分子生物学基因工程15.docx

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分子生物学基因工程15

基因工程原理

第一章绪论

基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程、微生物工程共同组成了生物工程

第一节名词概念

一、基因（gene）

从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。

二、基因工程（geneticengineering）

在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子（DNA分子重组体），然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。

因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。

基因工程技术的核心是DNA重组技术。

（一）DNA重组（DNArecombination）

不同来源的DNA，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程。

（二）DNA克隆（DNAclone）

在体外对DNA分子进行重组，构建成具有自主复制能力的重组DNA分子，再导入宿主细胞进行大量复制扩增，最终获得大量同一的DNA分子。

亦称分子克隆。

基因工程的基本特点

●分子水平上操作、细胞水平上表达

277次实验诞生的辛运羊（苏格兰科学家利用6岁成年母羊乳腺细胞）

 1998年，美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了3代共50只实验鼠。

复制人？

？

？

2001年，美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎。

2002年12月，法国研究者宣布克隆出第一个女婴，但一直未获得证实。

2003年，5月意大利宣布克隆成功克隆马“普罗梅泰亚”（世界上首次由哺乳动物生下自己的克隆体，即是母女、又是姐妹关系）。

2003年，12月美国德州农业机械大学宣布克隆成功白尾鹿。

2005年，12月韩国克隆狗斯努皮Snuppy（中）。

基因工程具有的重要特征

第一个重要特征：

外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系。

第二个重要特征：

一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品"拷贝"出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。

第二节发展历程

一、基因工程诞生的基础

●理论基础

●——证实DNA是遗传物质

●——DNA双螺旋结构模型及复制机制

●——遗传密码的破译及遗传信息的传递

●技术基础

●——限制性内切酶的发现与应用

●——DNA连接酶的发现与应用

——基因工程载体的研究与应用

二、基因工程的里程碑

●1972年美国斯坦福大学P.Berg将SV40的DNA导入噬菌体载体在大肠杆菌中获表达

●1973年S.Cohen等人将抗四环素、抗新霉素基因的质粒转化大肠杆菌，获得抗四环素、抗新霉素重组菌落，从而揭开基因工程的序幕

3、基因工程大事记

1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因烟草

1986年首次批准转基因烟草进行田间试验

用基因技术培养的西红柿，它成熟后不会很快软化，便于运输和储藏

1994年美国批准耐储藏转基因番茄进入市场

2000年人类培育出的第一只转基因猴——“安迪”。

意味着克隆人已没有技术障碍

1982年首次通过显微注射法培育出世界上第一个转基因小鼠

第三节应用及前景

一、基因工程研究的内容

●基础研究——新技术、新方法的研究；工具酶的开发；基因文库构建等

●载体研究——克隆载体；表达载体

●受体细胞研究——大肠杆菌；酵母、高等植物、动物细胞目的基因及基因组研究

●应用研究——转基因动、植物；生物工程药物等

二、基因工程的意义及目的

●大规模生产生物分子：

酶、抗体、疫苗、细胞因子……。

●改造或新建物种：

转基因动、转基因植物、基因治疗……。

●基因结构、功能分析，获取遗传信息资源

这一技术将跨越生物种属界限、简化生物物种进化程序、缩短生物进化速度、提高人类生活品质。

转基因动物

以DNA重组技术将一外来基因植入动物染色体中的一种技术

乳腺发生器——我国首批28只带有t-PA组织型纤溶酶原激活剂的转基因羊

第三只眼人造眼的未来？

？

转入生长激素基因大鼠

美国密苏里大学通过克隆技术培育出四只含有荧光水母基因的小猪

美科学家研制出世界上第一只转基因蝴蝶

可当宠物出售的转基因荧光鱼

荧光转基因动物

缺乏胆固醇的转基因小鼠

荷兰公司培养出带有人类基因的奶牛

基因奶牛生产的牛奶中，富含人类乳铁传递蛋白

转基因植物

通过基因工程创造的新物种

具有害昆虫抗性的转基因植物

苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis）其所产生晶体蛋白有杀害昆虫的能力。

以基因重组技术将该蛋白基因转入植物的染色体中,使转基因植物具有抗有害昆虫的能力,因此可以減少化学农药的使用。

对照抗虫稻

对照转基因抗棉铃虫品种

基因工程培育抗虫棉

单价抗虫棉：

Bt（苏云金杆菌）杀虫晶体蛋白基因（CryIA）；

双价抗虫棉：

CryIA及CpTI（豇豆胰蛋白酶抑制剂基因），更持久抗虫。

转基因康乃馨、矮牵牛

具病害抗性的转基因植物

将有抗植物病毒（resistanceagainstplantviruses）的基因转入植物中,可使转基因作物获得抗植物病毒的能力。

转基因作物有:

烟草（tobacco），蕃茄（tomatoes）和马玲薯（potatoes）等.

