一种曲霉固体发酵产生两种纤维素酶的条件优化.docx
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一种曲霉固体发酵产生两种纤维素酶的条件优化
本科生毕业论文
题目：
一株曲霉固体发酵产生两种纤维素酶的条件优化
专业代码：
070401（生物科学）
作者姓名：
尚敏敏
学号：
2009400667
单位：
生命科学学院
指导教师：
张辉
2013年5月29日
原创性声明
本人郑重声明：
所提交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外，论文中不含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得聊城大学或其他教育机构的学位证书而使用过的材料。
对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人承担本声明的相应责任。
学位论文作者签名：
日期
指导教师签名：
日期
目录
前言1
1材料与方法3
1.1材料3
1.1.1出发菌种3
1.1.2培养基3
1.1.3仪器3
1.1.4分析试剂4
1.2方法4
1.2.1菌种培养方法4
1.2.2种子培养4
1.2.3固体发酵产酶培养4
1.2.4粗酶液的制备5
1.2.5酶活力的测定5
1.2.6酶活力的定义5
1.2.7葡萄糖标准曲线的绘制5
2结果与分析6
2.1葡萄糖标准曲线6
2.2产酶条件研究6
2.2.1碳源对黑曲霉固体发酵产酶的影响6
2.2.2氮源对黑曲霉固体发酵产酶的影响7
2.2.3初始pH值对曲霉发酵产酶的影响8
2.2.4接种量对曲霉固体发酵产酶的影响9
2.2.5培养时间对黑曲霉固体发酵产酶的影响10
3结论10
参考文献11
致谢14
摘要
以试验对曲霉QM-2固体发酵产生两种纤维素酶（CMCase、FPA酶）的条件进行了初步研究。
以不同的碳源比例[麸皮、玉米秸秆粉、麦秸粉、麸皮+玉米秸秆粉（1/1）、麸皮+玉米秸秆粉（2/8）、麸皮+玉米秸秆粉（8/2）、麸皮+麦秸粉（1/1）、麸皮+麦秸粉（2/8）、麸皮+麦秸粉（8/2）]，氮源[硫酸铵，氯化铵，硝酸钾,尿素,酵母膏，蛋白胨,硫酸铵+酵母膏,硫酸铵+蛋白胨，酵母膏+蛋白胨]，初始pH值（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0），接种量（2.0%，5.0%，8.0%，11.0%，13.0%），培养时间（1-7天）进行试验并分别测定了CMCase与FPA酶的酶活。
结果表明，当碳源为麸皮+麦秸粉（1/1）15g，氮源为硝酸钾0.6g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O0.3g，pH为6.0，40℃培养4天测得纤维素酶的酶活力最大。
关键词：
曲霉QM-2；纤维素酶；固体发酵
Abstract
ItwasstudiedthattheoptimumsolidfermentationconditionsofaspergillusQM-2toproducetwokindsofcellulaseenzyme（FPA）,CMCasethroughsinglefactorexperimentsandorthogonaltests.
Itwastestedwithsixfactorssuchasdifferentcarbonsourcescale[bran,wheatstraw,cornstrawpowderpowder,bran+cornstrawpowder（1/1）（2/8）,bran+cornstrawpowder,bran（8/2）+cornstrawpowder,bran+strawpowder（1/1）,bran,wheatstrawpowder（2/8）,bran+strawpowder（8/2）},nitrogensource（（NH4）2SO4，NH4Cl,KNO3,carbamideurea,yeastexfact,peptone,（NH4）2SO4+yeastexfact,（NH4）2SO4+peptone，yeastexfact+peptone],theinitialpH（4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0）,quantity（2.0%,5.0%,8.0%,2.0%,5.0%）,,culturetime（1-7days）weremeasured.
Theresultsindicatedthatwhenculturedforthreedaysat40℃,thecarbonsourcethatwasbran+strawpowder（1/1）15g,thenitrogensourcethatwastheKNO30.6g,KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O0.3g,pHto6.0,celluloseactivityreacheditsmaximum.
