色缸，并分别放入二甲苯、各级浓度的乙醇及染料溶液，按顺序贴好标签。

染色前须先进行脱蜡和复水，即用二甲苯溶去切片上的石蜡后再经各级浓度乙醇（自高浓度到低浓度）下行到水的过程。

因为没有经过复水处理的切片不能用水溶性染料染色，所以在染色前必须再度复水。

脱蜡与复水的步骤如下：

切片浸入二甲苯3〜10分钟T二甲苯+纯乙醇（1：

1）T纯乙醇T95%乙醇T80%乙醇T70%乙醇T50%乙醇（以上每级乙醇停留的时间约2〜5分钟）今蒸馆水2分钟。

（12）染色切片染色以后可增加组织细胞结构的对比度。

常用的生物染料是苏木素和伊红，简称H.

E.染色。

苏木素是一种碱性染料，经苏木素染色的结构呈蓝紫色（如细胞核）。

组织中可被碱性染料着色的结构称嗜碱性。

伊红是一种酸性染料，被伊红染色的结构呈红色或粉红色（如细胞质）。

可被酸性染料着色的结构称嗜酸性。

H.

E.染色的程序如下：

将已浸入水中的切片取出放入苏木素染液5〜10分钟T自来水洗2分钟T

0.5%盐酸水分色数秒种（在显微镜下检查核褪至浅红色，细胞质及结缔组织近无色）T蒸馆水1分钟T

0.1%氨水（蓝化）1分钟T自来水冲洗5〜10分钟T蒸馅水1分钟T50%乙醇T70%乙醇T80%乙醇T90%乙醇（以上每级乙醇停留的时间约2〜5分钟）T

0.5%伊红（95%乙醇溶液）2〜5分钟T95%乙醇分色（在显微镜下检查核呈蓝紫色，细胞质及结缔组织呈粉红色）T95%乙醇轻洗（洗净玻片上剩余的伊红染液）。

（13）脱水已染色的组织切片，为了长久保存，又须再经各级浓度的乙醇脱水。

即将上述已被染色的组织切片依次放入95%乙醇1分钟T纯乙醇（I）1分钟T纯乙醇（□）2〜5分钟。

（14）透明的目的是除去组织切片中的乙醇，因组织中的乙醇不与树胶相溶，所以必须

用透明剂除去乙醇后才能封藏。

即将上述已脱水的组织切片依次放入二甲苯+纯乙醇（1：

1）2〜5分钟T二甲苯（I）2〜5分钟T二甲苯（□）2〜5分钟。

（15）封固在切片上滴加中性树胶，用盖玻片进行封固，保存备用。

机体内有些结构成分，需经硝酸银处理（镀银或银染）时可使硝酸银还原，形成银的微粒附着在组织结构上，呈棕黑色，称这种性质为亲银性。

有些组织结构本身不能使硝酸银还原，需加还原剂使硝酸银还原，称此为嗜银性。

此外，为了显示某些特殊结构成分，还可应用各种特殊染色方法，如雷锁辛品红染色液显示弹性纤维等。

在制作较硬组织（如骨组织等）或较大组织器官（如眼球）等切片，为了减轻因石蜡包埋所产生的收缩，可用火棉胶（celloidin）代替石蜡进行浸透包埋，再进行切片染色。

