生物分离工程小炒.docx
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生物分离工程小炒
生物分离工程
生物分离工程的定义和过程
定义
为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程。
过程
目标产物捕获
目标产物初步纯化
萃取、沉淀、吸附等方法
目标产物高度纯化和精制
细胞分离三种手段重力沉降离心沉降过滤
离心沉降
原理离心沉降是在离心力的作用下发生的
单位质量的物质所受到的离心力：
式中：
r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距离；
ω为旋转角速度；
N为离心机的转数，s－1
方法离心分离法区带离心（差速区带离心平衡区带离心）
离心分离设备
离心力（转速）的大小
可分为低速离心机高速离心机超离心机
按用途分析性制备性
按工业应用管式离心机碟片式离心机
实验室用以离心管式转子离心机离心操作为间歇式
水平转子角转子垂直转子区带转子分析转子
悬浮液的预处理
方法
加热：
最简单和最廉价的处理方法。
黏度¯、促凝聚、固体成分体积¯、破坏凝胶结构、增加空隙率
调pH值：
方法简单有效、成本低廉
凝聚：
在凝聚剂（如铝盐、铁盐、石灰和NaCl）作用下，细胞蛋白质等胶体去稳定，并聚集成1mm大小的凝聚块的过程。
机理：
破坏双电层，水解后胶体吸附，氢键结合等
絮凝：
在絮凝剂高分子聚合电解质的作用下，胶体颗粒和聚合电解质交连成网，形成10mm大小的絮凝团过程。
絮凝剂：
如聚丙烯酰胺、聚二烯丙基四胺、环氧化乙烯。
机理：
絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用
惰性助滤剂：
一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质，用于扩大过滤表面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。
使用方法：
预涂层；按一定比率混合。
助滤剂种类：
硅藻土、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质
碳酸钙等。
目的
提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。
由于滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因此在过滤操作前，一般要对滤液进行预处理，改变料液的物理性质（黏度、颗粒、颗粒稳定性等），降低滤饼的阻力，固液分离速度，分离器分离效率。
各种细胞破碎技术的优缺点
机械破碎法化学法物理渗透法
高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞质量浓度可达到200g/L。
团状和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，不宜使用高压匀浆法。
高压匀浆过程伴随温度上升，为保护目标产物的生物活性，需对料液作冷却处理。
珠磨破碎操作的有效能量利用率仅为1％左右，破碎过程产生大量的热能。
因此在设计操作时应充分考虑换热能力问题。
珠磨法适用于绝大多数微生物细胞的破碎，但与高压匀浆法相比，影响破碎率的操作参数较多，操作过程的优化设计较复杂。
喷雾撞击破碎
优点：
1）将细胞冷冻使其成为刚性球体，降低破碎难度
2）细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，破
碎程度均匀，避免细胞反复受力发生过度破碎
3）细胞破碎程度可通过调节载气流速控制，避免
细胞内部结构的破坏，适用于细胞器的回收
超声波破碎
优缺点：
破碎强烈，适用于多数微生物的破碎。
但有效能量利用率极低，操作过程产生大量的热，对冷却的要求苛刻，所以不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。
机械法和化学法的比较
机械破碎法缺点：
A、高能、高温、高噪音、高剪切力，易使产品变性失活；
B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；
C、细胞碎片大小不一，难分离。
化学破碎法缺点：
A、费用高；
B、化学或生化试剂的添加引起新的污染；
C、破碎速度低，效率差，一般只有有限的破碎，常与机械
法连用。
物理渗透法
优点：
条件比较温和，有利于目标产物的高活力释放回收。
缺点：
破碎效率较低、产物释放速度低、处理时间长、不适于大规模细胞破碎，局限于实验室规模的小批量使用。
减少包涵体的策略
降低重组菌的生长温度，减缓蛋白质的表达速度和降低表达量
将目标蛋白质与分子伴侣蛋白、折叠酶和二硫键异构酶共表达，提供有利于蛋白质折叠的辅助因子
使用非代谢性碳源降低代谢速度和蛋白质表达量
将目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表达