Keywords:
Aspergillussp.QM-2；Cellulase；Solidstatefermentation
一株曲霉固体发酵产产生两种纤维素酶条件研究
前言
纤维素是植物纤维的主要成份（干重35％～50％），是地球上数量最大的可再生资源，是陆地环境里光合作用的主要产物，同时也是生物圈中所产生的最丰富的可再生生物资源，广泛地应用到许多部门[1]。
中国每年仅纤维素秸秆产量就达6×108t之多，然而由于难以大量被动物分解利用，大部分以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，造成极大的污染和浪费。
如何高效地将纤维素进行工业转化天然纤维素降解为可利用的糖液，再进一步转化为酒精、菌体蛋白、气体燃料（如氢气）等物质，对解决当今世界所面临的粮食短缺、能源危机和环境污染问题具有深远的意义[2-4]．
将纤维素类物质的糖化有酸解法和酶解法等．酶解法由于能耗低，反应条件温和以及不使用有毒和腐蚀性的化学物质而倍受青睐[5]．自从1906年Seilliere从蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，人们对纤维素酶做了大量的研究．特别是80年代以来，随着分子生物学的发展及生物工程技术的兴起，纤维素酶的研究与应用取得了巨大进展．作为降解纤维素的高效生物催化剂，纤维素酶广泛用于酿酒、食品[6]、饲料[7]、纺织[8]、造纸[9]、制药、环保、石油开采等领域．显然，利用纤维素酶进行生产转化对人类的生存环境和可持续发展有着举足轻重的影响．同时利用纤维素酶对纤维素的降解、转化也是自然界中碳素转化的主要环节[10-14]，以此作为新能源和饲料来源，因具有经济、有效、节约等优点而对可持续发展有重要意义[15]。
因此利用微生物降解纤维素而成为当今有效地开发利用纤维素资源的热门课题[5-6]。
特别是面对当前化石燃料资源匮乏、环境污染严重的状况，如何利用纤维素酶进行生物燃料的高效转化已成为研究热点[16-17]
纤维素分解菌的筛选方法主要有纤维素选择培养基法、滤纸底物和纤维素天青培养基法、半固体纤维素天青试管法、《P-N》法和纤维素刚果红培养基法等[18-22]。
其中，纤维素刚果红培养基在对纤维素分解菌的准确识别方面具有明显的优越性。
1950年Reesetetal指出，纤维素是由葡萄糖残基以β-1,4糖苷键连接而成的线状大分子物质，在纤维素酶的作用下水解成纤维二糖和葡萄糖，水解后的糖类与刚果红染料形成红色沉淀，使产酶菌株的菌落周围出现清晰的红色水解圈。
根据水解圈的大小，可以粗略地估计菌株产酶的情况，提高工作效率。
通过微生物降解纤维素，包括真菌、放线菌和细菌，常见的有青霉（Penicillum）、木霉（Trichoderma）、链霉菌属（Streptomyces）、镰刀菌（Fusarium）、纤维素诺卡氏菌（NocardiaCellulans）、芽孢杆菌属（Bacillus）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）等，常见的微生物主要有：
康氏木霉（Trichoder-makoningii）、黑曲霉（Aspergillusniger）、斜卧青霉（Penicilliumdecumbens）、芽孢杆菌（BacillusSP）等。
实验可知，丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，产纤维素酶的微生物很多，其中真菌木霉属（Trichoderma）是迄今所知形成和分泌纤维素酶系成分最全面、活力最高的一个属[23]。
微生物产生的纤维素酶是降解纤维素，是对纤维素大分子的水解具有催化作用的一个蛋白质多水解酶组分的酶系，使纤维素分解成纤维二糖、葡萄糖等可溶性糖的一组酶的总称[24]。
纤维素酶其主要成分包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。
