各种细胞的传代.docx

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各种细胞的传代

１.HeＰG2细胞与Ｌ-０2细胞得传代:

ＨePＧ2细胞属人肝肿瘤得恒生细胞株,L－0２细胞则就是人胎肝细胞株,二者所使用得培养基可以就是一样得,即最常见得ＤMEM。

一干使用低糖得。

ﻫ细胞长满培养瓶时既要传代。

使用胰酶消化即可、用D—Hａnk＇s液配制成0。

25%得胰酶。

使用前37度预热,细胞经PＢＳ清洗两遍后,每个中号培养瓶加0、7ml得胰酶,胰酶得量可根据自己培养瓶得大小而定,原则就就是能够盖满瓶底。

加入胰酶以后,为使酶得活性最大,将培养瓶盖拧紧后放回培养箱中,３分钟左右即用含血清得培养基终止消化、如果在室温情况下消化,时间相应加长,可以在显微镜下观察,当细胞界限已十分清楚,即已分离为单个细胞,且有少量细胞漂起,则要终止消化了。

ＨeｐG2细胞株得传代经验:

首先在倒置显微镜下观察生长融合达80％,不需要长满,就准备传代。

倒掉旧得培养基,再用已经高压灭菌过得PBS洗1—2次,我用得就是25平方厘米得培养瓶,加入1毫升已经配制好得0、25％胰蛋白酶－０、０2％ＥDＴA（０.25％胰蛋白酶就是用Ｄ—Ｈanｋｓ配制后先用滤纸过滤,再用一次性过滤器过滤除菌,再分装成1ｍｌ得小包装,刚好每次用完一个,避免每次反复冻存,会使胰酶得活性下降）,加入得量以刚好盖满瓶底为宜。

放到倒置显微镜下观察变化,一旦发现细胞开始变园收缩,大约１—３分钟时间,必要时可以吹打帮助细胞分散,就立即加入培养基中与胰酶,如有EDTA最好要离心（8０0rpm,５min）,弃上清夜,再加入完全培养基吹匀,再分瓶,一般一瓶可以分2－3瓶。

放入5％得CO2培养箱,37度培养24小时后观察。

[/ｉndｅnt]

ﻫ2,１6HBE细胞株得传代方法:

[indeｎt］镜下观察细胞生长融合达70—80％,准备传代。

常规开紫外照射超净台20分钟,同时把含１0％胎牛血清得MEＭ培养基、0。

2５％胰酶、PBＳ放置3７度培养箱中孵育、20分钟后开始传代。

先弃掉旧培养液,加PBS洗一次,然后加0。

25%胰酶2mｌ消化（指25乘2５cm大小得培养瓶）细胞,镜下观察细胞,细胞突起回缩,细胞变圆,然后将培养瓶放置37度二氧化碳培养箱中孵育3分钟左右（当然时间就是随机得,比如:

新配得胰酶作用时间短一些,配制时间长得胰酶作用时间会长一些,当然要不断地镜下观察）,待细胞大部分消化下来（大部分细胞呈流沙状脱离瓶壁）,加４ml含１0％胎牛血清得MEＭ培养基终止消化。

反复吹打瓶壁上残留得细胞,并将已消化下来得细胞吹打均匀,然后吸入离心管中１０00转离心1分钟,然后弃掉上清,用手指将离心管中得细胞弹打均匀,加新培养基,吹打均匀,分至３个新得培养瓶中,补足培养液。

将培养瓶平放,小心移入37度二氧化碳培养箱中培养过夜。

次日观察。

[/ｉｎdｅnｔ］ﻫ３,胃癌细胞ＡGS与SＧC—7９０1得培养:

细胞传代时不能长得太满,70％-80%就可以传了、实验前先把紫外灯打开照3０分钟,然后再把鼓风机开10分钟,同时把培养液与［indent］胰酶放入３7度水浴箱中,千万记住不要盖上水浴箱得盖子.传代时,我一般把培养瓶口过一下火,就直接把培养液到去,再用０。

