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药学本科毕业论文
沈阳药科大学
本科毕业论文
论文题目:
化合物A联合化合物B对人肝癌HepG2细胞作用机制研究
起止时间:
2014年10月26日—2015年6月20日
姓名学号：
学院专业：
年级班级：
指导教师：
XXX副教授
实习单位：
XXX大学生命科学与生物制药学院药理系
中文摘要······································································1英文摘要······································································2
第1章绪论··································································3
1。
1细胞凋亡·····························································3
1。
2立题依据·····························································5
第2章实验部分······························································6
2。
1实验材料·····························································6
2.2实验方法·····························································7
2。
3实验结果····························································12
第3章结论与讨论···························································17
3.1结论································································17
3.2讨论································································18
参考文献·····································································21致谢·········································································23
摘要
原发性肝癌是世界常见的恶性肿瘤之一，也是我国的高发恶性肿瘤，由于不易被早期诊断，进展迅速，术后容易复发、转移，因此预后较差.目前肝癌仍以外科手术为公认首选和主要的治疗手段，但由于很多肝癌患者确诊时已是中晚期,失去了手术治疗的机会并于诊断后1年内死亡,手术切除率<30％，术后总体5年生存率仅30％~40％。
对于可手术的肝癌患者,术后复发、转移是影响治疗效果及预后的主要因素，对于不能手术的中晚期肝癌患者尚缺乏有效的治疗方法。
传统的化疗、放疗对肝癌疗效欠佳，目前仍缺乏行之有效的化学预防和治疗靶位［1］。
因而本课题是对化合物A联合化合物B对人肝癌HepG2细胞作用机制研究.
本实验首先用MTT法分别测得不同浓度的A和B单独处理HepG2细胞及不同浓度的A和B联合用药处理HepG2细胞死亡的影响。
结果表明不同浓度的A和B单独处理HepG2细胞,增值抑制程度表现为时间剂量依赖效应，并且在A6μmol/L联合B100μmol/L协同作用最为显著。
流式细胞仪检测细胞凋亡率显示,联合用药组凋亡率升高更为明显。
WesternBlot法检测蛋白显示，促凋亡相关蛋白Bax、FADD增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少.
关键词联合用药，细胞凋亡,作用机制
Abstract
Hepatocellularcarcinoma（HCC）isthemostcommoncancerintheworldandanincreasedmalignantillnessinourcountry.Becauseofitsaggressivebiologicalbehavior,rapidlyprogressesanddelayeddiagnosis，thismalignancyhasagrimprognosisevenfollowingsurgicalresectionandhashighdisease-recurrence。
SurgeryisthefirstandmostcommontherapyofHCC。
Unfortunately,thediseaseisusuallydetectedatanadvancedstage，andthemajorpatientslosethechanceofsurgery，diewithin1yearafterthediagnosisoftheirdisease。
Relativesurvivorare<30％and30%～40%respectively.Thehighdiseaserecurrenceandmetastasisaretheimportantreasonsforeffectandprognosis.Curativetherapiesareleasteffectiveforsurgicallycases.Forthesepatients，medicaltreatments,includingchemotherapy,chemo—embolization，ablation，radiotherapy,remaindisappointing。
Clearly，thereisanurgentneedfornewtherapiesforthisaggressivediseasebecauseeffectivepreventandtargetsoftherapyareunavailable.ThereforethisissueisthemechanismoftheJointDrugB，DrugA，onHepG2cellsissignificant。
ThisarticleassessedtheeffectsofdrugAalone，drugBaloneandcombinationofdrugAanddrugBonHepG2cellswithMTTassay,suggestingthatAandBhaveamaximalcombinationaleffectatthedoseofA6μmol/LandB100μmol/L，respectively。
WesternBlottinganalysisindicatesthatpro-apoptosisproteinsincludeBAXandFADDareincreasingandanti-apoptosisproteinBCL—2isreducing.
