临床免疫学与检验重点.docx

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临床免疫学与检验重点

临床免疫学与检验重点

免疫学简介

一、免疫学概念与免疫应答

免疫应答过程：

抗原的识别、处理、信息传递、免疫细胞的激活、增值、分化以及产生一系列的免疫效应分子

免疫应答分为识别阶段、活化阶段、效应阶段

1、识别阶段：

是巨噬细胞等抗原呈递细胞对外来抗原或自身变性抗原进行识别、摄取、降解和递呈抗原信息给T副主席报及相关淋巴细胞的阶段

2、活化阶段：

是T、B淋巴细胞在接受抗原信号后，在一系列免疫分子的参与下，发生活化、增值、分化的阶段。

B细胞接受抗原信息分化为浆细胞，T细胞接受抗原刺激和协同刺激双信号后分化为效应细胞

3、效应阶段：

是浆细胞分泌特异性抗体，执行体液免疫功能。

T细胞中的Th细胞分泌细胞因子等效应分子，T杀伤细胞执行细胞毒效应功能。

另外有少量T、B细胞在增值分化后，不直接执行效应功能，而成为记忆细胞

免疫应答效应多为生理性，是机体对外来抗原或自身变性抗原的清楚效应

二、免疫组织与器官

免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子构成

免疫器官按功能不同，分为中枢免疫器官和外周免疫器官。

中枢免疫器官是免疫细胞产生、分化和成熟的场所，由骨髓和胸腺组成；外周免疫器官是免疫应答的场所，有淋巴结、脾及扁桃体等组成。

单核细胞核淋巴细胞经血液循环及淋巴循环进出于外周淋巴组织及淋巴器官，形成机体免疫系统的免疫网络。

（一）中枢免疫器官

1、骨髓

2、胸腺：

是一级淋巴上皮组织，是T细胞发育的重要中枢器官，胸腺由胸腺基质细胞（TSC）和胸腺细胞组成。

（二）外周免疫器官及组织

1、淋巴结：

分为皮质区及髓质区。

皮质区主要的细胞是B淋巴细胞又称为非胸腺依赖区。

淋巴结的中心是髓质区，由淋巴索和淋巴窦组成，淋巴索为之谜聚集的淋巴细胞，包括B细胞、浆细胞、T细胞及巨噬细胞

淋巴结主要功能：

是共淋巴细胞栖息和增值的场所；是适宜于淋巴细胞增值分化发挥免疫应答的基地；是淋巴液运行中监视清除病原体异物的过滤监控站

2、脾：

是富含血管的最大外周淋巴器官。

3、黏膜伴随的淋巴组织：

有B细胞、T细胞、浆细胞及巨噬细胞，受局部侵入的病原体激活执行固有和适应性的免疫应答，使B淋巴细胞活化分化为浆细胞，产多种Ig类别的看那个题，其中最主要的是IgA及分泌型IgA，执行体液免疫及局部特异免疫作用

（三）淋巴细胞再循环与归巢

三、免疫细胞

（一）淋巴细胞：

是免疫系统的主要细胞，包括T细胞、B细胞核NK细胞

1、T细胞外周血中T细胞约占淋巴细胞的70%-75%。

（1）、T细胞受体（TCR）：

是T细胞特有的表面标志，可表达于所有的成熟T细胞表面。

T细胞识别抗原和转导信号是由TCR特异识别MHC分子递呈的抗原肽，CD3分子转导T细胞活化的第一信号，TCR与CD3分子通过盐桥结合形成稳定的复合物，TCR识别抗原的这一特点构成MHC限制性的基础