２５％得胰酶（不含ＥＤＴＡ）消化。

等细胞变圆,细胞间空隙加大就直接把培养液到去,不用离心,然后再吹打,虽说要轻柔,但很难吹打成单细胞悬液,所以稍用力也没有关系。

虽然操作不规范,但节省时间,细胞也没有被污染.［/inｄent]ﻫ4,ＡAＶ-29３细胞得传代:

［indent]AAV-293细胞较喜欢成团生长,比较娇嫩,怕冷,传代时不要一次从二氧化碳培养箱拿出很多瓶,一次只要拿2—３瓶出来传就可以了,否则细胞很容易死掉、细胞在50—60％传代,细胞生长状态最好。

ﻫ用D—Hａｎk’s液配制成0、25％得胰酶消化半分钟左右,弃去胰酶、观察培养瓶就是否有针孔样缝隙,如有就可以加入培养液吹打细胞、消化过久,对细胞损害很大,而且成团很难吹打成单个细胞。

然后加入含有１0％小牛血清得DMEＭ。

轻轻放入二氧化碳培养箱中培养.[／ｉndｅnt］

5,肺癌细胞（人类）

[indent]其中绝大部分都就是贴壁细胞,具体如:

ﻫ（１）　A5４9（肺腺癌）（２）　ＮCＩH４４６（小肺细胞癌）（３）８０1（非小肺细胞癌）（４）NCIH4６0　（大细胞肺癌）ﻫ在消化传代过程中,步骤基本一致:

吸去旧得培养液－>用Ｈａｎｋs＇（1Ｘ）清洗一两次—＞加入一定量得消化液（Tｒｐsｉn—EDＴＡ）－〉置显微镜下观察,待细胞大部分变圆时,回到超静台—〉吸去消化液－＞加入一定量得新培养液—>反复吹打细胞－＞再置显微镜下观察,直到细胞全部悬浮起来－＞吸出一部分加入新得培养瓶中—>最后再补充加入一定量新得培养液（RPMＩ１６４0ｗith１０％　FBS）.ﻫ注意:

　吹细胞时尽量多吹边角儿,此处细胞生长得多。

另外吸出细胞前要混匀.

另注:

消化液得配制方法:

Trpsiｎ－EDTA（1Ｘ）－－０、25％　ＴｒpｓinwｉthＥDTA-４Na

pｒｅpaｒedwitｈ2。

5ｇＴrｐsin（1:

250）anｄ　0、38g　EDTA—4Na/Lｉn　HBSS、［/indent]ﻫﻫ来源:

基因酷

ﻫ［ 本帖最后由wｉsｔaｒ于20０7-9—26　１4:

３0编辑 ]

eｌｍer发表于2007-9—２609:

2０

6,　小鼠前脂肪细胞（3Ｔ3－L１）ﻫ［indent］吸弃原培养液—-＞ＰBS洗一两次——>加入4０0uｌ0、125％胰酶（原代最好加0.05%EＤTA）消化－->转动培养盘,保证整个盘面都被trｙpsin液润过—〉吸弃ｔrypsin后37度消化3min—-＞以完全培液（ＤMＥM+10％ＦＣS＋1/1000Ｂiｏｔin+1/10０0泛酸钙—－＞吸打（枪得吸力调至最小）,1:

10接种,前后左右摇晃培养盘,细胞均匀后放入培养箱继续培养（10%ＣO2,37度）［/ｉnｄeｎt]

ﻫ7,　MDBK（牛肾细胞）ﻫ［indeｎｔ]类型:

贴壁细胞

来源:

购自武汉病毒所细胞保存中心

由四川农业大学动物生物技术中心繁殖保存

传代步骤:

ﻫ弃去旧得生长液—-〉用无钙镁水（CMF）冲洗贴壁细胞数次（视细胞瓶得大小,3—-５次）－—〉剩少许CMF,滴入ＡTV２——3滴-—〉摇匀细胞瓶中得液体,使ATV均匀得分布到瓶里得没个地方—－>放入37度二氧化碳温箱中3-—5ｍin消化——〉弃去ATＶ,加入生长液,拍打吸吹下细胞——〉镜下观察—-＞分瓶—－>作好记号,放入37度二氧化碳温箱生长

细胞特点:

该细胞生长力强,而且快速一般24h就可以张到８0%,４8h不传就会变得很老,所以该细胞传时要勤点;我感觉MDBＫ还就是很好传得,比以前我传得ST、Vero细胞等要好传一些,且不那么容易死亡,所以就是我得一个比较好得选择！

该细胞适合接种疱疹病毒（如:

伪狂犬病毒）!

