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常用神经示踪剂及其示踪特点

作者：

朱贺李丽赵磊马克涛司军强

【摘要】丰富的神经示踪技术极大的促进了神经解剖学的发展，为神经生物学的各种研究提供了良好基础，在此，我们概述了常用神经示踪剂及其示踪特点，重点介绍了各种荧光染料和植物凝集素IB4的示踪特点。

【关键词】神经示踪剂;辣根过氧化物酶;荧光染料;植物凝集素IB4;病毒

自20世纪70年代初Kristenson首次将辣根过氧化物酶（HRP）应用于追踪神经纤维联系以来，该方面的研究取得了前所未有的迅猛发展。

此后，许多用途广泛、敏感性强并能选择性地进行顺行、逆行标记或同时具有顺、逆行标记的追踪物质被应用到神经纤维联系的研究，对神经解剖学的发展起到了积极的推动作用。

现就常用的神经示踪剂及其示踪特点综述如下：

　　1辣根过氧化物酶

　　1.1辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase，HRP）HRP是一种含血红素基的植物糖蛋白。

HRP法是20世纪70年代发展并被广泛应用的一种神经追踪方法，但由于HRP显影需要许多复杂的免疫组织化学技术，而且HRP参与细胞代谢，不能在细胞内长期存留，易扩散到邻近组织造成神经元的误染，其反应产物较不稳定，易丢失，另外还存在“再摄取”现象[1]，使得HRP在神经逆行示踪方面的应用大大减少。

　　1.2霍乱毒素亚单位B结合的辣根过氧化物酶（CBHRP）R.N.Ranson等[2]对传统的辣根过氧化物酶的染色方法进行了改进，采用结合了霍乱毒素亚单位B的辣根过氧化物酶（CBHRP）作为示踪剂，清晰显示了神经元的胞体和轴突结构。

近来也有采用四甲基联苯胺（TMB）为底物替代传统的二氨基联苯胺（DAB）来示踪豚鼠的面神经[3]的报道。

TMB与DAB相比有不致癌和HRP反应灵敏度高，操作简便，步骤少，用时短及成本低等诸多优点。

　　HRP法标记的神经元经组织化学法处理后,细胞失去了活性,无法进行膜片箝等神经电生理的研究,限制了HRP法在这一领域内的应用。

　　2荧光染料

　　从上世纪50年代开始，荧光染料示踪技术发展起来。

它贮存稳定，特别是组合采用不同的荧光染料分别标记神经元胞核和胞浆，可实现荧光双标或多重标记，这是荧光素示踪的一个最大优点。

这种示踪剂染色后只需使用荧光显微镜，便可观察到已被标记的神经纤维或胞体。

下面介绍几种常用的荧光素。

　　2.1固蓝（Fastblue，FB）FB系水溶性染料，其颗粒较细密，易于被神经轴索摄取，所以标记神经纤维或胞体多于其他染料，易于从标记细胞内扩散到周围组织，照射时褪色较快，即使保存在低温、避光条件下，仍不能长期保存。

对需要标记后较长时间的观察，或需分离培养神经元细胞进行实验研究则不太理想。

　　2.2荧光金（Fluorogold，FG）FG系脂溶性染料，能标记细胞质，它在紫外线（323nm）激发下发金黄色光（408nm），属慢速轴浆运输类，细胞核不着色，能很好显示树突分支，细胞外无荧光染料渗漏，不易扩散，与周围组织分界清晰，褪色比较慢，可以经受许多组织学染色处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等方法结合。

其在细胞质内的存在不超过3周[4]。

　　有学者将其用于视神经的研究,标记了视神经纤维的分布路径和走向[5]。

TakayukiNakajima等[6]采用荧光金结合SP、CGRP免疫荧光标记反应，发现大鼠L6DRG和S1DRG内均存在大小不等的SP/CGRP双标记神经元及中小型大小的FG/SP、FG/CGRP双标记阳性细胞和FG/SP/CGRP三标记阳性细胞，这些标记阳性细胞可能与包皮系带损伤后阴茎自发性疼痛的产生和传递有关。