具抗除草剂的转基因植物

将有抗除草剂的基因（Genesforresistancetoherbicides）转入作物以增强其对除草剂（weedkiller）的存活能力.

利用抗草甘膦（glyphosate）E.coli中分离克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草剂转基因植物。

具耐高盐度的转基因植物

科学家已培养出能在盐度高的土地中生长的转基因番茄株（transgenictomatoes），转基因番茄可将过多的盐分排出,因此并沒有多余的盐份（excesssodium）残留在果实中。

其他在市场出售的转基因作物

●油菜仔、木瓜、南瓜、马铃薯、番茄、玉米

利用生物技术培育的观赏花卉蝴蝶兰已经绽开了美丽的花朵

通过转基因技术已育成稻米胚乳中含有胡萝卜素的“黄金稻”（Ye等，Science，2000，287（14））

生产乙醇的大肠杆菌

三、基因工程研究的现状

（一）各国研究状况

（二）应用和成就

（三）我国基因工程制药业发展

2006年种植面积超过400万公顷的作物有：

大豆（5860万hm2，约占全世界转基因作物的57%，均为抗除草剂大豆）、玉米（2520万hm2，约25%）、棉花（1340万hm2，约13%）、油菜（480万hm2，约5%）。

花生、向日葵、亚麻、甘蓝、烟草、马铃薯、番茄、甜菜、南瓜、小麦、亚麻、木瓜、罗马甜瓜、菊苣、匍匐剪股颖和苜蓿等转基因作物已实现商品化。

在细菌中表达人的胰岛素（1982年，是最早应用基因工程生产人的蛋白质）

基因工程应用大肠杆菌生产人类生长激素

已在细菌中生产10多种药品，例如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。

目前，酵母菌、植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞均成功地应用于表达外源蛋白。

2005年我国转基因作物面积330万hm2。

至2006年，我国已受理稻、麦、棉、豆、玉米、油菜、牧草等转基因生物安全评价申请1525项，共批准中间试验456项、环境释放211项、生产性试验181项、安全证书424项。

已获得商业化生产应用安全证书的作物：

耐贮藏番茄、改变花色矮牵牛、抗病毒甜椒、抗虫棉花（占全国>60%）、抗病毒番木瓜等5种已批准商业化种植的转基因植物。

至2008年我国已批准商业化种植的产品有25种，其中1种转基因大豆、8种转基因玉米、1种转基因番茄、7种转基因油菜、2种转基因棉花，以及改变花色矮牵牛、抗病毒甜椒等转基因植物。

●国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006~2020年）中，把生物技术列在今后15年8大前沿技术领域之首。

●我国生物技术发展基本思路：

加强原始创新和源头创新，获得具有自主知识产权的技术和产品，集中攻关，实现跨越发展；市场导向，促进生产。

●关键技术：

生物工程技术、基因操作技术、生物信息技术、现代农业技术

第四节问题和疑惑

基因产品安全吗？

？

？

伦理问题

●是否任何可以做成的事情都应该去做?

●人类是否可以随便改造生物的基因？

●经过生物科技改造的基因,生物或过程是否可享专利权保护?

●基因治疗的伦理问题,治疗或改进?

●是否能用人类胚胎细胞来做实验工具?

●基因信息与人类隐私权?