［/iｎｄenｔ］

8,BHK-21

[indent］弃除旧得培养液后-－—用缓冲液冲洗一遍－－——用0、2２％得胰酶消化液消化约两分钟左右可以瞧到细胞像沙子一样脱落—-－-－——赶紧倒掉胰酶加入含10%得牛血清培养液终止消化。

但目前国内能找到得BHK—21细胞大部分都有支原体感染,如果就是好得ＢHＫ—21细胞能做到1比２0得分种率。

ﻫ补充一点关于ＢHＫ—２1得培养,先用少量胰酶冲洗一下,弃去,再用胰酶消化1min左右,效果会好一些［／iｎｄｅnt］

［indenｔ]BHK－21得经验:

吸出培养基,吸得越干净越好,直接加入1ｍl胰酶（T-25瓶）,放到３７度培养箱消化。

就是否需要用ｈaｎks或pbｓ之类得缓冲洗细胞并不绝对必要,我都没有洗,感觉应该洗一下更好,但也更麻烦并增加了污染得可能性。

如果细胞长得太老,可以先加入1ml胰酶在细胞表面浸润一下就吸出来,然后再加入1ml胰酶消化、胰酶在使用前最好预热到37度。

由于胰酶平时保存在4度,反复预热对胰酶得活性不好,我得经验就是将胰酶进行分装,尽可能避免胰酶反复冷却加热、消化时间得选择要根据实际情况决定,ＢHK－21还就是比较好消化得,5－15ｍin应该足够了,消化时间太长对细胞不利、可以在显微镜下观察消化情况,必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散,消化结束后直接加入培养基即可,胰酶会被血亲灭活、一般在T-2５瓶中留7－8ml培养基培养、在90％单层细胞时,１:

4传代２天后可长满、如果使用得培养基偏碱最好先放在CO２培养箱中平衡。

细胞生长中注意观察培养基颜色（加入酚红作指示剂）,如出现偏黄表明细胞代谢产酸较多,此时如细胞未长满应更换部分或全部培养基以确保细胞状态不受影响、［／inｄent］ﻫﻫ9,皮肤成纤维细胞与THP-1ﻫ［indｅnt]细胞:

皮肤成纤维细胞就是贴壁生长得。

THP—1细胞就是悬浮得。

ﻫ由于我们实验室养细胞得时间也不就是很长,所以也只能说说自己平时得操作了、

先说皮肤成纤维细胞。

当细胞铺满瓶底,也就就是细胞与细胞之间没有间隙时,就可以传代了。

一般十天左右传一代、先吸弃旧培养液,用D-Ｈanｋs液洗两遍,再加入0。

2５％得胰酶,加入得量以能覆盖瓶底为准、加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底,然后静置两分钟左右,最好就是能在显微镜下观察,当细胞之间出现间隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。

吸去胰酶,加入含血清培养液,摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。

因为血清可以终止胰酶得消化。

然后吹打瓶底各处使细胞脱落。

再分瓶补加培养液。

TＨP-1细胞得传代就比较简单了、可以有两种传代方法。

如果镜下观察细胞状态很好,没有其它杂质即细胞裂解物之类得,就可以采用直接传代法、传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。

吸弃上层少量培养液约三分之一,将余下得培养液分成两瓶,再分别补加培养液即可。

如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。

如果细胞数目较多可以低速离心约6０0转离心六分钟,细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类得杂质。

如果觉得细胞数目不多比较宝贵,那就提高转速可以100０转离心六分钟,这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。

离心后去除上清液,加入新得培养液吹打浑匀即可分瓶传代了。

目前得方法就这些,希望对新手有所帮助[／indent］ﻫﻫ[ 本帖最后由wiｓｔar　于2007-９－2613:

