木质纤维素的酶水解.docx

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木质纤维素的酶水解

木质纤维素的酶水解

Biologicalconversionofcellulosicbiomasstofuelsandchemicalsoffersthehighyieldstoproductsvitaltoeconomicsuccessandthepotentialforverylowcosts.Enzymatichydrolysisthatconvertslignocellulosicbiomasstofermentablesugarsmaybethemostcomplexstepinthisprocessduetosubstrate-relatedandenzyme-relatedeffectsandtheirinteractions.Althoughenzymatichydrolysisoffersthepotentialforhigheryields,higherselectivity,lowerenergycostsandmilderoperatingconditionsthanchemicalprocesses,themechanismofenzymatichydrolysisandtherelationshipbetweenthesubstratestructureandfunctionofvariousglycosylhydrolasecomponentsisnotwellunderstood.Consequently,limitedsuccesshasbeenrealizedinmaximizingsugaryieldsatverylowcost.Thisreviewhighlightsliteratureontheimpactofkeysubstrateandenzymefeaturesthatinfluenceperformance,tobetterunderstandfundamentalstrategiestoadvanceenzymatichydrolysisofcellulosicbiomassforbiologicalconversiontofuelsandchemicals.Topicsaresummarizedfromapracticalpointofviewincludingcharacteristicsofcellulose（e.g.,crystallinity,degreeofpolymerizationandaccessiblesurfacearea）andsolubleandinsolublebiomasscomponents（e.g.,oligomericxylanandlignin）releasedinpretreatment,andtheireffectsontheeffectivenessofenzymatichydrolysis.Wefurtherdiscussthediversity,stabilityandactivityofindividualenzymesandtheirsynergisticeffectsindeconstructingcomplexlignocellulosicbiomass.Advancedtechnologiestodiscoverandcharacterizenovelenzymesandtoimproveenzymecharacteristicsbymutagenesis,post-translationalmodificationandover-expressionofselectedenzymesandmodificationsinlignocellulosicbiomassarealsodiscussed.

基于酶水解技术基础上的纤维素乙醇生产技术是20世纪80年代生物质技术的主要研究领域，自从20世纪70年代“能源危机”之后，美国能源部一直积极支持规模以上乙醇生产，并建立独立部门用于管理和支持这项工作。

虽然通过纤维素酶水解纤维素生物质产生的生物燃料和化学产品提供了更高的收益率，较高的选择性，降低能源成本以及相对化学过程更温和的操作条件等，但是这种技术在那个时代依然被判定为高风险行业[1]。

然而新兴生物技术为纤维素乙醇生产成本降低并使其更具有竞争性提供了重要的保证。

改进的稀酸预处理方法和二战时期发现的纤维素酶生产菌Trichodermareesei是20世纪80年代纤维素乙醇历史性成本降低的主要原因[2-4]。

RutgersUniversity通过经典突变技术和菌种选育获得了来源于野生型T.reeseiQM9414的著名纤维素生产菌株TrichodermareeseiRut30[5]。

杰能科公司的纤维素酶150L非常高效是因为β-葡萄糖苷酶的水平大幅提高[6，501]。

最近宣布糖苷水解酶成本显着改善多达20至30[7,8]。

值得注意的是自然环境中大多数的细菌和真菌具有生产生物质水解酶的能力。

纤维素相关微生物进化形成了具有完全降解能力的微生物个体以及作为某些微生物群落中生物质水解反应链中某一环节的微生物个体。

通过这些微生物分泌的纤维素酶被分类为糖苷水解酶（GHs），其中也包括某些具有木素修饰能力的酶。

酶和微生物的结合在不同的生物质水解生态系统中是动态变化的，这依赖于初始的生物质资源和环境影响因子。

通过已有的生物技术，发现以及改良新的酶资源，并使这些酶具有新的特性就具有了更大的潜力，这些特性包括平衡协同基础上更高的特异活性，更好的热稳定性，更好的抗抑制能力以及改进的多种组合（如纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶以及蛋白酶）酶活性以获得低成本前提下的高产量的复合糖。

