植物组织培养复习资料.docx

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植物组织培养复习资料

一、名词解释

1.植物组织培养：

植物组织培养是指在无菌条件下将离体的植物器官（根、茎、叶、花、果实等）、组织（形成层、花药组织、胚乳、皮层等）细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体进行培养使其再生细胞或完整植株的技术。

2.外植体：

植物组织培养中，使用的各种器官、组织和细胞统称为外植体。

3.愈伤组织：

是指外植体因受伤或在离体培养时，其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。

4.异质性：

是指性质上的多样性或缺乏一致性的不同成分的组合。

异质性是生物在自然界中的共同特征之一，也是生物在自然界中存活的重要保证，异质性是达尔文进化论及物种多样性的基础。

5.褐变：

是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色的物质，以致培养基逐渐渐变成褐色，外植体也随着进一步变褐而死亡的现象。

6.玻璃化现象：

一种生理性病害，是植株在离体培养过程中出现的异常现象，包括茎叶半透明、海绿色、水浸状或玻璃化等现象。

7.胚培养：

是指对胚、子房、胚珠、胚乳进行离体培养，发育成完整植株的技术。

8.体外受精：

是指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，称为体外受精。

9.种质资源的离体保存：

指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。

二、简单、综述题

1.植物组织培养的主要特点

①整个过程都是在无菌条件下进行的②在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进行的，因此，在组织培养中的植物材料不需依靠自身的光合作用制造养分，而是处于完全的异养状态。

③起始材料可以是植物的器官、组织，也可以是单个的细胞，它们都处于离体状态下。

④组织培养物通过连续继代培养可以不断增殖，形成克隆。

⑤是在封闭的容器中进行的，容器内气体和环境气体可以通过瓶塞或其他封口材料进行交换。

⑥环境温度、光照强度和时间等都是人为设定的。

2.培养基配制

（1）如何配置培养基？

①取出培养基，按1、2、3······顺序从左到右排放好。

②取一个容器放在台面上，称取琼脂、蔗糖倒进容器。

③取1/3蒸馏水放入容器，按顺序分别放入母液1、2、3······。

④初步定容⑤将容器放入微波炉，让琼脂彻底溶解，再一次定容。

⑥调解PH值（NaOH或盐酸）至中性，分装培养基，封口。

⑦灭菌（121℃、15～20min）⑧灭菌后待温度降到40℃左右以下时，取出，加生长调节剂。

（2）如何配出母液？

通常母液的浓度需要是培养基浓度的若干倍（10倍、100倍或更高），配制母液时需用蒸馏水。

①确定培养基②按照扩大倍数分别称量各元素表中的各化合物③分别充分溶解（溶解时溶剂不能太少也不能太多，太少会导致溶液浓度太大，易产生沉淀，太多可能会会超过定容刻度线，导致溶液浓度不准确。

）④按一定顺序分别倒入容量瓶混合⑤定容⑥母液分装（大量元素、钙盐、微量元素、铁盐、有机元素）⑦贴标签，保存于冰箱中（2～4℃）

3.商业化生产中应注意的问题及控制措施？

（1）遗传稳定性问题

提高稳定性、减少变异发生的措施：

①减少继代次数，缩短继代时间②定期检查，剔除形态异常和生理异常苗③使用生长点和胚状体方式扩大繁殖④减少培养基中诱变因素和一些化学物质⑤尽量促进再生植株开花结实，以检查其生物学性状和经济性状是否稳定

（2）玻璃化问题

解决玻璃化现象的措施：

①增加琼脂浓度，减少水分吸收②增加蔗糖含量及加入渗透剂，降低培养基水势

③减少培养基中的N含量④增强容器通风，降低瓶内湿度及乙烯含量⑤增强光照，适当降低培养室内温度⑥加入适量ABA

4.降低成本提高效率的措施？

①提高劳动生产率、节约工资②减少设备投资、延长使用寿命③降低器皿消耗、采用代用品④节省水电开支A尽量利用自然资源B充分利用培养室空间C减少水的消耗节省电能⑤降低污染率、减少次品、杜绝废品⑥提高繁殖系数和移栽成活率⑦简化培养基⑧发展多种经营、开展横向协作

