工作报告之对流免疫电泳实验报告.docx
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工作报告之对流免疫电泳实验报告
对流免疫电泳实验报告
【篇一：
实验十一免疫电泳】
免疫电泳技术
抗原与抗体的结合在沉淀反应中，呈一定的分子比例。
不同抗原和抗体之间的分子比例是不同的，但只有在分子比例合适时，才出现可见的沉淀。
所以沉淀能否出现并不完全反映抗原和抗体是否存在和发生结合。
抗原结合多个抗体分子，称抗原为多价；抗体一般只
能结合两个抗原分子（igm类抗体分子通常可以结合5个抗原分子）的抗原决定法簇，故为二价。
只有在彼此的结合价饱和时，才出现
大量的抗原-抗体复合物沉淀。
当抗原与抗体的比例合适时，即二者结合价彼此饱和，就可形成网状结构的大分子抗原-抗体复合物沉淀，称为等价带。
若比例不合适时，抗体或抗原过量，则虽有抗原、抗体的结合，但不能大量形成网状结构的大分子复合物，沉淀量很少，甚至不出现沉淀。
在抗原、抗体数量关系曲线中，抗体过剩区域称为抗体过剩带，抗原过剩区域称为抗原过剩带。
如图1所示，在等价带的反应液中加入过量的抗原或抗体，沉淀复合物就会有部分溶解，甚至全部溶解的现象。
这是由于新加入的抗原或抗体竞争地结合相应的抗体或抗原，使网状大分子结构破坏，形成小分子复合物，致使沉淀出现溶解，沉淀量减少甚至完全消失。
在沉淀反应中，由于抗原过量而不出现沉淀的现象，称为前带现象。
此时不能误认为无沉淀就是无抗原存在，为了检测就必须稀释抗原。
抗体过量时，称为后带现象，同理需要稀释抗体进行检测。
图1的位置
抗原与抗体的结合是依赖于两者分子结构的互补性，故其特异性高。
这种结合也是相当稳定的。
在一定条件下（过酸、过碱或浓盐存在下），二者可以分开，即结合是可逆的。
解离后的抗原、抗体的活性一般保持不变。
双向免疫扩散测定法
原理
双向扩散法（doublediffusion）又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应。
琼脂或琼脂糖凝胶是多孔的网状结构，大分
子物质可以自由通过，这种分子的扩散作用可使
分别处于两处的抗原和相应的抗体通过扩散相遇，形成抗原-抗体复合物，比例合适时出现沉淀。
由于凝胶透明度高，可直接观察到复
合物的沉淀线（弧）。
沉淀线（弧）的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小，分子结构、扩散系数和浓度等因素。
当抗原、抗体存在多种系统时，会出现多种沉淀线（弧）。
依据沉淀线（弧）可以定性抗原，诊断疾病。
此法操作简单，灵敏度高，是最为常用的免疫学测定抗原和抗血清效价的方法。
操作方法
（一）制备离子琼脂板
用10ml量筒，量取4ml融化的巴比妥离子琼脂，倒在玻璃片上，待琼脂凝固后，按图2所示的方法打孔。
图2的位置
打空后用注射器针头将孔内琼脂挑出，在酒精灯上烘烤背面，使琼
脂与玻璃板贴紧。
（二）稀释抗原和抗体
采用2倍连续稀释法。
将抗原与抗体按2的等比级数即20、21、22、23?
方式连续稀释。
方法是取试管数支，各加入稀释液（生理盐水）
一份，在于第一管中加入抗原或抗体一份，用吹吸法混匀后，吸出
一份加入第二管中,如此依次稀释到最后一管。
其稀释倍数依次是：
2，4，8?