不幸的是，纤维素乙醇生产技术尚未被商业化的部分原因至少是因为从具有天然生物结构屏障的纤维素材料中释放糖具有极大的困难[9,10]。

其结果是水解时需要大量的酶制剂，根据每g经过预处理的纤维素通常需要使用15FPU剂量纤维素酶实现经济的糖产量换算，相当于制成1L的生物乙醇需要大约30g纤维素酶。

图1说明了酶蛋白的生产成本（美元/千克酶）和包括所需要所有酶种类情况下必须用于乙醇的成本关系（美元/加仑的乙醇），这一数据包括不同的酶达到同样乙醇产量所需要的成本（数据来源于国家可再生能源实验室报告的数据）[11]。

因此，为了实现预期的生物乙醇成本目标（$0.10/加仑或更低），美国能源部计划将酶的成本控制在低于$2/kg，并大幅削减产量高所需的酶负荷即提高酶的效率或者两种战略并行实施[12-14]。

此外，酶水解机制以及限制水解效率的因素还不清楚，这也使许多的商业应用因此受到了一定的限制[15]。

提高对生物质及其水解酶的结构和功能的认识将对确定影响木质纤维素生物质转化和生物预处理，水解以及酶对生物质转化中的作用以及制定适当的策略以实现高糖得率和低酶用量起到重要的作用。

　　酶的水解效率是由纤维素的结构特点和酶作用机制决定的。

虽然过去的几十年里通过大量的研究，在酶的结构，酶分子性质以及纤维素超微结构等方面掌握了一些细节的知识，但是由于纤维素底物结构的复杂性以及酶组分的多样性，纤维素底物的水解机制至今仍然未被完全了解。

因此，本文着重对目前预处理生物质的特性以及影响糖释放的糖苷水解酶的主要特点进行综述，并建议进一步推进如基因组学，蛋白质组学和显微技术等新兴技术对生物质转化的研究。

底物相关因素

这一节的目标是对新近获得的对生物质结构性质和相关酶的特征的研究进展进行综述，同时提供通过改善底物结构影响酶水解的研究视角。

生物质具有许多妨碍自身被酶解的结构特点。

大多数的生物聚合物，包括纤维素，半纤维素和木质素在细胞壁中不是孤立存在的，它们之间形成紧密的相互联系[16]。

木质素和碳水化合物（如纤维素和半纤维素）形成木质素-碳水化合物复合体[17]。

最近的研究显示在草本植物中，聚糖-木质素交联通过阿魏酸连接到阿拉伯木聚糖上。

阿魏酸修饰的半纤维素为木质素的增加提供了使木质素锚定在植物细胞壁多糖上的结合位点，这样的结构可能使植物细胞壁具有屏障作用[18–20]。

木质素这种结合在纤维素纤维上形成的复杂结构降低了酶接触纤维素的可能性[21]，但是这种结构至今还没有被清楚地认识。

为了完全的降解这种植物细胞壁中的异质性结构需要多种酶的协同作用，包括纤维素酶，半纤维素酶，辅助酶以及木质素修饰酶。

我们目前的知识结构不足以使我们理解整个纤维素生物质酶水解的过程，目前获得的大多数实验结果都是来自于：

纯酶组分作用于纯底物或者复合酶组分作用于热化学预处理的生物质。

纤维素的特点

酶水解纤维素的主要商业用途是水解纤维素和其他聚糖类物质并产生可发酵糖，这些可发酵糖包括葡萄糖和/或寡糖，这些水解产物可以通过进一步的生物或化学方法转换成有价值的产品。

虽然由于其他物质以及经预处理后的纤维素衍生物的出现（例如半纤维素和木质素）使纤维素酶水解过程变得更加复杂，但是了解纤维素本身的主要结构特点对酶水解速度和效益的影响仍然是必须的。