●复制生命是福？

是祸？

何谓复制人？

以无性生殖方式，人类以自身的一个己分化和具和二十三对染色体的体核细胞，通过电击与一去核卵融合，培育出一个与自身具有相同基因的胚胎所复制出来的人

复制人的伦理争论

1.对生命尊严与制造生命的伦理意义

2.复制技术尚未真正测试和完善化，可能产生的各种畸型生命的风险极高

3.原型人与复制人彼此沒有自我的独特性，在心理上产生不良反应的自我认同问題

4.复制人的家庭伦理定位

复制技术的主要争论点

1.安全顾虑

2.自我认同和个体性

3.复制人的父母对复制人的控制

4.人类的物品化

5.改造人类基因的优生学

6.个人生育选择的自由

7.人类基因的多样性

●安全顾虑

●成功率太低

赞成

（1）复制技术可以去除先天的基因缺陷，反而更安全

（2）染色体端粒假說不是绝对的，有很多相反的例子

反对

（1）成功率太低

（2）至今沒有重复操作成功所累积的大量案例可供确认安全性

（3）根据染色体端粒假說，出生的复制羊已经和原母体一样老

●个体性和自我认同

赞成：

复制人就是一个完整的人，和双胞胎一样，基因相同并不影响其自我认同

反对：

基因确实是人类独一无二的重要表征，复制人的个体性自始被剥夺

●生物多样遭破坏

赞成：

同一人的基因不会被大量复制，何況真正消灭传染病的是医学发展，不是生物多样性

反对：

复制破坏基因的变化，使人失却抵御病毒、流行病、细菌及环境变迁的能力

●生殖权

赞成：

复制是生殖权的一部分，人可以有“特別的”人工协助生殖方式，也可以积极地筛检基因

反对：

权利也可以有适当限制

什么样的情况可以复制人？

？

？

器官移植、重塑逝者、生命延续？

案例1：

某甲30岁生了个儿子→20年后甲因飞机坠机过世，家人利用基因复制一个甲。

Q1：

复制甲的社会伦理地位为何？

——此20岁儿子如何称呼甲（爸爸？

）

Q2：

复制甲的法律地位为何？

——儿子与复制甲如何分配甲过世后所留的遗产？

案例2：

因被复制者的遗传基因（DNA）与原來个体相同，若未来复制人犯了强奸杀人罪，现场仅留有血液及精液等样本。

Q：

警方如何厘清复制者与被被复制者的关系？

？

？

道德问题

●无论是蓄意或无心闯祸制造病毒或其它有害的生物

●以牟取利益或功利为目的

●违背人自身价值和自由

转基因植物对自然物种所造成的潜在性风险与危机

●在作物中对除草剂有抗性的基因可能会在自然环境中转入杂草品种中，这将会造成日后难以处理的困难

●杀虫蛋白基因若在花粉中表达将危及赖以为生的蜜蜂等有益昆虫

案例：

在种植抗除草剂作物后，多次喷洒除草剂，杀死杂草而对作物无威胁。

由于大斑蝶的惟一的食物是马利筋，随着多次除草剂的喷洒，马利筋就大量减少，也就威胁到大斑蝶的物种的生存。

结束语

（1）承認人所知有限

目前科技人对自己的了解仍是非常肤浅的，目前多在基因所控制生命現象的层次。

母爱的力量可否量化？

（2）人非胜天，需順从自然规律，以免造成大自然的反扑

人类的威胁不是来自可能致命的机器和技术工具；真正的威胁总是戕伤个人的本质。

─海德格

生物科技的发展会使我们丧失人性？

科技本身是中性的，由人操控決定未来，它可给人类无穷的幸福，也可带来万劫的灾祸

「我们是谁，要往何处去？

」

第二章基因工程工具酶

在基因工程中需要一些酶对DNA进行剪切、连接、修饰、合成等操作，这些酶即称为工具酶。

主要的工具酶有：

●限制性核酸内切酶、DNA连接酶、逆转录酶、DNA聚合酶Ⅰ、碱性磷酸酶、T4噬菌体激酶、末端转移酶TaqDNA聚合酶

第一节限制性核酸内切酶

一、限制性核酸内切酶定义

简称限制酶。

是一类内切核酸水解酶，能识别和切割双链DNA分子中的特定核苷酸序列。

细菌的限制－修饰系统

●限制-修饰系统存在于原核生物，通过限制性内切核酸酶破坏进入细胞的异源DNA，这个现象叫做“限制”；通过甲基化作用使DNA得以避免受酶活性的影响，这个过程叫做“修饰”。

●细菌中已发现三类限制-修饰系统：

Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。

三类限制－修饰系统

●Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。

Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子。

●Ⅱ类由两种酶组成的二元系统，一种为限制性内切酶，另一种为甲基化酶两种酶识别序列相同

基因工程中常采用缺少限制作用的菌株作为受体细胞，保证基因操作的顺利实施。

●细菌（大肠杆菌K12）限制与修饰系统的4种遗传表型：

●rk+mk+：

野生型，具有完整的限制和修饰功能

●rk-mk+：

突变株，限制缺陷型，常用于转化实验

●rk-mk-：

限制和修饰缺陷型，常用于转化实验

rk+mk-：

修饰缺陷型，具有限制功能，又称“自杀性表型”