（2）簇分化抗原（CD）：

是区分T淋巴细胞的重要标志，T细胞发育不同阶段的亚群存在不同的分化抗原

2、B细胞：

B淋巴细胞是在骨髓内发育成熟的细胞，是免疫系统中的一种主要细胞，主要功能是：

产生抗体；呈递抗原；分泌细胞因子参与免疫调节。

人外周血液中B淋巴细胞约占5%-25%

3、自然杀伤细胞：

自然杀伤细胞（NK）来源于骨髓造血干细胞，其发育成熟依赖于骨髓及胸腺微环境。

NK细胞无须抗原刺激，可非特异性直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞。

活化的NK细胞可分泌IFNγ和TNFɑ等细胞因子，参与免疫调节作用

（二）免疫辅助细胞凡能够通过一系列辅助淋巴细胞活化的细胞称为辅佐细胞。

辅佐细胞主要包括单核-吞噬细胞系统、树突状细胞俩类。

吞噬细胞包括单核-吞噬细胞系统（包括血液中的单核细胞和组织中的巨噬细胞）和中性粒粒细胞，其共同特征是表达MHCⅡ类分子及具有吞噬作用

树突状细胞不具有吞噬能力，但具有很强的抗原递呈能力，称专职性抗原递呈细胞

四、免疫分子

免疫分子指的是由一些免疫活性细胞或相关细胞分泌的参与机体免疫反应或免疫调节的蛋白质及多肽物质。

通常指免疫球蛋白、补体、细胞因子、细胞黏附分子、人类白细胞分化抗原等

（一）免疫球蛋白免疫球蛋白（Ig）是B细胞经抗原刺激后增值分化为浆细胞后产生的，存在于血液和体液中能与相应抗原特异性结合、执行体液免疫功能的一组球蛋白。

分为分泌型（sIg）及模型（mIg），前者主要存在于体液中，具有抗体的各种功能，后者作为抗原受体表达于B细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白

抗体是机体在抗原刺激下，由浆细胞合成分泌产生的具有免疫功能的球蛋白。

所有的抗体军事免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗体。

免疫球蛋白的化学结构：

由4条肽链借链间二硫键连接组成，即2条相同的重链（H）和2条相同的轻链（L）以及几对二硫键连接成四肽结构，构成Ig一个基本单位，称为单体。

免疫球蛋白重链恒定区，按重链抗原性将免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE5类。

Ig轻链分为κ型或λ型，一个天然Ig分子的俩条轻链型相同，每类Ig中都有κ型或λ型。

IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，是再次免疫应答的主要抗体，也是唯一能通过胎盘的抗体。

IgA分为血清型及分泌型。

分泌型IgA（sIgA）为二聚体，每一sIgA分子含有一个J链和一个分泌片。

主要存在胃肠道、支气管分泌液、初乳、唾液、泪液中，局部浓度高，是参与黏膜局部免疫的主要抗体。

IgM为五聚体，主要存在于血液中，是Ig中分子量最大的。

分子结构呈环形，是个体发育最早合成的抗体，也是抗原刺激后体液免疫应答中最先产生的抗体，感染过程中血清IgM水平升高，说明近期感染；新生儿脐带中若IgM升高，提示有宫内感染

IgE为单体结构，正常人血清中IgE水平在五类Ig中最低，仅为（0.1-0.9）mg/L。

IgE为亲细胞抗体，介导Ⅰ型超敏反应，在特异性过敏反应和寄生虫早期感染患者血清中可升高。

IgD血清中含量低作用不清楚，但B细胞膜上的IgD可作为B细胞分化成熟的标志

（二）补体系统

补体的激活途径主要有三种：

经典途径、替代途径、MBL途径

经典途径：

以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂，补体C1-C9共11种成分全部参与了激活途径

替代途径：

又称旁路途径，有病原微生物等细胞壁成分提供接触面直接激活补体C3，然后完成

（三）验室识别细胞及不同分化阶段细胞或细胞亚群最主要的方法。

抗原抗体反应

抗原抗体反应的原理

一、抗原抗体结合力：

静电引力、范德华引力、氢键结合力、疏水作用力

二、抗原抗体的亲和性于亲和力

三、亲水胶体转化为疏水胶体

抗原抗体反应的特点

一、特异性

二、可逆性

三、比例性：

若抗原或抗体嫉妒过剩则无沉淀形成，称为带现象。

抗体过量时称为前带，抗原过量时称为后带

四、阶段性：

第一阶段为抗原于抗体发生特异性结合的阶段，不出现可见反应。

第二阶段为可见反应阶段，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。

影响抗原抗体反应的因素

一、反应物自身因素：

抗体的浓度、特异性和亲和性都影响抗原抗体，为了提高试验的可靠性，应选择高特异性、高亲和力的抗体作为诊断试剂；抗原的理化性状、分子量、抗原表位的种类及数目均可影响反应结果。

