Northern印迹杂交技术.ppt

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分子生物学方法之分子生物学方法之Northern印迹杂交技术印迹杂交技术原原理理核酸分子杂交（核酸分子杂交（molecularmolecularhybridizationhybridization）：

利用不同来源但互补配）：

利用不同来源但互补配对的核酸单链之间对的核酸单链之间（包括包括DNA-DNA,DNA-RNADNA-DNA,DNA-RNA，RNA-RNA）RNA-RNA）能够特异性结合形成杂合双链能够特异性结合形成杂合双链的特性，从而对目的核酸分子进行定性和的特性，从而对目的核酸分子进行定性和定量分析的技术。

定量分析的技术。

NorthernBlotting:

NorthernBlotting:

检测检测RNARNANorthernNorthern杂交是用于杂交是用于RNARNA定量和定性分析的常用定量和定性分析的常用技术，它是将技术，它是将RNARNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核酸分子杂交的一种实验方法。

酸分子杂交的一种实验方法。

可以鉴定总可以鉴定总RNARNA或或poly（A）poly（A）+RNARNA样品中同源样品中同源RNARNA的存的存在与否、测定样品中特定在与否、测定样品中特定mRNAmRNA分子的大小和丰度，分子的大小和丰度，是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调节以及节以及cDNAcDNA合成的重要手段。

合成的重要手段。

northernnorthern印迹杂交流程图印迹杂交流程图印迹杂交流程图印迹杂交流程图所用材料、试剂及仪器所用材料、试剂及仪器方法与步骤参考书籍及文献材料材料总RNA样品或mRNA样品、探针模板DNA、随机引物、地高辛-dUTP、klenow酶、硝酸纤维素虑膜等。

试剂试剂10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样缓冲液、37%甲醛、甲酰胺、20*ssc（pH7.0）杂交缓冲液、2*洗膜缓冲液（2*ssc）、预杂交液、杂交缓冲液、缓冲液，、NBT（硝基四氮唑蓝）、BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐）、TE缓冲液、显色液、琼脂糖等。

仪器仪器恒温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移仪，真空泵，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心机，烧杯，量筒，三角瓶，紫外灯等。

1.RNA电泳电泳2.转膜转膜RNARNA转膜前的处理转膜前的处理毛细管洗脱法毛细管洗脱法真空转移法真空转移法电印迹法电印迹法转膜的转膜的转膜的转膜的方法方法方法方法叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约1010hh。

电泳后的凝胶电泳后的凝胶放置放置室温转移室温转移1025h1025h漂洗（漂洗（SSCSSC）除碎胶片）除碎胶片8080烘烤烘烤2h2h固定固定核酸核酸.3、探针标记、探针标记探针模探针模模板、随模板、随机引物机引物、双蒸、双蒸水。

水。

离心、离心、混匀。

混匀。

变性变性冰块冰块顺序加顺序加随机引随机引缓冲液缓冲液、dNTPdNTP、dUTPdUTPKlenowKlenow酶，混酶，混匀。

匀。

室温室温3h75C75C保温保温1010MinMin。

加预冷加预冷无水乙无水乙醇、混醇、混匀。

匀。

-20、2h1000r/min1000r/min15min15min、去上清去上清、乙醇洗、乙醇洗涤、真涤、真空干燥空干燥、TETE溶解溶解、-20C-20C备用。

备用。

4.杂交杂交将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按20mL/100cm20mL/100cm22滤膜计算加入预杂交液、滤膜计算加入预杂交液、6868水浴摇床杂交水浴摇床杂交1-2h1-2h。

将标记好的将标记好的DNADNA探针煮沸探针煮沸5min5min，迅速在，迅速在冰上冷却。

将探针加入预热的杂交液冰上冷却。

将探针加入预热的杂交液中，充分混匀。

中，充分混匀。

倒倒去预杂交液，按去预杂交液，按250mL/c250mL/c滤膜计算滤膜计算向杂交袋中加入含地高辛标记探针的向杂交袋中加入含地高辛标记探针的杂交液，杂交液，6868杂交杂交6h6h以上。

以上。

洗膜：

在室温下用洗膜：

在室温下用50mL2*SSC50mL2*SSC，0.1%0.1%SDSSDS溶液洗膜两次以上，每次溶液洗膜两次以上，每次5min5min。

膜即可以立即用于显色检测或储存备膜即可以立即用于显色检测或储存备用（干燥环境中）。

用（干燥环境中）。

5.酶联免疫染色酶联免疫染色室温，用缓冲液室温，用缓冲液洗膜洗膜1-5min1-5min，缓冲液，缓冲液洗膜洗膜30min30min，再用缓冲液，再用缓冲液洗膜洗膜1-51-5minmin。

用缓冲液用缓冲液稀释抗体缓冲液（稀释抗体缓冲液（11：

20002000），），稀释后的抗体溶液在稀释后的抗体溶液在44只能稳定只能稳定12h12h。

室。

室温下将膜在抗体稀释液中浸泡温下将膜在抗体稀释液中浸泡30min30min。

缓冲液缓冲液洗膜洗膜22次，每次次，每次15min15min，以除去未，以除去未结合的抗体复合物。

再用结合的抗体复合物。

再用20mL20mL缓冲液缓冲液平平衡膜衡膜2-5min2-5min。

在黑暗条件下将膜与显色液放入密封在黑暗条件下将膜与显色液放入密封的暗盒中显色。

通常的暗盒中显色。

通常2min2min后出现颜后出现颜色，充分显色应在色，充分显色应在16h16h以上。

膜可以以上。

膜可以在弱光下短时间暴露以检测显色强度。

在弱光下短时间暴露以检测显色强度。

显色完毕后用显色完毕后用TETE缓冲液停止染色，照缓冲液停止染色，照相记录显色结果。

相记录显色结果。

结结结结果果果果示示示示例例例例参考书籍及文献参考书籍及文献1朱玉贤朱玉贤,李李毅毅.现代分子生物学现代分子生物学M.高等教育出版社高等教育出版社,2002，173-178.2黄怡森黄怡森,张光毅张光毅.生化与分子生物学生化与分子生物学M.科学出版社，科学出版社，2008，345-347.3郝福英郝福英,朱玉贤朱玉贤,朱圣庚，等朱圣庚，等.分子生物学实验技术分子生物学实验技术M.北京大学出版社北京大学出版社,1998,68-72.4魏春红魏春红,李毅李毅.现代分子生物学实验技术现代分子生物学实验技术M.高等教育出高等教育出版社版社,2006,156-162.5汪天虹汪天虹.分子生物学实验分子生物学实验M.北京大学出版社北京大学出版社,2009,76-79.