二、限制性核酸内切酶作用特点

（一）分类

根据酶的分子组成及裂解方式的不同，将限制性内切酶分为三类：

1.Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶在DNA重组技术中并不常用

2.Ⅱ类限制性内切酶通常所说的限制性内切酶即指此类

表限制性核酸内切酶的类型及其特性

（二）命名

通常由三个斜体字母表示

1.第一个大写字母为微生物属名的第一个字母

2.第二、三个小写字母为微生物种名的头两个字母

3.如有株名则再加一个字母

4.用罗马数字表示同株内发现和分离顺序

例如:

淀粉液化芽胞杆菌（Bacillusamyloliguefaciens）H株第1种限制性内切酶，命名为BamHⅠ

●（Escherichiacoli）RY13株，首次分离到的内切核酸酶，称为？

。

（Haemophilusinfluenzae）Rd株，第三个被分离到的内切核酸酶，称为？

。

（三）Ⅱ类限制性核酸内切酶识别序列特点

回文结构：

切口：

平端切口--平末端粘端切口--粘性末端

异源同功酶：

来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。

同尾酶：

有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后产生相同的粘性末端，称为同尾酶。

Subsets酶（一个位点包含在另一个位点之中）

HpaⅡ识别及切割序列：

CC↓GG

SmaⅠ识别及切割序列：

CCC↓GGG

SmaⅠ能识别与切割的6个bp中，含有HpaⅡ的CCGG识别与切割位点

（四）限制性内切酶的应用

●DNA重组克隆及亚克隆

●改造和构建质粒

●组建基因组DNA物理图谱

●基因组DNA同源性研究

●DNA杂交

●DNA序列分析

DNA的物理图谱（physicalmap）

又称DNA限制酶酶切图谱（restrictionmap）。

它由一系列位置确定的多种限制酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

DNA限制酶酶切图谱构建

通常结合使用多种限制酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。

酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。

建立限制酶酶谱的意义

用于DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建、RFLP（限制性片段长度多态性）技术应用等方面