为了较好地保存细胞内的酶活性，可选用冷冻切片。

它是将组织在低温条件下快速冻结，直接切片，进行染色。

2、涂片、铺片、磨片标本的制备：

血液等液体材料，可直接在玻片上涂片，干燥后再进行固定和染色。

疏松结缔组织和肠系膜等薄层组织，可在玻片上撕开展平，制成铺片，待干燥后进行固定和染色。

骨和牙等坚硬组织除用酸（如稀硝酸等）脱钙后再按常规制成切片处，还可直接研磨成薄的磨片进行染色观察。

二、大体解剖技术操作规程及其注意事项

（一）大体解剖标本的收集与防腐固定处理

1、收集标本时，须登记死者的死亡原因、性别、年龄等，办妥自愿捐献手续、家属签字等手续，免留后患。

若系无主尸体亦须在公安、保卫部门办妥有关手续。

2、进行消毒处理，避免传染病蔓延。

3、进行固定防腐注射，配制5%—10%的甲醛溶液作颈总动脉与股动脉灌注，按照标本大小选择注射剂量。

如注射溶液过浓，解剖时容易造成肌纤维及血管断裂，过淡时标本容易腐败。

温度高时注射5%左右溶液，温度低时注射10%左右溶液。

根据季节气温的不同在5%-10%之间浮动。

4、注射完后标本在注射台上保留一到两天，使其毛细血管中溶液渗均匀，再行放入3%—5%的甲醛溶液中保存。

5、每具标本注射后必须在尸池中浸泡六个月后，方可进行大体解剖，如解剖过早则不易保存。

6、若收集标本须作铸型标本用，宜将标本即时放血，取材越新鲜越好。

剩余部分作局部注射保存。

若作关节韧带等标本，取材后马上将肌肉等及时剥离，以防腐败发臭。

收集腐败标本后可作沙埋腐蚀后取骨架为标本。

（二）大体标本解剖

1、将收集保存六个月以上的标本捞出、冲洗后，放入尸体台即可进行解剖。

2、解剖前必须将银、钳、剪、刀等工具准备完好，方可动手操作。

视其操作部位，必须熟悉所作部位解剖层次结构，用圆刀切开皮肤并剥离之，用尖刀或剪等修洁神经、血管、肌肉等结构。

大体标本制作之关键在于熟悉层次结构和熟练的操作技巧。

否则易切断或破坏相关结构，且制作的标本不美观。

若作系解教学标本宜采取两侧分别以深、浅层制作。

完成后放入本院配制之保存液中待用。

（三）特殊标本制作

1、铸型标本

（1）根据所取材料，按需要处理。

（2）配制好铸型剂并加不同染料（一般示红色动脉，示静脉蓝色，示胆道绿色，示神经黄色等）。

（3）分别采取不同腐蚀法，腐蚀后冲洗，装瓶保存。

2、包埋标本

（1）取出所需材料修洁凉干（有条件可抽空包埋）。

（2）按需要选择好包埋材料。

（3）包埋造型。

3、xx标本制作

（1）按要求进行标本取材。

（2）xx>涂色。

（3）装瓶、保存（若标本上涂色彩，不宜保存在本院配方的保存液中，以防脱色，仍须保留在5%-10%的甲醛溶液中）。

三、人体骨骼标本双氧水法制作

（一）目的

利用局解后的废旧材料制作人体骨骼标本

（二）材料

经防腐固定的局解后尸体标本、工业用双氧水、汽油和带盖标本箱。

（三）方法

1、取材：

取骨质无损的标本，整体的或局部的均

可。

2、软组织处理：

将大块软组织包括筋膜、肌肉、内脏、脑等除掉后，常温下浸入5%・10%的双氧水中，利用双氧水放氧产生气泡的机械作用使软组织松动，15・30天后取出，用清水冲洗后将骨膜撕掉，但韧带、关节囊、软骨、肌腱、骨间膜等可按需修洁保留（如做散的骨标本，则可

将这些软组织很容易地清除掉）。

3、脱脂：

将上述材料凉干后入汽油中脱脂4个月。

注意材料要干燥，容器要密封，中途更换1次汽油即

可。

4、清洁和保存：

将脱脂后的材料置通风处让汽油挥发，然后浸入1%的洗衣粉内将表面的油渍洗净，再用清水冲洗干净。

之后，置阴凉干燥处风干（为防止肋骨缩水变形，可用木条或有机玻璃支撑固定，待干后拆掉），涂刷清漆两遍即可保存。

（四）结果及评价

制作出的骨骼标本洁净美观，结构完整，骨的连结自然真实，骨间膜、椎间盘、肋软骨、耻骨间盘、韧带、关节囊、关节软骨等牢固地与骨连结在一起，胸廓，骨盆，脊椎等完全保持了其本来形态。