KeywordCombination,apoptosis,themechanismofaction
第一章绪论
1.1细胞凋亡
细胞凋亡定义、意义、形态学特征、作用通路、机理
1。
2立题依据
先介绍下肿瘤的危害,再介绍下肝癌HCC（hepaticcellcarcinoma）的危害。
虽然有些临床治疗药物具有一定的疗效，但同时也会加重肝脏的损害.因此治疗肝癌药物与保肝药物合用起到减毒增效的作用对肝癌患者具有极其重要的临床意义。
药物A是一种独特的多靶点抗肿瘤药物，既抑制肿瘤细胞增殖又抑制了肿瘤血管的形成,从而抑制肿瘤的转移。
DrugA属于多酶抑制剂，能抑制RAF-1、BRAF丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，以及血管内皮生长因子（VEGF-2、VEGF—3）、血小板衍化生长因子（PDGF）、受体酪氨酸激酶KIT、FMS样酪氨酸激酶-3（FLT—3）等多种受体的酪氨酸激酶活性.DrugA具有抑制肿瘤细胞增殖和血管形成的双重作用，即它一方面可以抑制受体酪氨酸激酶KIT和FLT-3以及RAF/MEK/ERK途径中丝氨酸/苏氨酸激酶，抑制肿瘤细胞增生；另一方面它可以通过上游抑制受体酪氨酸激酶VEGFR和PDGFR,及下游抑RAF/MEK/ERK途径中丝氨酸/苏氨酸激酶，抑制肿瘤新生血管的形成和切断肿瘤细胞的营养供应而达到遏制肿瘤生长的目。
因此它可以起到抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤细胞增值的双重作用。
但在治疗的同时，药物A也会使患者的转氨酶短暂性升高（22%）、酯酶增加等，因此能加重对肝肾功能的损害.
药物B能够抑制肿瘤受体型酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase，RTK）的活性,包括表皮生长因子受体1（epidermalgrowthfactorreceptor1，EGFR）和胰岛素样生长因子1受体（insulin—likegrowthfactor1receptor，IGF-1R）及其下游信号分子的活化.此外,药物B可以选择性清除羟自由基（•OH），且对NF—κB有明显的抑制作用。
研究表明，药物B有明显的保护和稳定肝细胞的作用,用于治疗急慢性肝炎、肝硬化、肝中毒等病。
对肝炎患者症状、肝功能均有明显的改善。
在临床上的应用为对肝脏的保护作用.临床试用表明该药作用强，疗效显著。
第二章实验部分
2.1实验材料
一、细胞
人肝癌HepG2细胞购于AmericanTypeCultureCollection（ATCC，Rockville，MD，USA）。
接种在含10%胎牛血清、2％谷氨酰胺的1640培养液中，在37℃,5%CO2培养箱中培养。
二、药品及试剂
DrugA、DrugB于无菌条件下，DMSO溶解后，用1640培养液稀释至所需浓度。
1640培养基，美国Gibco公司（GrandIsland，NY，USA）;胎牛血清，购于北京元亨圣马生物技术研究所；胰蛋白酶、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、Hepes、二甲基亚砜（DMSO）、甲基噻唑蓝（MTT）、碘化丙啶（PI）、丹磺酰戊二胺（monodansylcadaverine，MDC）、RNase、ProteinK、琼脂糖、溴酚蓝、二氨基联苯胺和ECL试剂盒购于美国Sigma公司。
抗p-ERK、ERK和β—actin的抗体，及辣根过氧化酶标记的二抗，购于美国SantaCruzBiotechnology公司（SantaCruz,CA,USA）。
三、仪器
二氧化碳培养箱（NuAir，Plymouth，MA,USA），酶联免疫分析仪（Tecan，Salzburg,
Austria），6孔、24孔与96孔培养板（Nunc，Roskilde，Denmark）,倒置相差显微镜（Leica,
Bensheim,Germany），荧光显微镜（Olympus，Tokyo，Japan），流式细胞分析仪（Becton
DickinsonFACScan，Franklinlakes,NJ，USA）,DYY—2型稳压稳流电泳仪，DYY-III28A
型蛋白质电泳仪，DYY-III40B电泳槽（北京六一仪器厂）。
2。
2实验方法
一、不同浓度的DrugA和DrugB单独处理HepG2细胞及DrugA和DrugB联合用药处理HepG2细胞死亡的影响
四甲基偶氮唑［3—（4,5—dimethylibiazol—2-yl）—2，5—diphenyl—tetrazoliumbromide,MTT]是一种能接受氢原子的染料。
可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下tetrazoliu环开裂，生成蓝紫色的结晶甲臜（formazan），甲臜结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
用DMSO溶解甲臜后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。
取HepG2细胞，密度为6×103个/孔，接种于96孔培养板中，培养24h后加入不同浓度的DrugA和DrugB及DrugA、DrugB联合用药培养24h后，加入不同浓度DrugA作用6h、12h、24h、36h、48h以MTT法测定细胞死亡率。
按下列公式计算:
死亡率（%）=［A492（阴性对照）－A492（加药组）］/A492（阴性对照）×100
二、细胞形态的观察
细胞凋亡的形态改变是多阶段的，其显著特征表现为:
首先是细胞膜突起、细胞体积缩小；接着部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落;最后被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬.凋亡过程中，磷脂酰丝氨酸外翻；细胞核内染色质浓缩、边缘化、DNA发生有序裂解，形成180-200bp的整数倍片断。
取对数生长期的HepG2细胞，密度为6×103个/孔，接种于96孔培养板中，培养24h后，加入不同浓度DrugA作用24h,在倒置相差显微镜观察细胞形态。
三、细胞荧光染色的观察
吖啶橙（AO）能够将凋亡细胞核或细胞质染色成可见致密浓染的黄绿色，在380nm激发光下发出黄绿色亮光。
以每孔2×104个细胞的密度接种于24孔板中,培养24h后，加入不同浓度的DrugA与不同浓度的DrugB作用24h后，去培养液，用PBS洗一次。
加入稀释1000倍的AO于37℃避光染色
1h，于激发波长为380nm，发射波长为525nm的荧光显微镜下拍照。
四、流式细胞分析细胞周期
PI（碘化丙啶）为核酸嵌入型染料，可嵌入双股螺旋多核苷酸结构，故DNA和RNA均可着色。
PI不能穿过活细胞膜，故活细胞拒染;但能穿过死细胞膜，使之着色。
PI鉴别细胞死活的灵敏度很高。
因此,在流式细胞术中常用PI测定细胞活力。
以每瓶2×105个细胞的密度接种于6孔板中，培养24h后分别加入6µΜ·L—1的DrugA，100µΜ·L-1的DrugB，及两药联合作用组，作用24h后，收集细胞,用PBS清洗一次.然后用70%乙醇固定过夜。
次日将单细胞悬液离心弃去固定液，用PBS洗涤1—2次，加入50mg/L（0.1%RNase）,PBS配PI染色液1。
0mL,置4︒C避光染色1h后用流式细胞仪分析，测定细胞凋亡情况。
五、Westernblotanalysis（免疫印迹法）［5,6]
Westernblot是一种蛋白质的固定和分析技术。
将已用聚丙烯酰胺凝胶或其他凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上。
固定在滤膜上的蛋白质成分保留抗原活性及与其它大分子物质特异结合的能力，所以能与特异的抗体或核酸结合。
第一抗体与特异性抗原决定簇结合，再用经标记（同位素或非同位素）的第二抗体来测检。
1。
工作液的配制
1）丙稀酰胺和N,N'－亚甲基双丙稀酰胺储存液。
使用去离子水配制含有29%（W/V）丙稀酰胺和1％（W/V）N，N’－亚甲基双丙稀酰胺储存液。
2）用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液.制备这些缓冲液必须使用Tris碱。
用Tris碱完全溶于去离子水后,用HCl调节溶液的pH值。
分离胶缓冲液：
1.5mol/LTris—HCl（pH8。
8）
积层胶缓冲液:
1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）
3）十二烷基磺酸钠（SDS）：
用去离子水配成10％的储存液室温备用.
4）过硫酸铵。
用去离子水配制少量的10％（w/v）的储备液保存于4℃,由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。
5）Tris－甘氨酸电泳缓冲液。
25mmol/LTris碱，250mmol/L甘氨酸（电泳级），0。
1%SDS,可配成5×储存液备用.即在900ml去离子水中溶解15。
1gTris碱和94g甘氨酸，然后加入50ml10%（w/v）的电泳级的SDS储存液，用去离子水补至1000ml量则成5×储存液。
6）细胞裂解液:
50mmol/LHepes（pH7.4）,1％Triton—X100，100mmol/LNaF,1mmol/LEDTA，1mmol/LEGTA，2mmol/L正钒酸钠，1mmol/LPMSF,使用前加入：
10μg/ml（aprotinin，leupeptin，pepstatinA）。
7）加样缓冲液：
50mmol/LTris—HCl（pH6.8），100mmol/L二巯基乙醇（2—ME）,2％SDS，0。
1％溴酚蓝，10％甘油。
8）转移缓冲液：
3。
64gTris碱,17。
3g甘氨酸加入240ml甲醇，用去离子水补至1200ml。
9）10×丽春红染料：
2g丽春红S,30g三氯乙酸,30g磺基水杨酸加水至100ml。
10）封闭液:
5％脱脂奶粉，0.01％Tween-20,0。
02％叠氮化钠溶于PBS溶液中。
11）无磷酸盐，无叠氮化钠封闭液：
5％脱脂奶粉,150mmol/LNaCl，50mmol/LTris—HCl（pH7。
5）。
12）二氨基联苯胺溶液：
9ml0.01mol/LTris—HCl（pH7。
6）溶液中溶解6mg二氨基联苯胺，向其中加入1ml0.3%CoCl2。
2.蛋白质电泳
1）按Tab。
2—2A配制15％，12%或10％的丙稀酰胺分离胶，依次混合各成分，一旦加入TEMED，马上开始聚合，立即快速旋转混合物灌制在电泳槽的两玻璃板之间,留出灌制积层胶所需的空间.在分离胶上覆盖一层异丙醇，将凝胶垂直放置在室温约30min。
分离胶完全聚合后，清除异丙醇用去离子水洗3次，用滤纸吸去水，按Tab。
2—2B配制积
2）层胶，加入到电泳槽后立即插入干净的样品梳。
3）在积层胶聚合时可把收集的DrugA和DrugB联合用药处理过的细胞用细胞裂解液在冰浴上裂解60min，7，000×g离心10min，取上清加入2×的上样缓冲液，在沸水浴中加热5min使蛋白质变性，采用Bio-Rad蛋白浓度测定液测定样品中蛋白浓度，并调整各样品的浓度相同。
4）积层胶聚合完全后,在电泳仪中加满1×的电泳缓冲液，将样品按预定的顺序加到样品孔中开始电泳，样品在积层胶时电压为75V，待样品泳到分离胶时将电压调至180V.