由于极小的尺寸，以及与其他基质聚合物（主要是半纤维素和木质素）形成的紧密交联，要准确的描绘植物细胞壁中纤维素的结构是十分困难的。

纤维素可以被视为建立在纳米层次上的微纤维复合材料。

利用先进的成像技术如原子力显微镜（AFM）可以完成天然状态下对纤维素精确的测量和详细的表面结构研究。

基于原子力显微镜技术对植物细胞壁[22-24]的研究显示，微纤丝的直径约为3-5nm，根据推测的含有36个纤维素合成酶的纤维素酶复合体（玫瑰花样），微纤丝含有36根链（CEF）。

从AFM成像中发现一个有趣的现象是大原纤维仅存在于初生细胞壁的最外层。

大原纤维由一束微纤丝组成，在这束微纤丝末端出现分裂并形成更小的微纤丝束直到最终的单根微纤丝。

每根在成熟初生细胞壁中观测到的微纤丝包含一根链，在这根链外层还交联结合了一些半纤维素[25,26]。

玉米细胞壁的新鲜细胞的原子力显微镜图像进一步证实了这一观察[27]。

图2显示了植物细胞壁的合成原理模型。

在这个模型中，至少需要3种纤维素合成酶（CESA亚基，A1，A2和B）通过自发的形成6×6CESA酶才能完成[28]。

每个酶复合体合成36根CEF。

基于纤维素Iβ结构估测的CEF束的尺度为3×5.5nm，并且这一数值与AFM实测值相同。

一定数目的CEFs形成束并称为微纤丝。

其他胞壁聚合物的沉积，主要是半纤维素，在细胞生长过程中完成，这种沉积作用导致大原纤维分裂形成含有表面半纤维素的微纤丝[25,26]。

纤维素酶测定使用的底物要是纯纤维素（如Avicel或者Sigmacell），当然这种纯纤维素不可避免的含有少量其他的聚糖，主要包括半纤维素。

无论纤维素制备过程中其自身来源和纯化方法如何要求，纯纤维素的结构特点都随着结晶度，聚合度以及表面结构发生变化这可能会显著影响酶水解。

结晶度

纯净的纤维素是由纳米级别的微纤丝组成的毫米级别大小的颗粒（图2）。

一般认为纤维素颗粒由结晶区，半结晶区（无序）和无定形区组成。

历史上，一些报道证实无定形纤维素能够迅速被纤维素酶降解形成cellobiose，而结晶区纤维素水解过程要慢得多。

因此一些学者提出纤维素水解速率取决于纤维素的结晶程度[29-32]。

虽然某些研究证明随着结晶度的增加水解速率下降[33-35]，而同时其他人却发现了相反的效果[36-38]。

根据预测，结晶纤维素水解导致更多半结晶区和无定形纤维素去除[38-40]的结果，从而使结晶度增加。

但是在某些研究中纤维素水解过程中结晶度没有显着的变化[41,42]。

一些报道认为纤维素的结晶度不影响水解的效率[37,43-49]。

另据报道纤维素的结晶度也影响到酶的吸附作用，这一结果将影响水解速率和可发酵糖产率。

增加的水解速率和产率（>100倍）被证明是与较高的无定形区比例相关的[35,39,50-55]。

许多实验结果显示酶的吸附作用，包括整个糖苷水解酶系统，纤维素结合结构域（CBM）以及单一的酶组分都随着纤维素结晶度的提高而下降。

最近，Joeh和同事发现结晶度极大地影响了Cel7A（CBHI）吸附，导致水解程度的下降[55]。

Hall和同事发现初始酶水解率随结晶度下降而上升，而吸附酶浓度保持恒定[42]。

此外，不同纤维素酶组分已被证明有不同的吸附电能力和纤维素酶活性[50,51]。

纤维素内切酶（EGI）是一种用于进攻并优先吸附在无定形区纤维素的酶，似乎具有相同的吸附能力，并且在两类纤维素的研究中活性大大高于CBHI。

类似的模式在丁，徐[56]的研究中也存在。

此外，Banka和Mishra发现在瑞氏木霉中结晶度上升将导致一种非水解蛋白质的结合能力提高，这种蛋白质命名为纤维形成蛋白[57]。