采用双氧水浸泡处理软组织，有以下优点：

（1）双氧水放氧产生氧泡的物理作用使与骨结合紧密的软组织松动，与骨较易分离，而干燥后这些软组织与骨的结合又变得紧密牢固了。

（2）经双氧水浸泡后骨标本脱脂效果很好。

（3）低浓度的双氧水对骨质的腐蚀性小，在常温下进行，处理的时间容易

控制。

四、辣根过氧化物酶（HRP）法操作规程

（一）实验目的

探讨某一针灸穴位区传入神经元的节段性分布。

（二）药品和试剂

HRP：

SigmaTypeIVRZ：

3.2

硝普钠（xx化学试剂厂）

联大茴香胺（XX化学试剂厂）

过氧化氢（XXXX化工厂）

（三）仪器设备与材料

100ml量筒、分析天平、500ml量筒、1000ml烧杯、2000ml烧杯、家免饲养笼、50山微量注射器、精密试纸、普通光学显微镜，等。

四）实验对象

本院动物室提供的家兔，体重2000±20go

（五）实验环境

室温18〜25°C,相对湿度60%〜75%o

（六）操作步骤

1.主要溶液的制备

（1）20%HRP液20山、HRP粉末5mg加20山生理盐水即此液。

（2）2%多聚甲醛加

1.25%戊二醛

0.1M磷酸缓冲液（PH

7.4）。

10.1M磷酸缓冲液的制备：

I液：

NaH2PO4・H2O

27.6g加蒸憎水稀释至1000mlo

II液：

Na2HPO4-12H2O

71.6g加蒸憎水稀释至1000ml.

取I液190ml、II液810ml混合后加蒸镭水稀释至2000ml即得

0.1M磷酸缓冲液（PH

7.4）。

22%多聚甲醛

0.1M磷酸缓冲液的制备:

20g多聚甲醛加

0.1M磷酸缓冲至1000ml即得此液。

32%多聚甲醛

1.25%戊二醛

0.1M磷酸缓冲液的制备:

25%戊二醛50ml溶液加2%多聚甲醛

0.1M磷酸缓冲液至1000ml即得。

（3）Tris液的配制

1取

3.6ml冰醋酸加蒸镭水至300mlo

2取

4.08g无水醋酸钠加蒸馅水至150mlo

3取上液①279ml和上液②126ml混合，即为Tris液。

4混合后用精密试纸测其PH为

4.4则可用。

（4）0・D法中有关溶液配制

1A液的配制取

O.lMTris液10ml、

0.2%明明胶液50ml、硝普钠200mg加蒸馅水至100mk联大茴香胺80mg加蒸镭水至40ml、

1.5%H2O

20.8ml混合即得A液。

2B液的配制取

O.lMtris液10mk

0.2%明胶液50ml、硝普钠8g、蒸镭水140ml混合即得B液。

3C液的配制取

O.lMtris液20ml、

0.2%明胶液100ml＞蒸慵水280ml混合即可得C液。

2.定穴及针入xx：

根据《针灸学》［1］、《兽医针灸手册》［2］确定。

3.动物分组、xx及HRP引入方式：

将实验用家兔随机分成5组，即穴区组\神经干组、切断神经组、切断血管组和空白对照组。

用2%戊巴比妥纳、接40mg/kg体重，进行腹腔麻醉。

穴区组、切断神经组、切断血管组，均在家兔某一目标穴区直接注射20%HRP液20山，神经干组在家兔目标穴区下神经干内注射20%HRP液20川，空白对照组则在家兔目标穴区直接注射20山生理盐水。