5.如何控制污染？

①接种室的消毒：

要用拖布清扫地面，酒精消毒操作台，用紫外线消毒15min，切断电源后5min方可进入工作室内；

②无菌操作要求：

工作试验人员要用肥皂洗手，并用干抹布擦干净，若手上有水分则用酒精清洗，使其水分挥发；

③材料的切割、分离、接种：

材料和实验工具在使用前要进行消毒处理，双手避免交替使用，分工明确，材料消毒要先放置在水中浸泡，在用镊子取出放入Hgcl消毒液中。

依次进行，一般放置位置与母液放置位置相反。

接种时要求接种瓶倾斜45度。

封盖。

6.商业型实验室设计：

①②③④⑤⑥⑦⑨

植物组织培养实验室通常包括：

准备室、无菌操作室、培养室、温室。

配有无菌操作设备、培养设备、药品储存、配制仪器设备、察分析仪器设备、其它仪器设备等。

消毒室

预备室

洗涤室

培养室

走廊

化学实验室

灭菌室

接种室

7.试管苗移栽后死亡的原因？

（1）根系结构：

根系结构不完善的试管苗移栽后，易造成死亡。

①不生根②根与疏导系统不连接③根无根毛或根少④根无吸收功能或极低。

（2）叶表组织：

叶表组织不发达或结构不正常的试管苗，移栽后易造成死亡。

①叶表角质层和蜡质层不发达或无②叶无标皮毛或极少③叶解剖结构稀疏④气孔开口大，不关闭⑤叶片存在排水孔⑥光合作用能力极地。

8.如何防止污染？

①植物材料的选择及防止污染

②人为污染的防止

9.细胞融合的原理。

细胞膜表面有稳定的疏水性基因，具有膜电位，因其静电排斥力使原生质体不能吸附在一起。

（1）化学法融合原理：

带有阴离子的PEG分子等与原生质体表面的阴离子之间在Ca2+连接下形成共同的静电键，从而促进了原生质体间的黏着和结合。

在高Ca2+—高pH液的处理下，Ca2+和与质膜结合的PEG分子被洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使原生质体的某些阳电荷与另一些原生质体的阴电荷连接起来，吸附聚合，最后融合在一起。

（2）物理法融合原理：

对融合槽的两个平行电极施加高频交流电压，产生电泳效应，使融合槽内的原生质体偶极化并沿着电场的方向排列成串珠状，再施加瞬间的高压直流脉冲，使黏合相邻的原生质体膜局部发生可逆性瞬间穿孔，然后，原生质体膜连接、闭合、最终融为一体。