　　2.3羰化青（1,1′Dioctadecyl3,3,3′,3′tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI）DiI是一种紫红色晶体，具有高度的亲脂性,在水中的溶解度很低，通常用乙醇溶解。

它荧光强而稳定,无毒性，不影响被标记细胞的存活、生长，在标记细胞内消失慢、单纯沿脂质膜扩散，有良好的轴突特异性，且对过路纤维影响小。

在549nm激发光下可以产生发射波长为565nm红色荧光[7]。

　　1986年Honig[8]等首次报道DiI可作为荧光示踪剂用于培养的神经细胞和骨骼肌细胞。

DiI对试管内动物胚胎的感觉和运动神经元没有显著的毒性作用，因而适用于活的组织、细胞的示踪、标记。

但也有研究报道显示DiI易于淬灭及易向神经元胞体外扩散的问题[9]。

总的来说,DiI具有在细胞内稳定表达、标记细胞形态良好、对活体细胞无毒性、在标记细胞内消失慢[10]、使用简便、染色速度快的特点。

尤其是不影响被标记细胞的电生理和生化特性使其越来越多的被用于神经科学领域的研究[11]。

　　2.4荧光染料双标染色法双标技术是通过不同示踪剂对细胞核、细胞浆亲和力不同，用两种示踪剂对不同的神经纤维或靶器官进行标识。

　　2.4.1固蓝（FastBlue）和核黄（NclearYellow）双标染色ViterboF等[12]用固蓝和核黄双标染色研究损伤后的胫神经和腓神经的侧芽来源情况，对神经纤维进行了直接的形态学观察。

　　Blue）和双脒基黄（DiamidinoYellow）双标染色双脒基黄（DiamidinoYellow）荧光激发波长360nm，经神经轴浆流的逆行转运可达细胞核，细胞核呈绿色、黄绿色或黄白色。

激发后荧光很强时，细胞浆有时映出部分黄绿色或黄白色。

C.T.Byers等[13]比较了固蓝（FastBlue）和双脒基黄（DiamidinoYellow）逆行标记神经元的效力,研究结果显示无论是单独使用还是二者按任何次序联合使用,被标记的神经元的数目是一致的。

证明使用FB和DY进行荧光双标的方法是可行的。

相对于FB和其他的荧光染料组合形式,DY和FB的组合更为合理。

DY能够标记细胞核的同时FB可以清晰的显示细胞浆,在同一荧光显微镜下,二者可以清晰的显示被标记的细胞而充分互补。

　　2.4.3台盼蓝（TrypanBlue）和双脒基黄（DiamidinoYellow）双标染色台盼蓝荧光激发波长为375nm，经神经轴浆流的逆行转运可达细胞浆，激发后细胞浆呈亮蓝色。

Yang等[14]使用双脒基黄和台盼蓝荧光双标研究切断腓总神经后行腓总神经断端和胫总神经吻合的脊髓背根神经节细胞发现,在相应L4L6背根神经节及相应脊髓腰膨大中分别存在双脒基黄和台盼蓝双标的细胞，说明两神经之间有交叉支配的存在，表明神经端侧缝合后的再生方式是侧枝芽生。

　　1991年Fritzsch和Sonntag[15]比较研究了荧光素和生物素葡糖聚胺的标记效力，随后Harsh[16]等在1991年又比较了FG素和DiI两者之间的标记效能。