通过-种酶的协同作用，具有结晶结构的纤维素便可达到降解的目的并提高羟基的反应活性。
纤维素酶对纤维素作用是多相催化反应。
溶液中的纤维素酶首先作用于纤维素表面，然后扩散入纤维素内部，纤维素酶很容易作用于无定型区，较难作用于结晶区[25]。
目前普遍认为，完全降解纤维素至少需要3种功能不同但又互补的纤维索酶组分，即EG（纤维素内切葡聚糖酶：
EC3.2.1.4）、CBH（外切β-l，4一葡聚糖酶或纤维素二糖水解酶：
EC3.2.1.94）和CB（纤维二糖酶或β-葡萄糖苷酶：
EC3.2.1.21）[26-29]．EG可以随机水解纤维素分子内部的β-1，4一葡萄糖苷键，生成新的分子末端；CBH会程序性的剪切纤维素分子末端，释放出水溶性纤维二糖或葡萄糖；CB水解纤维二糖或纤维糊精生成葡萄糖，并能降低过量纤维二糖引起的水解抑制作用．从而，在它们的相互协同作用下将纤维素快速水解为葡萄糖[30]。
目前最流行的纤维素酶水解机理为：
①结晶纤维素先在内切葡萄糖酶的作用下形成无定型纤维素或可溶性低聚糖；②在纤维二糖水解酶作用下生成纤维二糖；③在β-葡聚糖苷酶作用下生成葡萄糖。
还有人认为，天然纤维素首先在一种非水解性质的解链因子或解氢键酶作用下。
使纤维素链间和链内氢键打开，形成无序的非结晶纤维素，然后在3种酶的协同作用下水解为纤维糊精和葡萄糖[31]。
目前，纤维素酶的生产普遍采用液体深层发酵生产工艺，其设备投资大、生产成本高，限制了纤维素酶的广泛应用。
然而，利用固体发酵技术生产纤维素酶则具有经济实用的优点越来越受重视，而利用廉价的农业废弃物为原料生产纤维素酶则以进一步降低其生产成本。
因此，研究曲霉固体发酵产生纤维素酶的条件优化具有重要意义[32]。
虽然国内外有对曲霉产纤维素酶的发酵条件进行研究[33]，但我们自己分离的曲霉QM-2也有其自身的特点，因此，本论文以实验室分离并保藏的曲霉为出发菌株，采用五种因素包括碳源、氮源、培养时间、培养温度、pH值对合成木聚糖酶的影响，进行试验，从而对曲霉发酵条件进行优化，现将结果报告如下。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1出发菌种
曲霉QM-2，本实验室分离并保存菌种。
1.1.2培养基
斜面（平板）培养基（PDA培养基）[10]：
马铃薯200g，蔗糖（或葡萄糖）20g,q琼脂15-20g，水1000ml,pH自然。
马铃薯去皮，切成块煮沸30min,然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000ml。
121℃灭菌30min。
发酵基础培养基：
麦麸15.0g，（NH4）2SO40.6g，NaCl0.5g，KH2PO40.3g，
MgSO4·7H2O0.3g,CaCO30.03g,含水量65%，起始pH6.0。
1.1.3仪器
HZQ-C空气浴振荡器（中国哈尔滨市东明医疗仪器厂），
DHP—9082型电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），
ZDX—35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），WD—9409型桌面超净工作台（北京六一仪器厂），
HH—8型恒温水浴锅（江苏金坛新航仪器厂），
WFZUV-2100型紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司），
LD4-2低速离心机（北京医用离心机厂），
HANGPINGFA1004型电子天平（上海天平仪器厂），
可调万用电炉（龙口市电炉制造厂），
WP700TL23—K5格兰仕光波炉（佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司），100g托盘天平（湖北武穴师范天平厂）。
另外还有容量瓶，量筒，试管，漏斗，培养皿，打孔器，移液管，三角瓶，广口瓶，试管架，烧杯，玻璃棒，铁架台，pH试纸，滤纸。
1.1.4分析试剂