包含体的解决方法（一般步骤）
（一）包含体的分离纯化
（二）包含体溶解（可溶性变性、还原蛋白质）
（三）变性蛋白质的复性和重新氧化
（四）蛋白质一般的分离纯化
沉淀
概念
沉淀是物理环境的变化引起溶质溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。
具有浓缩与分离的双重作用。
区别
与结晶联系：
在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化。
区别：
结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出；沉淀为不定形的固体颗粒，构成成分复杂，纯度低。
蛋白质表面特性
蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成。
蛋白质水溶液呈胶体性质
使蛋白质形成稳定的胶体溶液、防止蛋白质凝聚沉淀的因素：
蛋白质分子周围存在与蛋白质分子紧密或疏松结合的水化层
蛋白质分子间的静电排斥作用（双电层）
可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。
蛋白质沉淀常采用恒温条件下添加各种不同试剂的方法
影响盐析的因素
无机盐（种类、浓度）
温度和pH值
1、盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、热沉淀原理和优缺点
盐析沉淀原理
蛋白质溶液的离子强度增大时，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。
盐离子的水化作用使蛋白质表面疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出疏水区域，增大了蛋白质表面疏水区之间的疏水相互作用，容易发生凝集，进而沉淀。
优缺点
盐析广泛应用于各类蛋白质的初步纯化和浓缩。
在某些情况下还可用于蛋白质的高度纯化。
缺点：
利用盐析沉淀得到的目标产物中含盐量较高，一般在盐析沉淀后，需进行脱盐处理，才能进行后续的分离操作（如离子交换色谱）。
等电点沉淀原理
蛋白质在pH值为其等电点的溶液中净电荷为零，蛋白质之间静电排斥力最小，溶解度最低。
利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀的方法称为等电点沉淀。
等电点沉淀的操作条件：
低离子强度；pH约等于pI。
优点：
无需后续的脱盐操作。
缺点：
沉淀操作的pH过低时，容易引起目标蛋白质变性。
有机溶剂沉淀原理
原理：
向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，水的活度降低。
随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而凝聚和沉淀。
优点：
有机溶剂密度较低，易于沉淀分离；
与盐析法相比，沉淀产品不需脱盐处理
缺点：
易引起蛋白质变性，必须在低温下进行
热沉淀
原理：
在较高温度下，热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀。
根据蛋白质间热稳定性的差别进行蛋白质热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。
最常用的盐析盐——硫酸铵：
价格便宜、溶解度大且受温度影响很小、能稳定蛋白质（酶）。
膜分离技术的类型
以推动力分类
以浓度差为推动力：
透析
以电场力为推动力：
电渗析
以静压力差为推动力：
微滤；超滤；反渗透
以蒸气压差为推动力的过程：
渗透气化
以分离应用领域分类
微滤（microfiltration,MF）
超滤（untrafiltration,UF）
反渗透（reverseosmosis,RO）
透析（Dialysis,DS）
电透析（electrodialysis,ED）
亲和过滤（affinityfiltration,AF）
渗透气化（pervaporation,PV）
共同点区别
渗透气化
原理：
疏水膜的一侧通入料液，另一侧抽真空，使膜两侧产生溶质分压差。
在分压差的作用下，料液中的溶质溶于膜内，扩散通过膜，在透过侧发生气化，气化的溶质被膜装置外设置的冷凝器冷凝回收。
疏水性较大的溶质易溶于疏水膜，渗透速度高，在透过一侧得到浓缩。
优点：
溶质发生相变，透过侧溶质以气体状态存在，因此消除了渗透压的作用，可在较低的压力下进行，适于高浓度混合物的分离。
用途：
利用溶质之间膜透过性的差别，特别适用于共沸物和挥发度相差较小的双组分溶液的分离。
不对称膜
膜在厚度上的孔道结构不均匀，由起膜分离作用的表面活性层（0.2-0.5µm）和起支撑作用的惰性层（50-100µm）构成。
超滤膜和反渗透膜多为不对称膜。
超滤膜一般多为指状结构，反渗透膜多为海绵状结构。
微滤膜以对称结构为主
新型无机陶瓷膜多为不对称膜。
流速
传质系数随流速的增大而提高。
因此，流速增大，透过通量也增大。
压力