颗粒性抗原出现凝集反应，可溶性抗原出现沉淀反应，单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀

二、环境因素

1、电解质抗原与抗体发生特异性结合后，由亲水胶体变为疏水胶体，此过程需要电解质参加，常用0.85%NaCl或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液

2、酸碱度抗原抗体必须在合适的PH环境下进行，蛋白质具有俩性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。

抗原抗体反应一般在PH6-9之间进行，PH过高或过低都将影响抗原抗体反应

3、温度在一定的范围内温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。

一般以15-40℃为宜，常用抗原抗体反应温度为37℃，温度高于56℃,可能导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或者破坏。

三、免疫学检测技术的类型

标记免疫技术具有具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。

标记免疫技术按实际用途分为定位测定组织或细胞中固定成分的免疫组织化学技术和检测液体标本中抗原或抗体含量的免疫测定

按测定反应体系的物理状态分为均相免疫测定和非均相免疫测定；

按检测现象不同分为放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术、化学发光免疫技术和金免疫技术

免疫原和抗血清的制备

免疫原是指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质

一、颗粒型抗原的制备

颗粒型抗原如各种细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒型抗原

细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下井生理盐水或其他溶液洗净，配置一定浓度即可

细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理

颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂进行皮内注射。

二、半抗原免疫原的制备

半抗原始终物质独立存在时只具有抗原性而无免疫原性，这些物质称为半抗原。

半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才具有免疫原性

（一）载体

1、蛋白质类：

以牛血白蛋白最常用。

蛋白质与半抗原结合基于游离氨基、羧基、酚基、巯基、吲哚基、咪唑基、胍基等活性基团的缩合

2、多肽聚合物：

常用多聚赖氨酸

3、大分子聚合物和某些颗粒：

聚乙烯吡格烷酮、活性炭、羧甲基纤维素等皆常用

（二）半抗原与载体的连接方法

物理方法：

通过电荷和微孔吸附半抗原，吸附的载体有淀粉、聚乙烯吡格烷酮、硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素等

化学方法是利用某些功能基团将半抗原连接到载体上。

（三）半抗原性免疫原的鉴定一般认为至少要有20个以上的半抗原分子连接到一个载体分子上，才能有效的刺激免疫动物产生抗体。

因此在半抗原与载体连接后，应测定半抗原与载体的比例，方法有吸收光谱分析法和放射性核素标记半抗原渗入法

单克隆抗体与基因工程抗体的制备

一、杂交瘤技术

原理：

利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，再HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测，筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得技能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。

将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。

具体包括俩种亲本细胞的选择与制备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与克隆化等

（一）小鼠骨髓瘤细胞：

理想的骨髓瘤细胞应该是①细胞株稳定，易于传代培养②细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子③该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。

目前常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/0细胞株。

（二）免疫脾细胞选与骨髓瘤细胞同源的小鼠，鼠龄再8-12周

（三）细胞融合：

细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。

PEG可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合。

常用PEG分子量1000D，1500D或4000D

（四）杂交瘤细胞的选择性培养：

HAT培养液，只有杂交瘤细胞能存活下来

细胞克隆化一般至少进行3-5次

单克隆抗体的制备

一、单克隆抗体的性质鉴定

（一）Ig类型测定

（二）特异性测定

（三）抗体效价测定

（四）表位测定

（五）亲和力测定

（六）染色体分析

凝集反应

原理：

细菌、红细胞等颗粒抗原或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，他们与相应抗体（抗原）再适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。

凝集反应的特点：

分为俩个阶段①抗原抗体特异性结合②出现可见的颗粒凝聚

直接凝集反应

原理：

细菌、螺旋菌和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。

参加凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。

分为玻片法和试管法

（一）玻片凝集实验用于抗原的定性分析。

一般用来鉴定菌种或分型；也适用于人类ABO血型的测定

（二）试管凝集试验用来协助临床诊断或流行病原调查研究。

例如肥达试验、外斐试验、输血时也常用语受体和供体俩者的交叉配血试验

间接凝集反应

原理：

是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，再适宜电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象