。
（三）加样
将稀释好的抗原或抗体依次加入外周孔中，中心孔加入相应的抗体或抗原，加入的量以平琼脂表面为度或用微量进样器定量加入。
加样后置大培养皿内（皿内放有湿滤纸或湿纱布以维持湿度）。
盖好
皿盖，于24—37℃温箱内保温24—48小时。
扩散后可出现清晰的沉淀线，以出现沉淀线的抗体稀释倍数最高的一孔为被测抗体的效价。
（四）染色及保存
经染色后可提高沉淀线的可见度。
1.漂洗琼脂板：
将琼脂板置生理盐水中浸泡两天，每天更换生理盐水2次以洗去未结合的抗原或抗体。
生理盐水浸泡后，更换蒸馏水浸泡1天，换水2次以除去盐分。
琼脂板较脆易破，操作需小心。
2.干燥：
取出琼脂板，覆盖滤纸片，于室温自然干燥或吹干、烘干。
3.染色：
将琼脂板置于染色剂（0.05%氨基黑10b）中浸泡，约5分钟（*注意观察染色深度），再加5%的乙酸浸泡以脱去背景颜色
为度。
脱色后滴加少量5%的甘油至琼脂板上，置室温干燥保存。
如
欲取下琼脂薄膜，则需在干燥前浸泡在10%的甘油中（或在染色剂、脱色剂中加10%甘油），烘干后轻轻去下薄膜。
本实验用琼脂糖效果最好，琼脂粉次之，琼脂所含杂质较多时，制出的琼脂凝胶板透明度较差，影响沉淀线的观测、且重复性差，必须做净化处理后方可使用。
琼脂凝胶和玻璃片结合不紧密，样品可从样品孔下泄漏；在观察、漂洗时凝胶易于脱落。
为防止上述现象，可将玻璃板进行处理，方法是用0.1%~0.2%琼脂均匀
涂布在玻璃板上，自然干燥后再进行双向扩散实验。
在抗原、抗体单一体系中，抗原浓度不同，沉淀线特征不同。
如图
3所示
图3的位置
抗原与抗体之间相对浓度不同，出现的沉淀线特征亦不同，如图
4
所示
在抗原、抗体多种体系中，抗原与相应抗体出现的沉淀线有多条，
彼此互部干扰，如图
5所示
图4
图5
试剂和器材
1.1.5%离子琼脂
（1）琼脂的净化：
高度净化的琼脂，买来即可使用，如果不纯则需要净化处理。
取30克优质琼脂加，加热至琼脂全部融化，即成3%的
琼脂。
用
三、四层纱布热过滤，滤液流入一个搪瓷盘内，凝固后，切成1cm
见方的小块，放在大容器中，将自来水同到容器底部，流水冲洗3
天。
冲洗时于容器上捆好一层纱布，以防琼脂块顺水冲走。
然后用
蒸馏水浸泡2~3天，每天换水2~3次。
琼脂块净化后即浸没于蒸馏水中，加万分之一的硫柳汞防腐，置冰箱中保持待用。
（2）巴比妥离子琼脂的制备：
离子强度0.06，ph8.6缓冲液：
称
取10.3g巴比妥
取净化的3%
的琼脂块，加热融化后加入等体积的离子强度
0.06，
ph8.6的巴比妥缓冲液，加热混匀，即成为离子强度
0.03，ph8.6，
1.5%巴比妥离
子琼脂。
在制备离子琼脂时，可在琼脂中加入万分之一的硫柳汞防腐。
琼脂中的缓冲液，其离子强度最好比电极槽中的低1/2，这样可以避免在电泳时因电流过大引起琼脂变形（凸凹不平）。
2.
3.
4.
器材
1.
2.
3.
4.
5.
6.
微量免疫电泳
原理
免疫电泳法（immunoelectrophoresis）是把蛋白质电泳分离技术（琼脂电泳）和免疫学检测方法（双向扩散）结合起来的检测方法。
它提高了分辨率和灵敏度，是很理想的分离和鉴定蛋白质混合物的
方法。
微量免疫电泳所用的样品和抗血清较少，而且测定时间短，灵敏度高，因此应用比较广泛。
在倒有离子琼脂的饿玻璃片的中心挖一长槽，槽的两侧个挖一个圆孔，孔内加入待测样品，如图6a所示。
电泳时，样品中各蛋白质的等电点不同，其带电性质各异，因而
被分离成几个区带（如图6b所示）。
电泳后在中央槽中加入相应抗
血
清，置37℃扩散。
被分离的蛋白质与相应抗体形成大小不同、深浅各
异的沉淀弧（如图6c、d所示）。
一般情况下，每一沉淀弧即代表蛋
白质混合液中的一种成分，以此定性或半定量。
图6
操作方法
（一）制备离子琼脂板
将前述实验的离子琼脂加热融化，取4ml倒在玻璃板上，凝固后按图7所示打孔和打槽，用注射器针头将孔内琼脂挑出。
槽内琼脂在电泳分离以后在挑出，以免电泳时横槽变形影响双向扩散。
图7
（二）电泳
于两个电泳槽中防入离子强度为0.06，ph8.6的巴比妥缓冲液。
将琼脂板平置于两个电极槽之间，为使电路连通，于缓冲液的液面到
琼脂板之间，用单层滤纸或纱布搭桥形成通路，接通电源加10v电压，用小滴管取样品注入琼脂板孔内，假样量与孔平或稍少，调电
压至100~150v，通电40~60分钟，当血清中色素泳动到距边缘约1.5cm时，断电，取出琼脂板，用注射器针头将横槽中的琼脂挑出，
加抗血清，水平置于湿盒（或培养皿中），于37或24进行双向扩
散24-48小时后，取出观察实验结果。
（三）染色
参看双向免疫扩散法实验。
在免疫电泳实验中的琼脂电泳分离法，可用其他蛋白电泳技术代替，
如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳法等。
电泳后切下相应的胶带置于玻璃板上，倒上离子琼脂。
当凝胶与胶带紧密帖在一起并凝固后，在距胶带约0.5cm处打横槽，
挑出琼脂，加抗血清进行双向扩散。
由于不同电泳方法对蛋白质抗原的浓度要求不同，要根据抗原、抗体沉淀反应的合适比例稀释抗血清。
沉淀弧的曲度大，说明该种蛋白质的含量较高，电泳时扩散也较为严重之故。
曲度对称说明蛋白质分子均一，不对称似直线或直线上有小弧，说明蛋白质分子不均一。
电泳时一般稳压在100~150v范围，电流可用凝胶板两侧滤纸桥的层数加以调节，一般一层滤纸即可，电流过大致使凝胶发热，水分蒸发快，影响电泳效果。
凝胶中缓冲液浓度为电极缓冲液的一半，这样可减少电流的作用，也可增加蛋白质的泳动速度。
要根据样品鉴定的不同要求，选择抗血清。
检测蛋白质混合液（如血清或组织粗提液）中所需成分的存在及多寡，需用纯样品制备的抗血清和用混合液制备的抗血清对照检测，如图8。
【篇二：
免疫实验考试复习】
实验复习题
一、选择题：
1.夹心elisa法检测hbsag时，用于包被固相载体的物质是：
c
a.纯化的hbsagb.