当Dp较小时，无浓度极化层，Jv与Dp成正比，此时：
当Dp逐渐增大时，有浓差极化，Jv的增长速率减慢，此时：
Dp继续增加时，形成凝胶层，且厚度随压力的增大而增大，所以Jv不再随Dp的增加。
此时的Jv为此流速下的极限值（Jlim），用方程：
lim随料液浓度上升而下降¯，随流速（搅拌速度）上升而上升
浓度极化模型膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高。
这种在膜表面附近浓度高于主体浓度的现象称为浓度极化或浓差极化。
凝胶极化模型：
当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时，溶质会析出，形成凝胶层。
分离含有菌体、细胞和其他固形成分的料液时，也会在膜表面形成凝胶层。
这种现象称为凝胶极化。
青霉素萃取反萃取
青霉素是有机酸，pH值对其分配系数有很大影响。
选择适当的pH，有利于提高青霉素的收率,还可根据共存杂质的性质和分配系数提高萃取的选择性。
1）青霉素萃取：
较低pH下有利于青霉素在有机相中的分配。
2）青霉素反萃取：
pH大于6.0时，青霉素几乎完全分配于水相中。
双水相系统是指某些高分子聚合物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统。
常见的双水相系统？
影响蛋白质分配系数的因素
1）成相聚合物分子量和浓度
2）盐
3）pH值
4）温度
液膜是由水溶液或有机溶剂（油）构成的液体薄膜。
液膜可将与之不能互溶的液体分隔开来，使其中一侧液体中的溶质选择性地透过液膜进入另一侧，实现溶质的分离。
液膜萃取可同时实现萃取和反萃取。
这是液膜萃取法的主要优点之一，对于简化分离过程、提高分离速度、降低设备投资和操作成本是非常有利的。
乳状液膜的膜溶液组成
膜溶剂膜溶剂是构成膜的机体（相当于化学萃取的稀释剂）。
为保持液膜的稳定性，要求溶剂具有一定的黏度，溶剂不溶于膜内相和外相。
如辛烷、煤油。
表面活性剂液膜的主要成分之一，主要用于控制液膜的稳定性。
添加剂主要是液膜萃取中促进溶质跨膜输送的流动载体，为溶质的选择性化学萃取剂。
分离子型和非离子型两大类。
如季铵盐、冠醚。
液膜萃取机理
反萃相化学反应促进迁移
膜相载体输送
反胶团萃取
反胶团的溶解作用
微水池溶解和分离作用：
反胶团内微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。
因此反胶团萃取可用于氨基酸、多肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。
溶解推动力
静电作用
空间相互作用
疏水性相互作用
超临界流体（supercriticalfluid，SCF）对脂肪酸、植物碱、醚类、酮类、甘油酯等具有特殊的溶解作用，可用于这类物质的萃取分离。
利用超临界流体为萃取剂的萃取操作称为超临界流体萃取（SCFextraction）。
超临界流体萃取操作
影响物质在超临界流体中溶解度的主要因素为温度和压力，可通过调节萃取操作的温度和压力优化萃取操作，提高萃取速率和选择性。
超临界流体萃取设备通常由溶质萃取槽和萃取溶质的分离回收槽构成，分别相当于萃取和反萃取。
根据萃取过程中超临界流体的状态变化和溶质的分离回收方式不同，超临界流体萃取操作主要分等温法、等压法和吸附法。
超临界萃取的优点
萃取速度高于液体萃取，特别适合于固态物质的分离提取
操作条件接近常温，能耗低，适于热敏性物质和易氧化物质的分离
传热速率快，温度易于控制
适于非挥发性物质的分离
物理吸附：
基于吸附剂与溶质之间的分子间力。
溶质在吸附剂上吸附与否或吸附量的多少取决于溶质与吸附剂极性的相似性和溶剂的极性。
可通过改变温度、pH值和盐浓度等物理条件脱附。
化学吸附：
吸附剂表面活性点与溶质之间发生化学键合、产生电子转移现象，吸附稳定，不易脱附。
采用破坏化学键合的化学试剂洗脱剂脱附。
应用很少。
离子交换：
所用吸附剂称为离子交换剂，表面键合离子基团或可离子化基团，通过静电引力吸附带有相反电荷的离子，吸附过程发生电荷转移。
一般通过提高离子强度或调节pH值的方法洗脱。
按离子交换剂适用的生物分子大小分类：
小分子类交换剂：
苯乙烯-二乙烯苯型、丙烯酸-二乙烯苯型、酚醛型等，用于无机离子交换和有机酸、氨基酸、抗生素等生物小分子的回收、提取。
高分子类交换剂：
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、纤维素和亲水性聚乙烯等，用于蛋白质分离纯化。
固定床膨胀床的吸附？
色谱法（chromatography）是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。
按应用目的分类
分析性色谱制备性色谱
按固定相及流动相的状态分类
气相色谱液相色谱超临界流体色谱
按固定相的形状分类
柱层析
纸层析
薄层层析
按压力分类
低压色谱分离中压色谱分离高压色谱分离
按流动方式分类
轴向流色谱径向流色谱
按展开方式分类
洗脱展开（洗脱色谱）迎头分析法：
置换展开（置换色谱）
按分离机理分类
凝胶过滤色谱