4.动物灌注：

注射后4〜5天进行，开胸经左心室\升主动脉插管，同时剪开右心耳灌注如下药液：

（1）0〜4°C柠檬酸钠速灌300mlo

（2）0〜4°C生理盐水速灌1000mlo

（3）0〜4°C2%多聚甲醛

1.25%戊二醛

0.1M磷酸缓冲液1000mlo前300ml速灌。

后700ml缓慢滴入。

全过程约40分钟。

（4）0〜4°C10%蔗糖

0.2M磷酸缓冲液800mL前300ml速灌。

后500ml缓慢滴入。

约30

分钟。

5.取材：

取出两侧相应节段（据大体解剖学而定）全部脊神经节，并放入10%蔗糖

0.1M磷酸缓冲液内。

置冰箱内过夜。

6.冰冻切片厚40〜50微米，并收集于

0.1M磷酸缓冲液中。

7.成色反应（O・D法，有关A液、B液、C液配制见上）

（1）0〜4°C蒸馆水冲洗切片三次。

（2）放入A液30分钟（置冰箱）。

（3）0〜4。

（2蒸憾冲洗切片三次。

（4）放入B液30分钟（置冰箱）。

（5）0〜4°C蒸馆水冲洗切片三次。

（6）放入C液中（置冰箱）。

8.蛋白甘油贴片

9.1%中性红复染，脱水透明，最后中性树胶封片，光镜下观察。

（七）实验结果及评价（以〃上巨虚〃穴区为例）

1.未注射侧的情况：

所有的实验动物在未注射侧的切片上，各脊神经节都未出现标记细胞。

2.五组实验动物在脊神经节出现标记细胞的情况

（1）穴区组在切片上，可见注射侧脊神经节L4〜S2节段中都出现了标记细胞，以L7〜S2节段的标记细胞为最多。

占总数的83%,其次为L

2、L

5、L4节段。

腰段以L7为最多，占总数的40%；紙段以S1为最多，占总数的26%。

其它各节段都未出现标记细胞。

（2）神经干组在切片上，可见注射侧在脊神经节L1〜S3节段中出现了标记细胞。

以L7〜S2节段的标记细胞为最多。

占总数的

68.2%,其次为L

5、L

4、L

3、S

3、L

2、L

1、腰段以L7为最多，占总数

31.3%o段以S1为最多，占总数的21%。

其它各节段都未出现标记细胞。

（3）切断神经组、空白对照组在切片上各脊神经节都未出现标记细胞。

（4）切断血管组在切片上可见注射侧脊神经节L4〜S2节段中都出现了标记细胞，以L7〜S2为最多。

占总数的

76.9%,其次是L

6、L

5、和L4。

腰段以L7节段为最多。

占总数的

31.7%,紙段以S1节段为最多，占总数的

2.4%。

其它各节段都未出现标记细胞。

3.大、中、小三型标记细胞在脊神经节内出现的情况

本实验用Leitz测微尺测定实验中所有出现细胞的大小，其穴区组、神经干组、切断血管组都能见到大、中、小三型标记细胞，且都以中、小型细胞为主，各占总数的

75.6%、

76.1%、74%,其中又以小型标记细胞为最多，各占总数的

42.1%、

43.5%、

40.4%。

4.标记细胞的形态：

实验中发现酶标细胞呈绿色，各酶标细胞颗粒密度不一，形态大多数为椭圆和圆形。

实验表明，家兔"上巨虚〃穴区的传入神经元支配节段（L4〜S2）,短于其穴区下腓神经的传入神经元支配节段（L1〜S3）:

标记细胞以中、小型细胞（尤其是小型细胞）为主，提示传导针感的纤维主要是中、细纤维；血管在HRP的运输过程中未起多大的作用，起作用的是神经，本研究为针刺“上巨虚〃穴治疗胃肠疾病的形态学提供了理论基础。

（九）注意事项：

灌注时应注意顺序和灌注液的温度、数量、灌注速度。