1mg/ml的标准葡萄糖溶液：
准确称量100mg（0.1g）葡萄糖于小烧杯中，用少量蒸馏水搅拌溶解后，定量转移至100ml容量瓶后，定容至刻度线，然后冰箱保存备用。
3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂[12]：
6.3g3,5-二硝基水杨酸和262ml的2mol/L的氢氧化钠溶液加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5g重结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至1000ml，溶液为黄色，储存于棕色瓶中，7天后再使用。
pH4.8的醋酸缓冲液：
将0.2mol/L的醋酸钠溶液和0.2mol/L的醋酸溶液按59：
41的比例混和均匀，即可得到。
1.0%羧甲基纤维素钠：
准确称取2.5gCMC-Na溶于50mM的pH4.8醋酸缓冲液中，加热至溶化，定容至250ml，备用。
1.2方法
1.2.1菌种培养方法
斜面菌种培养：
在超净工作台上，将菌种用划线法接入事先配制好的PDA斜面培养基中，将其放入30℃恒温培养箱中培养5-7天，待孢子全部长出后，备用以制备孢子液。
1.2.2种子培养
取菌株斜面（30℃下培养7天），，用接种环刮取表面孢子后，接入到50ml灭菌的PDA液体培养基中，于30℃下培养12h后，备用。
1.2.3固体发酵产酶培养
取菌丝球悬液，按照接种量为10.0%（V/W,W为固体培养基总重量）接入菌种，摇匀后，于30℃下培养96h后，取出备用。
1.2.4粗酶液的制备
取5.0g发酵料放入150ml三角瓶中，按照固液比为1/15（W/V）的比例加入蒸馏水，用玻璃棒将固体发酵料捣碎后，在30℃，160rpm下提取2.0h后，将混合物用滤纸过滤，滤液为粗酶液。
1.2.5酶活力的测定
CMC活力测定：
取0.2ml粗酶液，与1.8ml的CMC溶液（1.0%，w/v，用50mM的pH4.8醋酸缓冲液配制）混合后，于50℃下保温30min后，加入1.5mlDNS溶液终止反应。
将上述试管放入沸水浴保温5min进行显色，以100℃下灭活10min的酶液为对照。
FPA活力测定：
取0.2ml粗酶液，与1.8ml的50mM的pH4.8醋酸缓冲液混合后，加入滤纸条（1cm*6cm），于50℃下保温40min后，加入1.5mlDNS溶液终止反应。
将上述试管放入沸水浴保温5min进行显色，以100℃下灭活10min的酶液为对照。
1.2.6酶活力的定义
在反应条件（50℃，pH4.8）下，每1.0g干固体发酵料在1分钟内水解底物产生1μmol葡萄糖为1个酶活力单位（IU）。
1.2.7葡萄糖标准曲线的绘制
取7支试管按表1.1所示操作
表1.1葡萄糖标准曲线的绘制
管号
0
1
2
3
4
5
6
葡萄糖标准液/ml
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
蒸馏水/ml
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
DNS/ml
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
将各管内的液体混匀，在100℃的水浴中加热5分钟，取出冷却至室温，加蒸馏水20ml，将各管摇匀，将分光光度计调至520nm波长，用零号管调零，再读取1-6号管的吸光值，然后将读取的吸光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
2结果与分析
2.1葡萄糖标准曲线
根据1.2.7的方法，将各管内的液体混匀，煮沸反应5min，取出冷却至室温，加入蒸馏水20ml，将各管摇匀，将分光光度计调至540nm波长，用零号管调零，再读取1-6号管的吸光值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，吸光值（OD值）为纵坐标，绘制葡萄糖的标准曲线，结果见图2.1。