一、间接凝集反应的类型

（一）正向间接凝集反应可溶性抗原致敏载体，用以检测标本中待测抗体的凝集反应，称为正向间接凝集反应

（二）反向间接血凝反应特异性抗体致敏载体，用以检测标本中待测抗原的凝集反应

（三）间接血凝抑制试验先讲可溶性抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）试剂混合，然后再加入抗原（或抗体）致敏的载体颗粒，则能抑制原先的凝集现象，称为正向（或反向）间接凝集抑制试验。

可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原

（四）协同凝集反应载体为金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）。

SPA具有与IgG的Fc端结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体。

如与相应抗原接触，即出现反向间接血凝抑制试验。

协同凝集反应可用与细菌、病毒的直接检测。

间接血凝抑制试验适用于各种抗体和可溶性抗原的检测。

以载体来分，常用的为红细胞、胶乳颗粒及明胶颗粒等

二、间接血凝试验

将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，称为致敏载体，然后与相应的抗体（或抗原）结合，从而使红细胞被动的凝聚在一起，出现可见的红细胞凝集现象

（一）、载体最常用为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞。

致敏的新鲜红细胞保存时间短，易变脆、溶血和污染，只能使用2-3天。

为此可在致敏红细胞之前将红细胞醛化，可长期保存而不溶血。

常用醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。

红细胞经醛化后体积略有增大，俩面突起呈圆盘状。

（二）致敏蛋白质致敏红细胞

（三）血凝试验凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集（-）如红细胞凝集，则分布于孔底周围。

根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱，以++凝集的孔为滴度终点

三、胶乳凝集试验载体为聚苯乙烯胶乳用于检测抗溶血素O

四、明胶凝集试验广泛应用于HIV-1抗体和抗精子抗体等的检测

五、间接凝集反应的应用

（一）抗原的检测反向间接凝集反应应用于检测病原体可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分

（二）抗体的检测可用于检测细菌、病毒和寄生虫感染后产生的抗体

自身红细胞凝集试验

原理：

抗人O型红细胞的单克隆抗体能与任何种血型的红细胞结合，但不引起凝集反应，这种抗体与另一特异性抗体连接成的双功能抗体，可用于检测标本中的抗原；如与特异性抗原连接，则可用于检测标本中的抗体

这一实验与上述血凝实验的区别在于反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞，因此反应中的标本为受检者的全血。

自身红细胞凝集可用于HIV抗体、HBsAg的检测

抗球蛋白试验Coombs试验

是检测抗红细胞不完全抗体的一种很有用的方法，包括直接Coombs试验和间接Coombs试验，分别检测红细胞上不完全抗体和游离在血清中的不完全抗体

沉淀反应

沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体再特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。

一、沉淀反应的特点：

抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质

分俩个阶段：

第一阶段抗原抗体发生特异性结合，肉眼不可见；第二阶段形成可见的免疫复合物

液体内沉淀试验

一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液再电解质的存在下，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法。

常见类型有：

（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度的抗血清反应

（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度的抗原反应

（三）方阵滴定法棋盘滴定法

二、免疫浊度测定

（一）免疫浊度测定的影响因素

1、抗原抗体比例抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这是高剂量钩状效应。

当反应液中抗体过量时，IC分子的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论

2、抗体的质量特异性强、效价高、亲和力强，并使用R型抗体

R型和H型抗体：

根据抗血清来源的动物种类不同，分为R型抗体和H型抗体。

R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。

特点为亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离

H型抗体是指以马尾代表的大型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清，这类抗血清的亲和力若，抗原抗体结合后极易解离

3、抗原抗体反应的溶液最适PH为6.5-8.5，超过此限度不易形成IC，甚至引起IC解离。

在一定范围内，离子强度大，IC形成快；离子的种类也影响IC的形成，一般常用磷酸盐缓冲液作为免疫比浊的反应液

4、增浊剂：

聚乙二醇（PEG），吐温-20，其作用是消除蛋白质周五的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物

（二）免疫比浊方法分类

1、透射免疫比浊法

2、散射免疫比浊法

3、免疫胶乳比浊法