1993年，Brushart等人又分别比较研究了荧光素和HRP之间的标记效能。

这几种示踪剂的组合的弊端是在同一显微镜下不能被同时观察到。

更重要的是，生物素葡糖聚胺和DiI通常情况下不被未损伤神经摄取的特性决定使用两者作为标记物时必须先切断或损伤被标记神经。

常用的几种荧光染料中，TB和FB能够标记细胞浆，NY和DY能够特异的结合被标记细胞的细胞核。

　　由于荧光素分子量小，用于逆行追踪的共同问题是易于扩散，比HRP法更难于确定有效注射部位。

与HRP法相似，荧光素示踪法也存在过路纤维摄入问题。

褪色是荧光素的一大缺点，在激发光照射下较快褪色，因此允许观察的时间短。

即使在低温、避光条件下，切片保存时间仍有限，不能长期保存。

　　3生物素葡糖聚胺（Biotindextranamine,BDA）

　　BDA应用于轴浆运输的各种示踪剂，常用来研究神经元的分支投射，但很少有直接用于观察周围神经局部轴突的研究。

BDA具有保存时间长，并可与多种荧光追踪剂及各种免疫组织化学技术相结合的优点[17]，能满足光镜及电镜下观察的要求。

相对于HRP与荧光素示踪剂，经处理的BDA标记组织标本可以保存6个月以上，不影响最终显影结果。

　　4病毒

　　常用在神经通路示踪方面的两类病毒是腺病毒（Adenovirus）、腺病毒伴随病毒（Adenoassociatedvirus,rAAV）和疱疹病毒。

　　腺病毒和腺病毒伴随病毒在神经示踪中的应用得益于绿色荧光蛋白（Greenfluorescenceprotein,GFP）基因的发现。

日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健正是因为在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出的重大贡献摘取了2008年的诺贝尔化学奖。

　　GFP来源于维多利亚水母（AequoreaVictoria）,其荧光发射峰在509nm，最大激发波长为395nm，并在470nm处有1个肩峰[18]，其化学性质相当稳定[19]。

荧光蛋白的显著优点是与生物相容性好，标记生物分子后不影响其生物活性，发光强度高，易于识别与检测。

但是，目前荧光蛋白种类还比较少，而且大部分都是从生物体中提取，较难大批量生产[20]。

　　4.1腺病毒（Adenovirus）、腺病毒伴随病毒（Adenoassociatedvirus,rAAV）构建表达GFP的腺病毒和rAAV载体，用于神经细胞和神经通路的示踪，具有独特的优点。

GFP产生的荧光可以耐受光漂白和福尔马林的固定，能够制成长期保存的标本[21]，可用于不同神经元的形态学分析和纤维联系的研究，尤其适用于某些特定功能的局部神经环路的研究。

　　但是注入GFP基因重组病毒的多少将影响GFP荧光的强弱。

如果注入重组病毒过少时，荧光浅淡而不易观察，如果注入的GFP基因重组病毒较多，它在标记神经元及突起的同时，会增多对神经胶质细胞的标记，产生干扰[22]。

　　4.2疱疹病毒（Herpervirus）疱疹病毒的主要特点是亲神经性和跨神经元传递。

疱疹病毒是具有复制能力的病毒，作为神经通路的示踪剂,它能够对示踪信号进行放大，增加了示踪的灵敏度。

在应用疱疹病毒作为神经示踪剂时，对病毒毒株的选择对实验成败具有重要的意义。

　　5植物凝集素IB4

　　凝集素（Lectins）是一类从各种植物种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。

凝集素最大的特点是能识别细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。

　　作为初级伤害性感受器的小直径感觉神经元根据和IB4结合能力的不同可以分为植物凝集素阳性的非肽能神经元和植物凝集素阴性的肽能神经元，前者呈胶质源性营养因子依赖性，而后者则呈神经生长因子依赖性[23]。

植物凝集素阳性的非肽能神经元的动作电位相对于植物凝集素阴性的肽能神经元而言，其持续时间较长、具有更高密度的河豚毒素不敏感的钠电流以及更小的热伤害刺激电流[24]。

Belyantseva等[25]发现在遭受慢性损伤后，植物凝集素阴性的肽能神经元会大量的增生。

　　综上所述，辣根过氧化物酶最早应用于神经的逆行示踪，但由于使用方法较复杂且稳定性差、易扩散，限制了它的应用;荧光示踪剂使用方法简便易行、易观察，但存在荧光淬灭现象，仅适用于短期观察，而生物素葡聚糖胺则不存在这种现象，其结果可以保存较长时间;其他毒素或病毒鳌合物能良好地显示神经元链或网络，但目前在神经示踪方面应用较少;物凝集素IB4能特异地和脊神经节内与伤害性刺激相关的小型神经元结合，为脊髓背根神经节痛觉相关小直径细胞的研究提供了极大的方便。

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