10.细胞融合的方法。

（1）融合类型细胞融合类型可分为对称融合、不对称融合和微原生质体融合。

（2）融合方法细胞融合方法主要分为化学融合法和物理融合法。

化学融合法是指以化学试剂作为融合诱导剂，诱导原生质体融合的方法，主要有PEG融合法和高钙—高pH法等。

物理融合法是指用电激、离心、振动等机械方法来促使原生质体融合的方法，主要有电融合法和超声波法等。

目前最常用的方法是PEG法、PEG结合高Ca2+—高pH法以及电融合法。

（3）融合产物的类型融合产物包括异源融合的异核体，含有双亲不同比例的多核体，同源融合的同核体，不同胞质来源的异胞质体。

11.细胞融合融合体的选择。

1）杂种细胞的选择

⑴互补筛选法：

该方法是利用双亲细胞在生理或遗传特性方面所产生的互补作用来进行选择的。

在选择性培养基上只有具互补作用的杂种细胞才能生长发育，非杂种细胞没有互补不能生长发育。

根据互补类型的不同，又分为五种：

①激素自养型互补（生长互补）选择②白化互补选择③营养缺陷型互补选择④抗性突变体互补选择⑤基因互补选择

⑵机械筛选法（分三种）：

①天然颜色标记分离②荧光素标记分离③荧光活性自动细胞分类器分类融合体2）杂种植株的选择

1态学鉴定⑵细胞学鉴定⑶生物化学鉴定⑷分子生物学鉴定

12.植物种质资源离体保存的方法。

（1）限制生长保存

利用限制离体培养物的生长速度来保存种质的方法，是离体种质保存的一种常用策略。

限制离体培养物生长速度的方法很多，如低温、提高渗透压、加生长延缓剂（或抑制剂）、干燥、降低氧分压、矿物油覆盖等。

①低温保存法②高渗透压保存法③生长抑制剂（或延缓剂）保存法④降低氧分压保存法⑤干燥保存法

（20超低温保存种质

植物超低温种质保存是指将植物的离体材料包括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温（-196℃液氮）条件下进行保存的方法。

超低温保存有一套比较复杂的技术程序，基本程序包括：

植物材料（培养物）的选取、材料的预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻、再培养等。

13.花粉的分离及纯化方法。

（1）花粉的分离：

将小孢子从花药里游离出来的主要方法有自然散落法、挤压法和机械游离法。

①自然散落法：

将合适的花蕾消毒后，无菌条件下取出花药，接种在预处理液或培养基上。

一段时间后，有些花粉囊会自动裂开，里面的小孢子从裂口处散落到培养基中，收集这些脱落下来的小孢子，用新鲜培养基制成一定密度后进行培养。

②挤压法挤压法分为两种：

A、挤压法：

消毒处理过的花药置于无菌培养皿或烧杯中，加入少量提取液，用注射器内管或一端压扁的玻璃棒轻压花药，将花粉挤到提取液中，经过联过筛，除去比小孢子大的组织碎片，然后低速离心，使小孢子沉淀，清洗几次后，制成小孢子悬浮液进行培养。