5２编辑 ]ﻫelmｅｒ发表于２007-9－26　０9:

２0

10,　几种乳腺癌细胞得培养:

[indeｎｔ］我养得细胞都就是乳腺癌细胞,就就是以下几种,ﻫ1、MCF－7:

就是一种很好养得人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或ＲＰＭＩ１６4０均可,10－15％得小牛血清就能长得很好。

一般两到三天传一代。

传代也很常规、吸出培养基,加入0.25％得胰酶１ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余得培养基。

再加入2ml胰酶（２５ml培养瓶）静置消化２－5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基３ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。

我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清得作用,感觉效果还不错。

因为ＭCF—7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过、需要注意得就是ＭＣF－7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。

ﻫﻫ2、T47D:

也就是一种人乳腺癌细胞,培养基用DＭEM+10-15％得小牛血清,培养方法与MCＦ－７差不多,但这种细胞传代时间长了会极难养。

我曾养过一株新从美国购置得,两三天传一代,长得很旺、后又从国内购买一株时间较长得,要七天传一代,而且很娇气、

ﻫ3、MA８9１鼠乳腺癌细胞:

这种细胞比较特殊得就是很难消化,容易消化成一团一团得,如果胰酶得量比常用得多三分之一充分预热并放入培养箱中消化就会好得多。

传到15—２0代细胞就易长成团,从此生长缓慢,形态改变,需要复苏重养。

［/inｄent］ﻫﻫ1１,95-D细胞得传代

［indｅnt］首先要把０.2５%得胰酶与培养液在37度水浴2０~３0分钟（预热）、从培养箱中拿出培养得细胞瓶（一般我就是让它长到90%几再传代得）,吸去培养液,可用PBＳ洗两遍。

也可不洗、加入适量0、2５％胰酶消化（试瓶子得大小而定,如250毫升得瓶子加1毫升就行了）,让它都浸湿细胞就可以吸去了、等个三十秒就在手上拍打,不要太用劲、就可以瞧到细胞脱落了,再加入3毫升左右得培养液吹打（这时加得培养液不要太多,否则难吹打成单个细胞!

）,制成细胞悬液,再传至消毒得培养瓶中（我一般就是1传三,三天后又可以传代了）再加入适量培养液（如25０毫升瓶中加入１2~14毫升）、再放置在37度5％CO2培养箱中培养.

在操作过程中要有酒精灯得,瓶口,镊子等可在火上过一下.其她得地方可用75%得酒精消毒、无菌观念要强!

[/iｎdent]ﻫ

12,　胃癌细胞MKN2８与AGS:

ﻫ［indent］80％—9０％ｃonfｌｕency,吸弃原培养液——〉ＰBＳ洗一次--＞加入400ｕl０。

１２5%胰酶（1０cｍ）-－>转动培养盘,保证整个盘面都被tryｐsin液润过-〉37度消化5－1０ｍin—－＞以完全培液（RＰMI16４0＋10％ＦＢS－—>吸打,1:

5接种,前后左右摇晃培养盘,细胞均匀后放入培养箱培养（5％CＯ２,３７度,24h一个周期［／indｅｎt]

ﻫ１３,　L９29细胞:

[indent]就是一种贴壁细胞,贴壁后繁殖迅速,约3—4天传代。

切记:

不要等到细胞贴得太满,约70—８0%即可传代（细胞传代时不能长得太满,70％-8０%就可以传了BSZLY２0０3）。

否则细胞容易聚团,再想将其打散很不容易,并且打散后细胞得状态也不好了。

我用得消化液就是EDＴA,新配得感觉特好用,胰酶也用过,但不如ＥDＴA好用。

以下传代方法同楼上各位朋友。

另外还有一点建议:

细胞传代之前用75％酒精棉球擦一擦手。

细胞培养瓶打开前也要擦一下,可以降低污染得几率。

［/ｉndent]

1４,SP　２/0:

ﻫ[indeｎt］就是小鼠骨髓瘤细胞株,贴壁生长,科室给学生开实验就用此细胞,所用培养基为164０,用小牛血清,浓度15%生长较好。

培养孵箱为37度,5％得CO2。

开始将复苏得细胞传到小培养瓶（如2５ml）,由于细胞分泌各种因子及细胞间得相互作用,因此生长较快,1－2天就可进行传代（当然要达到８0－90%得融合）。

消化采用0.25%得胰酶,在显微镜下观察,瞧细胞形态变圆,而且细胞间界限明显后,或有极少数细胞漂浮起来就可终止消化、

吹打时,动作要轻、快,而且吹管中要吸满液体,这样就不会产生气泡,吹打按一定得顺序进行,将瓶子彻底吹打,尤其就是边缘与角落。

ﻫ传代,先将此瓶细胞只传到一个大瓶中,以保证细胞得数量,小瓶也可保留,继续培养。

这样3－４天又可进行传代。

［/indent]ﻫﻫ15,mcf—7细胞株:

［inｄent]本人得细胞株购自武汉中国典藏物培养中心（美国ＡＴCC株亚型）,培养基就是MEM,10%得小牛血清（购自杭州四季青公司）、传代要瞧细胞数得多少,一般来说１0％得细胞,要5天左右,如果90％融合得细胞一传2,3天子代细胞即可传代。

传代:

偶用得就是２5ｍｌ培养瓶,吸出培养基,6mｌpbs冲洗３次,加入0。

２5％得胰酶２-3ml,胰酶均匀盖满瓶壁,消化2—5min左右（可以同时振摇）,细胞缩起变圆,浮起,加入培养基２－3ml,不用太精确,吹打成单细胞悬液分瓶即可。

室温下消化即可,因为就是成纤维细胞,较为耐受胰酶,消化时间稍长亦可,要注意mcｆ—7细胞就是一种肿瘤细胞,生长规律性差,很容易不均匀,要注意吹打得充分性［/indeｎｔ]ﻫﻫ16,HSC－T6（大鼠肝星状细胞系）:

［inｄｅｎt]弃培液——>以Ｄ—Hanks'液洗两次——>0。

05%胰酶消化——>镜下观察细胞变圆（约5分钟）－->以完全培液（ＤMEＭ＋１０％FCS）终止反应—->吹打,1:

３　-　1:

４接种,然后继续培养、

该细胞系生长速度很快,所以采用１:

3－　1:

4接种,而且换液间隔不要超过4８h,否则细胞容易脱落下来、[/ｉndent］

ﻫ17,血液病细胞、ﻫ[inｄｅnｔ]如Ｍolt—４,Hl-60等:

这些细胞得特点就是悬浮生长,传代方便,而且适应能力强--————好养!

当细胞生长到约2-8×1０（6）后,即可认为进入对数生长期,此时传代好,一般控制在2－５×10（６）之间最好,此时状态最好。

[/ｉｎdent］ﻫ

[ 本帖最后由wisｔar　于20０７—9—26１3:

５7编辑 ]

ｅｌmer发表于2０07－9-２60９:

2１

18,Moｌｔ－４:

［indent］直接在细胞悬液中加入一定比例得培养基。

比例就是根据您得实验时间安排而定,此细胞一般24小时左右可以增长一倍数量,因此,如果现在得浓度为4,您明天要实验,则可1:

１传,-———２×10（6）。

明天同一时间大概就就是4左右。

［/indent］

19,hｌ－６０细胞:

[indent]生长迅速,必须每天观察,因此如果明天您要4×10（6）,今天为４,就必须以1:

2~３得传。

否则明天就已经因浓度太大而不易实验。

因就是悬浮细胞,所以观察时以大小,圆不圆,颗粒多少,成团情况,培养基颜色来观察［/indｅnｔ］ﻫﻫ2０,ｖｅro（非洲绿猴肾ｃｅll）:

［indenｔ］贴壁细胞,以25ml小方瓶为例,培养液用得就是MＥM。

ﻫMEM得配制:

１0％小牛血清,1％双抗,3％谷氨酰胺,1～1。

5％NaHＣO3、

传代方法:

1.倒掉培养液,如果细胞脏得话可用ＰBS洗两次,否则不用。

ﻫ2.胰酶0、25％2ml消化1~3分钟,容易消化。

３、倒掉胰酶,加MＥＭ9~１2ｍl,将贴壁细胞摇至悬浮,并用吸管吹匀,一传三或一传四。

ﻫ4.放置３7度,5%CＯ2孵箱［/indent]ﻫﻫ21,　Jｕrkａｔ细胞（人外周血白血病T细胞）:

ﻫ［inｄenｔ]就是一种悬浮细胞:

ﻫ1、培养液:

ＲPMI1640,15％小牛血清,2％Ｎａ2CO3,1％HEＰES,青霉素1００IＵ/1mｌ,庆大霉素1００IU/ｍｌ;ﻫ２、培养条件:

5％CO2,３7度,30%湿度;ﻫ3、细胞复苏:

要快速将冻存管放入37度水中,不断轻轻摇晃,直到细胞完全溶解,加入10ml左右得培养液,800～1000rpm,1０分钟离心,之后倒掉液体,加入新得培养基就可以进行培养了;

4、细胞培养:

起初进行传代时由于细胞刚刚复苏,长得比较慢,所以可以3~4天传一代,传过两代后,一般2~３天传一代,每次传代后在倒置显微镜下观察细胞形态,在传过几代合适得时候可以进行实验。

ﻫ5、细胞冻存:

100０rpm离心后,弃去液体,加入含有15%ＤMSO得冻存液,按下列顺序降温:

室温→4℃（2０分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－80℃１小时）→液氮、ﻫ６、我在做细胞培养时得一些小经验:

（1）细胞培养箱在每使用１个月最好用酒精擦洗一次,这样可以减少污染;

（２）虽然说加样器放在紫外下照射会不准,但我们还就是丢了一把１ml得加样器在超净台,没有拿出来过,我想这样也许会减少污染;ﻫ（3）小牛血清我们用得就是国产得,所以在一开始得时候加了15%得小牛血清,但细胞总就是长不好,后来摸索条件,把小牛血清得量调到了2０％,细胞生长旺盛;

（4）HEPES虽然贵点,但加上去后细胞会长得不错;

（5）在超净台操作前要用0.1%得新洁尔灭或7５%酒精擦手［/indent]ﻫ

22,MCF-7细胞:

ﻫ［indeｎt]细胞放在显微镜下观察,细胞无污染、退缩,等其长满培养瓶约70%—80%时即可进行传代操作,具体步骤如下:

１、打开瓶盖,弃上清,2、Ｄ-ＨANＫ‘S夜（以５0mｌ培养瓶为例,下同）2吸管清洗后弃之;３.加0。

25%胰酶2吸管;4。

轻摇晃后置入3７度温箱;5、3-5分钟后置显微镜下观察,见细胞胞质退缩,变圆;６、吸去胰酶,加含10%FＣS得RPMI1６40　3吸管;７.用洗管吹打,见细胞脱落,培养液变混,即可吸出加到新得培养瓶中。

注意事项:

若胰酶消化超过时间,见细胞已漂浮,切不可直接倒去上清,可直接加等量得含１0%FCS得ＲPＭI16４0,吹打后加到离心管中离心5分钟,再弃上清,加入培养基进行传代。

[/ｉnｄｅｎt］ﻫﻫ23,BALB／ｃ－3Ｔ3:

ﻫ[inｄent］小鼠成纤维细胞。

消化过程:

倒掉培养基——向培养瓶中加入少量37度预热得0、25%胰酶,转动培养瓶使胰酶浸过瓶底,倒掉胰酶-—再向瓶中加入胰酶,加入量以能覆盖细胞为宜,1分钟后倒掉胰酶——将培养瓶置于３7度孵箱中——显微镜下观察,细胞开始变形时以含１0％小牛血清得ＤMEM中止消化——吹打成单细胞悬液,1:

2～１:

３接种,继续培养。

SＫOV3细胞传代方法:

ﻫ自CO2培养箱取出培养瓶－＞超净工作台中,以吸管轻轻吹打有细胞得瓶壁,去除生长不好得细胞－－〉弃去培养液－—＞加0。

０4％&＜46;　ＥＤTＡ数滴（用0、０2%得EＤTA不易消化掉）　,浸过细胞-—〉置３7℃培养箱1０min&〈46;左右－->取出,倒置显微镜下观察,细胞变圆回缩,但又未自瓶壁脱落——＆<46;>超净工作台中弃去ＥDTA->加入含１0％新生牛血清得RPＭI16４0培养基——&<46;>吸管吹打后,1:

２或1:

3接种。

＆<4６;［/iｎdent］ﻫ

24,2９３细胞得传代:

ﻫ[ｉndent］通常我就是不用ＥＤＴＡ得只用0。

25％得胰酶消化一般在细胞约８0%汇合时传代加入一毫升得胰酶后可以不用吸出胰酶（前提就是用10%以上浓度得血清DＭEＭ培养液）加上胰酶直接拍打至细胞脱落加入少许培养液中与后分瓶然后补加培养液５%ＣＯ2孵箱37度培养效果不错。

［／iｎｄｅnt］ﻫ

［iｎdent］293贴壁很不牢,可以不加消化液直接吹打下来,但这样下来得细胞容易聚成团,传代后形态不大好瞧。

可以先倒掉培养液,以D—HANＫ‘S液轻轻冲洗,再加0.6ｍl0。

25%胰酶／０。

0１%EDＴA,轻轻润湿细胞后即可弃去,置于镜下观察,很快即可见细胞变圆,加入适量完全培养基终止,轻轻吹打即可、这样细胞既不会消化过头,又极尽吹散、[／indeｎt］ﻫﻫ24－2,　29３Tﻫ［iｎdenｔ］贴壁细胞:

在消化传代过程中,步骤如下:

用滴管吸尽旧得培养液—>用培养基洗一次—＞加入一定量得胰酶（已预热）－>显微镜下观察,待细胞大部分变圆时,回到超静台—＞用滴管吸尽酶液－>加入一定量得含血清得新培养液->反复吹打细胞->再置显微镜下观察,直到细胞全部悬浮起来-＞吸出一部分加入新得培养瓶中-＞最后再补充加入一定量新得培养液,放入培养箱。

ﻫ可用含有血清得DＭEM,也可以用含有血清得16４0。

[／inｄｅｎt]ﻫ

25,HK２得传代（人肾近曲小管上皮细胞）:

ﻫ［ｉnｄｅnt］以５0ml培养瓶为例ﻫ1、细胞贴壁生长,长满瓶底80%时,胶头滴管移去培养液,可轻轻吹打,移液时不留培养液残余ﻫ2、加0.25％胰酶1ml消化37℃约２min,镜下可见细胞基本圆形脱落,加含血清培养液2ｍｌ中止消化,反复混悬

3、移入离心管,１2００g,5miｎ

４、弃去上清,加入新培养液５ml,再次吹打混悬细胞,按需要分入新得培养瓶,镜下可见散在分布圆形细胞ﻫ5、入３7℃5％CO２孵箱,半天即可再贴壁。

[/inｄenｔ］

26,ｃaco—2（人结肠癌上皮细胞）:

ﻫ[inｄent]将Caｃo-2细胞培养于高葡萄糖（得ＤMEM培养基中（1％非必需氨基酸,　Ｌ—谷氨酰胺（L-glｕtaｍｉｎe）,培养液含青霉素（penｉｃｉllin）１０,００0U/ｍl－链霉素（strｅptomyｃin）10,000ug/ml,　10％胎牛血清（Feｔaｌbovｉnｅseｒum,ＦBS））,长于T-７5组织培养曲颈瓶中,通入５%CＯ2（相对湿度９0%）,置37℃培养箱中培养。

培养介质2~３天更换一次,当细胞达到9０％融合后,以不含钙,镁离子得磷酸盐缓冲液（PＢＳ）清洗后与胰酶（0、２5%）-EDTA（1ｍM）于3７℃一起孵育至分离（约5～１0分钟）。

吹打细胞使之脱落,置离心