这样的结果表明纤维素的结晶度对非水解酶组分具有重要影响，它可以有效的影响纤维素酶水解。

纤维素结晶度不仅仅影响纤维素酶的吸附，同时还影响了纤维素酶组分的吸附效率。

文献报道纤维素的结晶度影响了纤维素酶的协同[42,51,58–66]。

Hoshino等发现瑞氏木霉中EGII和CBH1之间协同作用将随着结晶度的上升而增加，最高的协同作用出现在结晶度达到约1.0时。

在另外一项研究中，Igarashi和同事发现天然结晶纤维素聚合区影响CBHI的水解能力[67-69]。

另外Mizutani[70]和Gama以及Mota[71]展示表面活性剂对纯纤维素糖化过程的增加是通过影响结晶度实现的。

一些研究针对纤维素酶水解过程和结晶度之间的关系开展。

瑞氏木霉酶系中的主要酶CBHI的酶解过程受到结晶度的影响。

通过对纤维二糖和葡萄糖比例关系间接反应的酶解过程的粗略估计发现，细菌纤维素和无定性纤维素分别有23和14个纤维二糖单元形成[72]。

在另一项研究中，CBHIfromT.reesei酶解过程分别是88±10,42±10and34±2.0二糖单元分别对应于细菌纤维素（CrI~88），BMCC（CrI~92）以及内切酶处理过的纤维素（unknownCrI）[73]。

目前还需要更多的证据证明结晶度对酶水解过程和酶效率的影响。

聚合度

一些研究和文献讨论在不溶性和可溶性纤维素中改变DP后，底物被一套完整的纤维素酶或纯化的酶组分水解的影响[43,44,51,52,74-80]。

然而，对纤维素链长度对水解过程的影响了解仍然有限。

 Sinistyn等研究表明通过G-辐照降低棉绒聚合度的同时保持结晶度不变时对水解速率的影响可以忽略不计[35]。

ZhangandLynd[81]的动力学研究发现降低聚合度导致的水解速率的提高要大大小于增加β糖苷键可及度所产生的水解速率提高的效果。

在不溶性纤维素中Nidetzky等[82]发现随着聚合度的提高纤维寡糖被CBH1水解的初始速率逐渐提高，到纤维六糖之后基本保持不变[82]。

类似的报道在CBHII和EGI作用于纤维糊精时也被发现[51]。

此外据报道β-葡萄糖苷酶的活性会随着DP降低而减少[83,84]。

然而并没有可靠的结果证明不溶性底物聚合度在纤维素酶催化效率方面的影响，除了较高的DP可能会导致更高CBHI和EGI[65,81,85,86]之间的协同作用之外。

此外，纤维素的聚合度可能影响了酶水解进程的反应数，在短链上的全过程的CBHI水解可能是不准确的[61]。

目前仅仅获得极少的数据证明聚合度影响了纤维素酶的吸附。

Kaplan等证明随着某些开环棉花纤维素DP降低而导致的减少水解会使纤维素酶的吸附显著下降，然而这一过程中结晶度没有受到影响[87]。

考虑到CBHI在全酶系中占有的巨大比例（>65%）以及它的偏好性[82,88-91]可以快速得出结论DP的降低快速提高水解速率的原因是产生大量可供CBHI结合的末端，因此提供了一种通过降低DP的方法提高酶水解效率和产率的方法。

纤维素酶可接触的表面

纤维素酶接触纤维素的能力受限于纳米层次的纤维素微纤丝结构（图2）。

纤维素链之间的交联以及微纤丝被大量的基质多糖和木质素包被的结构赋予天然细胞壁额外的结构抗性，然而同时也使纤维素酶的降解变得更加复杂[92]。

虽然在纤维素纯化和制备中结构经过大量修饰，但是细胞壁微纤丝的直径仍然保持在3-5纳米的水平上，与初始状态相同，但是这些微纤丝的长度被降低到几百纳米（图2）。

纤维素酶的可及度受到两个因素控制和影响，首先是纤维素酶可以接触到的微晶纤维素的表面，也就是CBHI的碳水化合物结合模块只能够接触到具有亲水特性的纤维素面[93-95]。