酶标记的hbsagc.
纯化的hbsab
d.酶标记的hbsabe.
辣根过氧化物酶
2.间接elisa法检测hbsab时，用于包被固相载体的物质是：
a
a.纯化的hbsagb.
酶标记的hbsagc.
纯化的hbsab
d.酶标记的hbsabe.
辣根过氧化物酶
3.血型鉴定实验时，待检红细胞悬液与抗
a抗体混合发生凝集，与
抗b抗体混合未发生凝集，则待检血的血型是：
a
a.a型b.b型c.ab型年d.o型e.不能确定
4.血型鉴定实验时，待检红细胞悬液与抗
a抗体混合不发生凝集，
与抗b抗体混合发生凝集，则待检血的血型是：
b
a.a型b.b型c.ab型年d.o型e.不能确定
5.不属于人工主动免疫制剂的是（c）
a.乙肝疫苗b.白喉类毒素c.破伤风抗毒素d.百日咳疫苗e.脊髓灰质炎疫苗
6.不属于人工被动免疫制剂的是（e）
a.破伤风抗毒素b.血浆免疫球蛋白c.胎盘免疫球蛋白d.静脉注射用免疫球蛋白e.白喉类毒素
二、填空：
对流免疫电泳实验，电泳时抗原端接
三、名词解释
阴极，抗体端接阳极。
1.沉淀反应（precipitationreaction）
毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，
出现肉眼可见的沉淀物。
2.凝集反应（agglutinationreaction）
细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒状物质与相应的抗
体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。
3.免疫标记技术（immunolabelingtechniques）
是将抗原抗体反应与标记技术相结合，以检测抗原或抗体的一类试验方法。
4.人工主动免疫（artificialactiveimmunization）
用疫苗接种机体，使之产生特异性免疫，从而预防干扰的措施。
5.人工被动免疫（artificialpassiveimmunization）
是给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂，以治疗或紧急预防感染的
措施。
四、问答题
1.简述e-花环试验的基本原理。
人Ｔ细胞膜上具有能与绵羊红细胞（srbc）上lfa-3（淋巴细胞功能相关抗原－3）结合的受体（Ｅ受体，即cd2分子）。
srbc与Ｔ细胞
在含有血清的平衡盐水中结合，形成以Ｔ细胞为中心，四周环绕srbc，状如环瑰花环细胞集团，故称Ｅ花环试验。
2.简述cdc试验的基本原理。
细胞表面抗原与相应抗体特异结合所形成的免疫复合物，通过经典
途径激活补体而导致细胞膜穿孔。
因此水溶性染料如台盼蓝进入受损细胞，染成蓝色，为阳性反应；不带相应抗原的细胞。
未受伤，不染色，为阴性反应。
3.简述elisa的基本原理。
先将已知抗体包被在固相上，洗去未吸附的抗体；加入待检标本，
充分作用后，标本中相应的抗原与固相上已知抗体结合，洗去未结合的抗原成分；加入已知的酶标抗体，再洗去未结合的酶标抗体；加底物后，酶分解底物后产生呈色反应。
【篇三：
常见免疫学试验技术】
免疫学实验
实验一与免疫相关的细胞形态的观察
目的要求：
观察与免疫相关的几种细胞的形态，了解它们在机体免疫反应中的作用。
实验器材：
显微镜
血液涂片（瑞氏染色）
结缔组织切片
方法：
油镜观察
一．血涂片的观察
（a）红细胞：
淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为双凹形，故边缘部分染色较深，中心较浅，直径7—8微米。
（b）颗粒白血球
嗜中性颗粒白血球：
体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1—5叶，核叶之间联以染色质细丝，染色质染成粉色，其中充
满细小的大小均匀的颗粒被染成紫红色。
直径10—12微米。
嗜酸性颗粒白血球：
略大于嗜中白血球，细胞核染成紫色，通常为
2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。
直径10—15
微米。
嗜碱性颗粒白血球：
体积略小于嗜酸性白血球，细胞质中有大小不
等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球的颗粒少，核为1—2叶染成淡兰色。
直径10—11微米。
1
（c）无颗粒白血球
淋巴细胞：
涂片中可观察到中、小型两种。
小淋巴细胞与红血球大小相似，圆形。
其中含致密的核，染成深紫色。
周围仅有一薄层嗜硷性染成淡蓝的细胞质。
中淋巴细胞较大，有较宽层的细胞，核圆形。
6-8微米。
单核细胞：
体积最大，细胞圆形。
胞质染成灰蓝色。
核呈肾形或马
蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。
直径14-20微米。
二．肥大细胞的观察（示教）
胞体较大，呈卵圆形，胞质内充满粗大均等的嗜硷性颗粒。
其中含肝素、组织胺等物质。
常成群地分布于血管的周围。
三．浆细胞的观察（示教）
细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜硷性。
核圆形，着色深，多偏于细胞的一侧，染色质核膜呈车轮分布。
正常组织浆细胞少，慢性炎症时增多。
浆细胞合成和分泌抗体，对免疫有重要意义。
四．巨噬细胞：
又称组织细胞，细胞形态不规则。
常伸出短而钝突起，有很强的吞噬能力。
附：
瑞特氏染色：
1．染色液配置