（五）限制酶的活力单位和星活力

1.酶活力单位

2.星号活力

3.酶切体系建立

酶活力单位

在合适温度、pH值和离子强度等条件下，1小时内完全消化1μg特异DNA底物所需的酶量，定义为一个活力单位。

星号活性

限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加“*”表示

诱导星活性的因素

●高甘油含量（>5％，限制酶贮存在50%甘油中）；

●内切酶用量过大（>100U／ugDNA）；

●低离子强度（<25mmol/L）；

●高pH（>8.0）；

●含有机溶剂（二甲基亚砜、乙醇、乙烯二乙醇、二甲基乙酰胺等）；

●二价阳离子（Mn2＋、Gu2＋、Co2＋、Zn2＋）

三、酶切体系建立

总反应体积20～100ul：

例：

底物DNA1ug

限制酶1活性单位

缓冲液1×NEBuffer

蒸馏水至20ul

●对于大量DNA的酶解，反应体积可按比例适当扩大。

●加入过量的酶，可以缩短反应时间并达到完全的酶解，但同时增加的甘油含量会影响反应，导致识别序列的特异性下降。

●一般推荐稍过的酶（2~5倍）和较长的反应时间。

●在保证酶液体积不超过反应总体积的10%的前提下，尽量减小反应总体积。

●限制酶的质量要求：

●不存在其他核酸内切酶及外切酶的污染；

●长时间酶切不出现非特异顺序识别；

●在建立反应体系时，最后加入酶；

●分装储存，避免反复冻融；

●稀释的酶应尽快用完

DNA的质量要求：

纯度要求——应当去除酚、氯仿、乙醇、去污剂或过多盐离子的污染，EDTA含量不能大于10mmol/L，以免干扰酶的活性。

DNA的甲基化、大量RNA杂质、某些杂蛋白未除净而结合在DNA时也会影响酶切效果。

浓度要求——DNA浓度在1ug/20ul能得到较好的酶切效果，浓度高达1.5ug/20ul时就可能发生酶切困难。

DNA分子的构型——超螺旋质粒DNA、病毒DNA酶解所需的酶量更高

甲基化酶

影响限制酶的酶切活性——有dam甲基化酶和dcm甲基化酶。

基因工程中使用甲基化酶缺失的大肠杆菌菌株制备质粒DNA载体。

特殊用途——改变限制酶的识别序列

（GTCGAC可被R.HindⅡ识别切割，如A被甲基化则将改变其切割特异性）——产生新的限制酶识别序列

——保护限制酶的切点

——一些同裂酶对甲基化的敏感性不同，可用于研究DNA位点专一性甲基化程度和分布

（CCGG可被HpaⅡ和MspⅠ识别，mCmCGG则只被MspⅠ识别）

酶切缓冲液（NEBuffer）的质量要求：

●EBuffer中应含Mg2＋作为限制酶的激活因子；

●Tris-HCl，将酶反应体系的pH维持在7.5-8.5之间；

●加入DTT和BSA用于保护酶活性；

●NaCl提供合适的离子强度，每种酶都有最适的离子强度。

操作的注意事项：

（1）限制性内切酶需保存于-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。

（2）限制性内切酶溶液通常含有50%甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分混匀。

（3）加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰到管壁，每加完一样要换一个吸头，避免污染。

（4）酶（置于冰盒上）应最后加入，加酶时吸头不可过深。

酶切容积

酶反应体积一般不宜小于20ul。

可分为小量酶切反应和大量酶切反应。

小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20μl,含0.2～1μgDNA；大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100μl，DNA用量在10～30μg。

酶解温度及时间

常规的酶切反应一般控制在37℃、1小时内完成，但也可以根据切割对象与所用的酶的不同调整反应温度或延长保温时间以达到完全酶切。

终止反应

①加入EDTA至终浓度10mmol/L，络合镁离子。

但这种方法会影响需镁离子的后续反应。

②将酶切反应液置于65℃～85℃保温20分钟。

热失活方法简单、未向体系中引入任何物质，特别适用于连续进行几个酶切反应。

③酚／氯仿抽提沉淀，能使酶彻底失活。

酶切结果鉴定

酶切完毕，取5ul酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。

第2节连接酶

酶定义

催化双链DNA中相互邻近的5′磷酸末端和3′羟基末端生成磷酸二酯键，从而封闭DNA双链中的切口或将二个DNA分子连接起来。

DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而难于将二个单链DNA分子连接。

二、连接酶的种类

●种类：

T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶，前者的连接效率高于后者。

●特点：

T4噬菌体DNA连接酶能连接带粘性末端或平末端的DNA分子；大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端DNA分子

●应用：

DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶

●条件：

连接反应需要ATP、Mg2+和二硫苏糖醇，最适pH为7.2～7.4

三、反应体系建立

（一）T4DNA连接酶的活性单位

几种酶单位的定义

1.韦氏单位（Weiss）：

指在37℃下20分钟内催化1nmol32P从焦磷酸根置换到〔γ﹒β-32P〕ATP所需的酶量

2.M-L单位（Modrich-Lehman）：

使用d（A-T）n作为底物

3.粘性末端连接单位：

以λDNA/HindⅢ片段为底物

●各单位之间的换算关系

●1韦氏单位=66.6粘性末端连接单位

●1韦氏单位=0.2M-L单位

0.01韦氏单位能在16℃、30分钟内将HindⅢ完全酶解的1μgλDNA片段完全连接

（二）反应总体积50μl

T4噬菌体DNA连接酶1Weiss单位

ATP0.5~1.0mmol/L

DNA1.0μg（0.1~1.0μmol/L5′末端）

10×T4噬菌体

DNA连接酶缓冲液5μl

（缓冲液组分：

Tris-HClpH7.6;MgCl;DTT;BSA）

（三）反应条件

粘性末端：

温度12~16℃时间1~16小时

平末端：

更大量的连接酶（10~100倍）、较多的底物浓度、适量的一价阳离子、低浓度PEG、ATP终浓度0.5mmol/L

较高的反应温度（＜30℃）

（四）终止反应

1.加入2μl0.5mol/LEDTA溶液

2.75℃水浴10分钟

四、影响连接反应的因素

（一）DNA末端的浓度影响连接物的分子构型

两种产物构型

1.线性DNA连接物：

不同分子DNA的两个末端首尾相连形成线性分子

2.环状分子：

同一分子的两个末端连接形成环状分子。

分子构型与DNA浓度、长度的关系

1.一定浓度、小分子DNA片段，同一分子环化趋势大

2.长度一定的DNA分子，浓度降低有利于分子的环化

3.浓度较高的DNA,有利于分子间的连接，形成线性二聚体或多聚体分子

4.两种以上DNA分子连接，其末端浓度比例将影响重组分子的形成（通常外源DNA的末端浓度大于载体末端浓度2倍）

（二）反应温度

●粘性末端连接：

一般为12~15℃

●兼顾粘性末端退火、酶活性、反应速率；

●连接温度介于同源粘性末端退火最适温度和酶的最佳反应温度之间；

●粘性末端中G+C含量多，其连接温度可以增高

●平末端连接：

可