。

第二个限制因素是植物细胞壁的解剖结构，这种结构也可以影响纤维素酶的可及度，尤其是植物细胞壁中出现的允许纤维素酶进入植物细胞组织并接触到微纤丝的那些孔洞。

预处理的重要影响之一就是可以扩大这些孔的尺度并促进纤维素酶进入生物质。

基于纤维素酶水解反应是一种表面反应的前提，纤维素酶可攻击的纤维素表面应该是对纤维素酶解最有影响的生物质结构特性，这一特性会影响纤维素酶对纤维素表面的吸附以及随后的纤维素酶的水解过程[16，96-101]。

许多论文讨论了在这种背景下可用的孔体积和比表面积[51,44]。

可及度也可以与其他底物结构因素相联系，如纤维素的结晶度和聚合度等。

然而一些研究证明孔洞体积[44,101-105]和纤维素颗粒大小[37,103,106-108]也会影响纤维素水解。

尽管如此，由于一些细菌纤维素酶如多酶复合体纤维小体具有100倍于真菌纤维素酶的尺寸，但却表现出高于真菌纤维素酶的水解效率，这样看来微孔的作用就不那么重要了[50，109]。

此外根据观察，纤维素酶组分并没有渗透到微孔中[110]，微孔体积与降解能力并没有任何关系[111]。

颗粒大小对纤维素酶吸附[112-114]和水解[47，115]的影响极小，但是随着纤维素片段化的加速伴随的小颗粒纤维素的形成的影响则不能排除。

相反，它表明较大的颗粒可以抑制有效的水解[116]。

另一方面，各种DP和结晶度对酶解效率影响的研究表明预处理底物的酶解效率不能轻易地根据DP或结晶度差异来预测[37，117]，这可能是由于真实纤维素的底物的结构复杂性导致的。

然而，纤维素酶可及度可以提供一个有用的视角，并帮助人们确定预处理的方法，并通过研究确定并改善预处理方法。

纤维素反应以及酶功能的转换

全酶法水解实验中酶的水解效率大大降低，同时单位数量的酶在水解过程中可水解生成的可发酵多糖的产量也大幅降低，而且长时间的低效水解不能简单地通过产物抑制作用来解释。

这一过程的机制还不清楚[]。

除了酶相关的因素，如纤维素酶的热稳定性[120-123]，产物抑制[120,124-128]，酶失活[125,129-135]，酶降速/停止[136]外，底物相关因子包括底物转变成不易被水解的形式[137]以及底物结构的异质性[137，138]也与这种现象有关。

之前对于反应速率降低的解释是底物中更易于被水解的部分具有被优先利用的可能[137]，但是另一方面，一些报道得出的结论是底物的反应性并不主要由长时间驻留需要纤维素良好的转化导致[136]。

目前通过利用“中断”和“重新启动”实验以确定控制纤维素水解的影响因素[136-141]。

重启实验利用蛋白酶移除纤维素酶，之后添加蛋白酶抑制因子用于在纤维素在初始条件下重新开始水解之前解除蛋白酶活性，通过这种技术可用于了解纤维素水解动力学过程中反应能力丧失的原因[142]。

吸附于Avicel之上的酶的水解速率在进行这种重启实验后保持不变，但是连续的水解速率下降。

因此纤维素连续水解过程中水解速率的降低不能归结于底物反应特性的变化，同时其他酶相关影响，如酶降速是被阻拦或者人为干扰可用于解释这一现象[142，143]。

利用这种酶重启方法，CrI纤维素的纤维素转换在5小时内缓慢增加到80%[144]。

中断实验的AFM成像显示随着酶解的进行，Avicel的表面变得光滑和平坦（图3）。

新的“重启”方法使获得酶水解过程中酶和纤维素之间的动态相互作用信息变得更容易。

不溶物分布

纤维素，半纤维素和木质素是植物细胞壁的主要聚合物，任何影响这些组分结构的修饰或去除过程都可能会影响酶的水解效率。

然而，实验结果产生了巨大的差异。

 Grohmann等人和其他研究者的研究结果显示去除半纤维素与纤维素的葡萄糖产量之间存在直接关系[111,145-150]，但其他研究并不支持去除半纤维素能够改变纤维素水解速率的结论[151-154]。