称取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。
贮褐色瓶中备用。
（配置时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料
溶液得更好。
）
2．瑞特氏染色法：
取小鼠骨动脉血，涂制玻片。
干后用玻璃笔在涂处之两侧划线（限
制染液流掉）。
于划线内部滴加染液3-4滴，经3-5分钟后，再滴加
等量的蒸馏水，轻轻晃动混合。
经5分钟后，用蒸馏水洗净，待干后用油镜检查。
2
实验二沉淀反应
可溶性抗原与相应的抗体混合，在电解质存在的条件下，两者比例
适合，即可有沉淀物出现，叫沉淀反应（precipitation）.由于沉淀反应抗原多系胶体溶液。
沉淀物主要是由抗体蛋白所组成。
为了求得抗原与抗体的适宜比例，保证有足够的抗体，而且抗原分子小，具有较大的反应面积，因此操作上通常是稀释抗原，不稀释抗体。
沉淀反应的种类有环状沉淀、絮状沉淀、荚膜膨胀、琼脂扩散及免疫电泳等。
此外还有放射性同位素标记、酶标记等测定法。
（一）环状沉淀反应
当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。
材料：
1.
2.
3.免疫血清：
免疫兔抗人血清抗原：
人血清小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。
方法：
1.取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2毫升，加入第一管，加时注意不能有气泡。
2.
3.以毛细吸管吸取生理盐水0.2毫升加入第二管。
用毛细吸管吸入血稀释0.2毫升加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混。
4.
性。
置室温中10—20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环，若有则为阳
3
（二）.琼脂扩散试验
琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。
抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。
这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。
如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独
立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。
琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳试验。
（1）
材料：
1
．诊断血清（抗体：
抗人igg或iga免疫血清）
2
．待检血清（抗原）：
人血清
3
．参考血清：
全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免
疫球蛋白含量不同）。
4
．其它：
生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒
等。
方法：
1
．将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃
水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。
2
．在免疫琼脂板上按一定距离（1.2—1.5厘米）打孔，见图1。
单向琼脂扩散试验
图1单向琼脂扩散试验抗原孔位置示意图
1-5孔加参考血清，6-7孔加待检血清
4
3
．向孔内滴加1：
2，1：
4，1：
8，1：
16，1：
32稀释的参考血
清及1：
10稀释的待检血清，每孔
10微升，此时加入的抗原液面应
与琼脂板一平，不得外溢。
4
．已经加样的免疫琼脂板置湿盒中
37℃温箱扩散24小时。
5
．测定各孔形成的沉淀环直径（mm）,用参考血清各稀释度测定值绘
出标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。
（2）
材料：
1．诊断血清：
兔抗人血清
2．待测血清：
人血清
3．阴性对照血清
4．其它：
生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。
方法：
1．取一清洁载玻片，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。
2．凝固后，用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。
孔的排列方式如图2所示。
双向琼脂扩散试验
图2双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图
3．用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。
加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
4．加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。
5
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