离子交换色谱
反相色谱
疏水性相互作用色谱
亲和色谱
分配系数：
cs和cm分别为组份在固定相和流动
相中的浓度。
峰高：
色谱峰顶与基线间的垂直距离，以h表示。
死时间tm：
不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间。
物质不被固定相吸附，故其流动速度与流动相的流动速度相近：
保留时间tr：
试样从进样到柱后出现峰极大点时所经历的时间。
可用时间/距离/体积单位表示。
调整保留时间tr’：
死体积Vm：
指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和，当后两项很小而可忽略不计时，Vm可由tm与流动相流速F0计算：
保留体积Vr：
指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。
保留体积与tr的关系如下：
调整保留体积V’r：
某组份Vr扣除Vm后，称该组份的V’r，即：
色谱柱效与流动相的关系？
柱层析的洗脱方法？
凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography，GFC）是利用凝胶过滤介质为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。
GFC操作中溶质的分配系数m只是相对分子质量、分子形状和凝胶结构（孔径分布）的函数，与所用洗脱液的pH值和离子强度等无关。
蛋白质在凝胶介质中的分配系数随相对分子质量的增大而减小。
GFC操作一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开，称为恒洗脱液洗脱。
相对分子质量：
溶质的分配系数在分级范围内随相对分子质量的对数值增大而线性减小；凝胶的分级范围越小，分离度越大。
因此根据混合物中溶质的相对分子质量选择分级范围较小的凝胶过滤介质，对提高分离度或料液处理量非常重要。
排阻极限：
指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
溶胀率：
溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数，SephadexG50的溶胀率为500％土30％。
G后面的数字＝凝胶吸水量×10。
床体积：
1g干燥凝胶溶胀后的体积。
SephadexG50的床体积为9～11mL/g干胶。
凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography，GFC）是利用凝胶过滤介质为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。
GFC操作一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开，称为恒洗脱液洗脱。
应用分离纯化：
GFC可用于相对分子质量从几百到106数量级的物质的分离纯化。
脱盐：
生物大分子溶液的脱盐，以及除去其中的低分子量物质。
相对分子质量的测定：
在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数成正比。
GFC可用于未知物质相对分子质量的测定。
离子交换色谱（ionexchangechromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。
IEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用流动相离子强度线性增大的线性梯度洗脱法或离子强度阶跃增大的逐次洗脱法。
逐次洗脱中，流动相的离子强度阶跃增大，溶质分配系数的降低和移动速度的增大也是阶段式的。
逐次洗脱是介于恒定洗脱和线性梯度洗脱之间的一种洗脱法。
IEC的应用IEC基于离子交换的原理分离纯化生物产物，不仅具有通用性，且选择性远高于GFC，是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要分离纯化手段。
疏水作用色谱（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的一种色谱法。
蛋白质的吸附（进料）需在高浓度盐溶液中进行，洗脱则主要采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱法或逐次洗脱法。
HIC主要用于蛋白质类生物大分子分离纯化，可作为IEC的补充工具。
反相色谱
反向色谱（reversed-phasechromatography,RPC）利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。
因此RPC多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。
RPC主要用于Mw低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。