3.免疫印迹
1）SDS聚丙稀胺凝胶电泳结束后,将胶放置到转移缓冲液中浸泡30min，切6张Whatman3MM滤纸和1张硝酸纤维素膜，与凝胶大小相符合.将硝酸纤维素膜浸在去离子水中除去气泡。
2）将凝胶按叠成“三明治”状,插入转移池中，凝胶一面接阴极,15V转移过夜。
3）转移后的硝酸纤维素膜进入丽春红S染液中5—10min,期间轻轻摇动，蛋白带子出现后用去离子水漂洗数次，用防水墨汁标记出标准蛋白分子量的位置。
4）将膜放入小盒中，按0.1ml/cm2加入封闭液，封闭4h.
5）再按0.1ml/cm2加入含第一抗体的封闭液，室温过夜,（各种抗体稀释倍数如Tab.3—2）.
6）回收一抗，用PBS漂洗膜3次，每次10min，将膜转移到含150mmol/LNaCl，50mmol/LTris—HCl（pH7.5）的溶液中摇动10min。
7）按0。
1ml/cm2加入含第二抗体的无磷酸盐及无叠氮化钠的封闭液中，其中以辣根过氧化酶标记的二抗稀释1,000倍.
8）以用150mmol/LNaCl,50mmol/LTris—HCl（pH7.5）溶液漂洗3次，每次10min，再将膜放入10ml二氨基联苯胺溶液中（含10μl30％的H2O2），约5min后可观察到蛋白带子的出现，待其颜色达到要求,用常水略漂洗,扫描图片保存。
Table2—2A配制电泳分离胶所用溶液
溶液成分
15ml凝胶
30ml凝胶
10％
蒸馏水
5。
9
11。
9
30％丙稀酰胺溶液
5.0
10。
0
1。
5mmol/LTris（pH8.8）
3.8
7。
5
10%SDS
0.15
0.3
10%过硫酸铵
0。
15
0。
3
TEMED
0.006
0.012
12％
蒸馏水
4。
9
9.9
30％丙稀酰胺溶液
6.0
12。
0
1.5mmol/LTris（pH8。
8）
3。
8
7.5
10%SDS
0.15
0。
3
10％过硫酸铵
0.15
0.3
TEMED
0.006
0。
012
15％
蒸馏水
3。
4
6.9
30％丙稀酰胺溶液
7.5
15.0
1.5mmol/LTris（pH8。
8）
3。
8
7.5
10%SDS
0.15
0。
3
10%过硫酸铵
0.15
0。
3
TEMED
0.006
0。
012
Table2—2B配制Tris—甘氨酸SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳5％积层胶所用溶液
溶液成分
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
4
5
6
8
10
蒸馏水
2。
7
3.4
4。
1
5。
5
6.8
30％丙稀酰胺溶液
0。
67
0。
83
1.0
1。
3
1。
7
1.0mmol/LTris
（pH6。
8）
0。
5
0.63
0.75
1.0
1.25
10％SDS
0.04
0.05
0。
06
0。
08
0。
1
10%过硫酸铵
0.04
0。
05
0。
06
0。
08
0.1
TEMED
0。
004
0.005
0。
006
0.008
0。
01
Table2-2C蛋白质电泳应用抗体
Antibodies
TypeofIgG
Dilution
β—actin
MousemonoclonalIgG
1:
1000
ERK
rabbitpolyclonalIgG
1:
400
P—ERK
BAX
BCL-2
FADD
rabbitpolyclonalIgG
rabbitpolyclonalIgG
rabbitpolyclonalIgG
rabbitpolyclonalIgG
1：
300
1:
600
1:
800
1:
1000
secondaryantibody
goatanti—rabbitIgG-HRP
1：
5000
secondaryantibody
goatanti-mouseIgG—HRP
1：
10000
2.3实验结果
1.DrugA时
升级会员 