B、研磨过滤收集法：

与挤压法相似，不同之处是把消毒过的花蕾置于无菌的研钵中研磨，挤出小孢子。

③机械游离法机械游离法也分为两种：

A、磁搅拌法：

是将花药接种于盛有培养液或渗透压稳定剂的三角瓶中，放入一根磁棒，置磁力搅拌机上，低速旋转至花药透明。

B、小型搅拌（超速旋切）法：

通过旋转刀具的高速转动带动花蕾、穗子切断或花药高速运动而破碎，从而使小孢子游离出来。

（2）花粉的纯化

采用级联过筛方法：

第一级选用孔径较大的，以便使大杂质去除，最后一级应选用略大于小孢子直径的筛子。

14.花粉培养的方式有哪些？

答：

花粉培养的方式有平板培养、液体培养、双层培养、看护培养、微室培养和条件培养基培养六种。

①平板培养：

花粉置琼脂固化培养基上进行培养，诱导产生胚状体，进而分化成植株。

②液体培养：

花粉悬浮液在液体培养基中进行培养。

由于液体培养基容易造成培养物的通气不良，影响细胞分裂和分化，可将培养物置于摇床上震荡，使其处于良好的通气状态。

③双层培养：

花粉置固体-液体双层培养基上培养。

④看护培养：

配制好花粉粒悬浮液和琼脂固体培养基后，将完整的花药和花药的愈伤组织放在琼脂培养基上，将圆片滤纸放在花药和愈伤组织上，然后将花粉置于滤纸的上方。

⑤微室培养：

将花粉培养在很少的培养基上。

⑥条件培养基培养：

在预先培养过花药的液体培养基中或在加入失活的花药提取物的合成培养基中，接入花粉进行培养。

15.白化苗产生的原因及控制方法。

（1）白化苗产生的原因：

内因：

供体植株的基因型、花药和花粉本身的状态；

外因：

低温预处理、培养基成分、生长激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。

（2）白化苗的控制方法：

①采穗时主要取主径和大分蘖穗，取花粉发育时期处于单核中晚期的幼穗。

②幼穗4℃低温离体预处理24h。

③脱分化培养一般在暗室进行，温度30～32℃时，出愈率较高，但白苗较多。

在29℃条件下培养，效果较为理想。

④脱分化培养基一般用2.0mg/L的2,4-D与0.5mg/L的KT或6-BA配合使用。

⑤诱导愈伤组织分化阶段，把培养基的碳源由11％蔗糖改为9％蔗糖+2％麦芽糖。

⑥前期产生的愈伤组织分化能力较强，后期产生的愈伤组织分化能力降低，白苗率相对较高，所以愈后应该提早进行转分化培养。

16.原生质体的获得、分离、纯化方法。

（1）获得方法

⑴材料来源：

植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料，目前较多采用叶片来分离原生质体，但分裂旺盛的、再分化能力强的愈伤组织或悬浮细胞系，尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系是最理想的原生质体分离材料。

①预处理：

为提高原生质体的产率和活性，常采用两种预处理方法：

A、低温处理。

以叶片等外植体为试材时，一般放在4℃下，黑暗中处理1～2d，其原生质体的产量高，均匀一致，分裂频率高。

B、等渗溶液处理。

把材料放在等渗溶液中数小时，再放到酶液中分离原生质体，能提高其产量和活性，尤其是多酚化合物含量高的植物，如苹果、梨等，采用这种处理方法效果好。

（2）分离方法

植物原生质体分离方法有酶分离法和机械分离法。

酶分离法是目前广泛采用且效果最佳的原生质体分离方法。

①机械分离法

②酶分离法：

无菌播种→加入酶液（果胶酶、纤维素酶）→震荡→过滤→离心→弃上清液→计数

（3）纯化方法

供体组织经过酶处理后，得到的是由未消化组织、破碎细胞以及原生质体组成的混合群体，必须进行纯化，以得到纯净的原生质体。

植物原生质体纯化方法主要有以下三种，即沉降法、漂浮法和不连续梯度离心法。

①沉降法：

低速离心②漂浮法：

加入20%的蔗糖溶液→低速离心③不连续梯度离心法：

在离心管中首先放入不同浓度的Ficoll溶液→构成不同的浓度梯度→加入酶液→低速离心

17.原生质体的培养方法。

答：

原生质体培养方法主要有平板培养法、液体浅层培养法和固—液结合培养法。

另外还有看护培养法和微滴培养法等（其中看护培养法是花粉培养的最常见方式）

（1）平板培养法：

原生质体悬浮液→42～45℃的培养基→等量混匀→倒平皿→封口→暗培养3周→固体培养基中继代培养

（2）液体浅层培养法：

该方法是用液体培养基进行原生质体培养。

（3）固—液结合培养法：

原生质体采用固体平板培养法包埋在培养皿底层→加入相同成分的液体培养基→细胞开始分裂后，用新鲜液体培养基更换原液体培养基→形成大细胞团后，转移平铺到去除渗透压调节剂的固体培养基上培养

18.如何选择外植体培养部位？

（1）、部位的确定：

茎尖、叶、花药和花粉、根、花瓣、鳞茎等；

（2）、取材季节的影响；

（3）、器官的生理状态和发育年龄；

（4）、材料大小的影响:

茎尖分生组织带1～2个叶原基，大小约为0.2～0.3mm；花瓣等为5mm2，茎段为0.5mm。

19.如何准备接种物品？

（1）、接种室的消毒：

用潮湿的拖布拖地→用紫外灯消毒15min→关掉紫外灯5min后才能进入工作室

（2）、无菌操作要求：

人面对工作台，酒精灯放在正对面，右手变放操作所需灭菌工具及镊子，其余工具放在左手边，左右手分工明确，操作时不能交叉。

（3）、材料的分离、切取和接种：

材料一定要大，经过多次消毒及灭菌后会有修剪，以利于实验的成功，防止消毒和灭菌杀灭菌物的同时杀死植物组织细胞，不利于培养成功。

20.材料灭菌

（1）：

常用的消毒剂及使用方法

答：

常用的消毒剂有：

次氯酸钠0.5～10%、酒精70%、双氧水3～10%、漂白粉1～10%、升汞0.1～1%（溶解时选用少量的＜5ml,70%的酒精，且使用过程不能超过30s﹚

（2）:

如何消毒

答：

①、茎尖、茎段及叶片等的消毒：

清水冲洗→酒精70%数秒→升汞（氯化汞）0.1～1%或次氯酸钠0.5～10%浸泡3～15min→无菌水冲洗3～3次。

②、果实及种子的消毒果实:

清水冲洗10～20min→95%酒精数秒→20%次氯酸钠浸泡10min→无菌水冲洗3→5次种子：

10%次氯酸钠浸泡20～30min→无菌水冲洗3→5次

③、花药的消毒：

70%酒精浸泡数秒→无菌水冲洗2～3次→1～10%漂白粉清液→浸泡10min→无菌水冲洗3～5次

④、根及地下部器官的消毒：

清水冲洗、毛刷刷洗，切除多余部分→70%酒精数秒→无菌水冲洗3～5次→0.1～0.2%升汞浸泡5～10min→无菌水冲洗3～5次

21.褐变及其产生原因及其防治

答：

褐变：

是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色的物质，以致培养基逐渐渐变成褐色，外植体也随着进一步变褐而死亡的现象。

产生原因：

①基因型：

酚类物质的含量及多酚氧化酶活性的差异②材料的生理状态③培养基成分④培养基的时间过长

防治：

①选择适当的外植体和培养条件②选择使用抗氧化剂③连续转移

22.如何提高试管苗的成活率？

答：

（1）、微繁殖小植株的生根和炼菌

①促进试管苗根系发生及功能的恢复

方法：

瓶外生根在生根小室进行生根和炼苗，在试管内诱导根原基后在移栽和使用盆插或瓶插生根法。

②、试管内外嫁接：

优点：

提高成活率、加快生长、提早结果、提高长势和进行病毒鉴定。

③、培养瓶生壮苗

（2）、使用杀菌剂、抗蒸腾剂和生长抑制剂等。

23.试管苗生产管理①②③④⑤⑥⑦⑨

①生产对路产品，适时适量满足市场需求②坚持信誉第一，适量第一的概念③做好试管苗生产性能能示范工作④培训人员，储备基础⑤建立良好的管理制度。

27.离体胚培养

①幼体胚培养②成熟胚培养

应用：

克服远缘杂交不亲和性，打破种子休眠，缩短育种周期，提高种子萌发力。

幼体胚培养：

取受精后的植物子房→70%酒精→0.1%的Hgcl（10-30min）→无菌水冲洗→幼胚分离→幼胚培养。

28.PEG融合（p135）

相对分子质量在2000-6000的均可作为融合剂，能改变各类细胞膜结构。

具体操作过程如下：

①器具灭菌②原生质体制备③制备PEG液和稀释清洗液④原生质体融合⑤原生质体培养

29.脱毒的原理

①植物病毒自身不具有主动转移的能力②在旺盛期分裂的细胞中，代谢活性很高，使病毒无法自行复制③在植物体内可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性④在茎尖中存在高水平内源生长素，可抑制病毒正增殖。

30.无毒苗木培育（p178）

31.商业化生产的工艺流程

32.脱毒方法？

（1）物理方法：

通过热处理（即热疗法）可由受侵染的个体得到无毒植株。

（2）化学方法：

（3）生物方法：

（4）综合脱毒法：

①茎尖培养结合热处理脱毒法②茎尖培养结合病毒钝化剂处理脱毒法。

33.脱病毒植株的检测

①直接测定法②指示植物法③血清鉴定法④核酸分析法⑤电镜鉴定法

34为什么细胞分裂素与生长素的比例是控制器官发育的模式？

①生长素和细胞分裂素的比例可以影响植物器官的发育和形成；②生长素/细胞分裂素比例值高时可以促进根的生成发育；③其比例值低时可以促进芽的分化；④其比例低时可以促进一种无结构的形体。

35试管繁殖率及计算

理论繁殖数：

Y=MXn（Y-年繁殖数；M-无菌母株苗数；X-每个培养周期增殖的倍数；n-全年可增殖的中期次数）

注意：

①基本苗数确定②X,n的设定③污染率的折算（5%）④做计划（工人、工时等）

例题：