流通色谱（灌注色谱）指利用含有大穿透孔的介质为固定相的液相色谱法，其分离模式包括前述的各种吸附色谱。
羟基磷灰石色谱
HAP的吸附主要基于钙离子和磷酸根离子的静电引力，即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附晶面，各存在吸附点C和P，分别起阴、阳离子交换作用。
由于HAP晶体表面结构特别，吸附机理特殊，可用于识别DNA及RNA的单链和双链，分离IEC和HIC难于分离的蛋白质体系。
HAP色谱通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线性梯度脱法
利用疏水性色谱分离A和B的混合物时，在某操作条件下两者分离度不理想，试述如何改善条件，提高分离度，说明理由。
有四种方法：
（1）降低盐浓度：
疏水色谱中加入盐有利于蛋白质的吸附，盐浓度越高，吸附容量越大。
（2）加入添加剂（如乙二醇等）：
低浓度的添加剂有利于降低蛋白质与配基之间的疏水作用力 （3）降低盐浓度和添加剂同时使用：
（4）降低洗脱操作温度或降低洗脱液的PH值：
温度升高，疏水作用增强，蛋白质的保留值增加。
无论PH比pI大或小，都会使蛋白质带上电荷，此时如填料的配基不带电荷，蛋白质易于洗脱。
生物亲和作用的概念
生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。
这种识别并结合的能力具有排他性（即生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中一种分子相结合）。
生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用。
利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化
生物亲和作用的本质
具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔”的空间结构关系。
亲和作用的分子（物质）对可以是：
大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。
亲和结合作用，还需存在特殊的相互作用力：
静电作用
氢键
疏水相互作用
配位键
弱共价键
亲和吸附是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。
其固定相是键合亲和配基的亲和吸附介质。
亲和色谱操作与一般的固定床吸附操作相似，分进料、杂质清洗、目标产物洗脱和色谱柱再生4个步骤。
亲和色谱填料的制备过程一般包括：
载体的选择、载体的活化和配基的连接。
特异性洗脱利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。
例如：
Lys和Arg均为t-PA的抑制剂，利用固定化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进行洗脱。
优点：
洗脱条件温和，有利于保护产物的生物活性；由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系或非特异性吸附较严重的物系，有利于提高目标产物的纯度。
非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。
原理：
等电点聚焦利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的pH值下呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离。
在电泳设备中首先调配连续的pH梯度，然后使蛋白质在电场作用下泳动到等于各自等电点的pH值区域，从而形成具有不同等电点的蛋白质区带。
概念：
双向电泳同时利用分子尺寸和等电点这两种性质的差别进行蛋白质等生物大分子的分离，即将普通凝胶电泳和等电点聚焦相结合，使溶质在二维平面上得到分离。
原理：
如图，在凝胶电泳槽的y方向上凝胶具有逐渐增大的浓度分布，x方向上具有pH梯度。
首先在x方向上电泳，使溶质分子以等电点聚焦的形式泳动到其等电点处。
然后将适当pH值的缓冲液渗透到凝胶中，在y方向上加电场使溶质再次泳动。
此时溶质之间的泳动速度受荷电量及相对分子质量的影响，相互之间得到进一步的分离。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成：
上层凝胶浓度较低（2-3％），为大孔径的浓缩胶，凝胶对溶质的泳动无阻滞作用，溶质在此层得到浓缩；下层凝胶浓度较高（5-25％），为小孔径的分离胶，各个组分根据迁移率的差别分离。
当蛋白质的pI小于8-9.5时，一般电极缓冲液采用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。
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