同样，关于木质素去除能否提高纤维素水解速率的讨论也产生了截然不同的结果相[102,155-157]。

所有植物细胞壁结构及成分在预处理过程中都会被不同程度的改变，根据所使用的技术和条件，通过微纤丝改变，移除半纤维素，修饰或者移除木质素，或者其他影响底物结构的因素来推断这些因素能够影响酶解效率都是不准确的。

半纤维素

　　半纤维素的去除能够显著的提高纤维素的水解速率，这一结果暗示半纤维素是阻碍纤维素酶水解的关键屏障[157]。

同时预处理过程中的木质素改变会严重影响半纤维素的作用[102，155，158，159]。

从更实用的角度出发，虽然液氨气爆过程中可能会使半纤维素发生一定的程度的修饰，但是像液氨气爆（AFEX）等预处理过程仍然可以在不去除具有影响作用含量的半纤维素的前提下产生大量易降解的纤维素[160-162]。

之前的研究极少考虑底物乙酰化程度。

在多种类型的生物质中半纤维素都被大范围的进行乙酰化修饰，根据报道去乙酰化将能够使纤维素的水解效率提高3倍以上，不同的报道中对去乙酰化程度影响酶水解速率的提高存在一定的差异[163，164]。

一项研究表明当去乙酰化程度达到75％时，这种影响似乎就变得不那么重要了，而另一项研究显示完全移除切除半纤维素将能够持续提高纤维素的水解效率[156，165]。

 Grohmann和同事发现移除白杨木和麦秸中的乙酰酯使其的降解效率提高了5至7倍。

Kong等观察了在保留木质素和聚糖的前提下，白杨木中乙酰去除程度对纤维素消化能力的影响[165]。

Zhang和Holtzapple应用上述类似的方法进行研究但结果表明，去除乙酰键对提高降解效率的影响要小于结晶度和/或木质素去除[166]。

此外，Weimer等人的研究认为木聚糖和纤维素的紧密联系并不抑制聚糖的生物降解性[167]。

移除半纤维素的同时也移除乙酰基将会改变脱离的木质素的形式，这将使确定何种因素影响了水解能力的提高变得困难。

不幸的是，半纤维素的去除或者多糖网络的破坏目前仍被看做是可以增强降解效率的生物质预处理手段，并进一步的进行着讨论。

　　这些研究使我们相信，即使将纤维素变得完全可及，这些纤维素酶也无法有效的水解纤维素，除非包括半纤维素和乙酰化作用的复杂的生物质组分组成的网络被破坏[168-170]。

Jeoh和他的同事通过对荧光标记的CBHI分子对纤维素接触能力的观测发现在去除木聚糖后，这种水解能力有了一定提高[55，171]。

Pan等认为纸浆中的乙酰基团可能会通过阻碍键的形成影响纤维素酶接触纤维素，这可能是由于纤维素直径的增加以及变化的疏水性所致[168]。

然而目前并没有足够的证据证明通过去除半纤维素和去乙酰化能够影响纤维素酶的吸附。

另外最近的研究结果表明木寡糖是纤维素酶的强抑制剂，在水解过程中的大量释放将降低水解效率，在预处理中移除它们是十分必要的[172，173]。

脱乙酰化可能会间接地影响纤维素酶水解生物质的效率，因为移除乙酰基以及其他取代基团之后可能会提高木聚糖被木聚糖酶水解的效率[156,174-178]，并导致纤维素的降解效率的提高[179-182]。

因此虽然木聚糖移除