图2.1葡萄糖标准曲线
2.2产酶条件研究
2.2.1碳源对黑曲霉固体发酵产酶的影响
在基础培养基的基础上，分别加入不同的碳源：
麸皮、玉米秸秆粉、麦秸粉、麸皮+玉米秸秆粉（1/1）、麸皮+玉米秸秆粉（2/8）、麸皮+玉米秸秆粉（8/2）、麸皮+麦秸粉（1/1）、麸皮+麦秸粉（2/8）、麸皮+麦秸粉（8/2），其它成分不变，按照10%（V/W）接入种子液后，在30℃培养4天，测定吸光值，以吸光值间接表示酶活力，确定产酶最适碳源并分析。
结果见图2.2。
横坐标为不同的碳源，纵坐标为酶活力。
结果表明，葡萄糖酶是一类诱导酶，合适的碳源是诱导产酶的重要条件，当碳源为麦麸秸秆粉：
麸皮为1：
1的比例时，产生的酶量最多，测得的酶活力最大，原因是麸皮中含有丰富的低聚葡萄糖、纤维二糖等诱导物质，充分诱导菌体产生大量的纤维素酶[13]。
可见,碳源类型影响纤维素酶的选择性合成。
图2.2.碳源对纤维素酶的影响
2.2.2氮源对黑曲霉固体发酵产酶的影响
去掉基础培养基中原有氮源，分别加入等量的不同氮源：
硫酸铵，氯化铵，硝酸钾,尿素,酵母膏，蛋白胨,硫酸铵+酵母膏,硫酸铵+蛋白胨，酵母膏+蛋白胨，其它成分不变，接入孢子液后，在30℃下培养4天，测定测定吸光值，以吸光值间接表示酶活力，确定产酶的最适氮源并进行分析。
结果见图2.3。
结果表明，当氮源为硝酸钾时，测得的酶的活性最为高。
图2.3.氮源对纤维素酶的影响
2.2.3初始pH值对曲霉发酵产酶的影响
采用最适碳源和氮源，将基础培养基pH值调至4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0（由于固体发酵培养基调整pH不方便，因此直接用生态实验室的pH计对盐溶液的pH进行调节，然后将料和盐溶液混合即可），其它成分不变，接种子液后，在40℃下培养4天，测定吸光值，以吸光值间接表示酶活力，。
确定该菌产酶的最适pH并进行分析结果见图2.3。
结果表明，当起始pH为6.5时，葡萄糖酶活力最大。
表明该菌在产酶最适pH，略接近于中性，表明该菌在中性时产酶量最大。
图2.4.1pH值对纤维素酶的影响
2.2.4接种量对曲霉固体发酵产酶的影响
在基础培养基中成分不变，采用最适碳源、氮源和pH配制培养基，其他成分不变，设计不同的接种量：
2.0%，5.0%，8.0%，11.0%，13.0%接入菌种后，40℃下培养4天，测定测定吸光值，以吸光值间接表示酶活力，结果见图2.4。
结果表明，接种量为11.0%时，酶产量达到最大值。
接种量过高或过低都不利于曲霉产酶，影响菌体的生长。
表明该菌能够在相对较高的接种量下产生葡萄糖酶
2.5.接种量对纤维素酶的影响
2.2.5培养时间对黑曲霉固体发酵产酶的影响
在基础培养基中成分不变，接入菌种后，分别置于40℃恒温培养箱中培养1-7天，测定吸光值，以吸光值间接表示酶活力，结果见图2.5。
结果表明，培养到第3天时，木聚糖酶活力最高。
原因是菌株在发酵前期随着培养时间的延长，菌体逐渐长成，测得发酵液中酶活不断提高。
随着培养时间的继续延长，受到菌株的老化以及积累代谢产物的影响，测得发酵液酶活逐渐下降[14]。
图2.6.1培养时间对纤维素酶的影响
3结论
根据以上研究结果，可以看出，培养基的组成和培养条件对葡萄糖酶的产生均有重要影响，发酵产酶条件的优化对于提高菌株的产葡萄糖酶量具有重要意义。
对于本论文的出发菌株-曲霉QM-2，麦麸秸秆粉+麸皮（1：
1）为碳源时，产酶量相对较高；硝酸铵为氮源时，产酶量相对较高，而且硝酸铵是一种廉价氮源，曲霉对其具有良好的适应性和利用率，表明该菌株产葡萄聚糖酶时，可以节约成本，具有一定的应用前景。
本实验研究的是对发酵培养基的优化，而未对产生的葡萄糖酶的美学性质进行研究，因此在下一步的研究工作中，主要研究葡萄糖酶的酶学性质，进一步为相关研究提供一定的理论支持和技术参考。
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