TaCAD12和TaPKR1过量表达转基因小麦的分子特性与功能分析.docx
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TaCAD12和TaPKR1过量表达转基因小麦的分子特性与功能分析
TaCAD12和TaPK-R1过量表达转基因小麦的分子特性与功能分析
关键词：
转基因小麦；小麦纹枯病；TaCADl2；TaPK-R1
Ⅱ
万方数据
TheanalysisofTaCADl2andTaPK-R1overexpresstransgenicwheatlineswithcharacterizationandfunction
LuoMei—ying
（CollegeofAgriculture，GuangxiUniversity,Nanning530004，China）
Abstract
WheatisthemainfoodcropsinChina．Wheatsharpeyespotisasoil—bornediseasecausingmainlybyRhizoctoniacerealis．Freezingistheoneofthemainnaturaldisasterstoaffectthegrowthofwheat．Wheatcultivarsresistanttosharpeyespotandfreezingwere
veryscarce，thereforeitisimportantsignificancetothatisolationandclonedresistancetoanti-R．cerealisfreezinginjurygenes，studiesitsfunction，providingtheoreticalbasisforbreedingoftolerancetobothabioticandbioticstress．Inthisstudy,weconstructionofthe
expressionvectorandembryocalliofwild-typewerebombardedbythegoldparticlecontainingp20一Rssp2897：
6MYC-TaCAD12andpAHC25一MYC—TaPK-R1vectorDNA．achievedtheTaCADl2andTaPK-R1transgenicwheatlines．
ThemainresultsofTaCADl2transgenicwheatlinesareasfollows：
（1）TransgenicwheatplantsinTo-T2generationsweresubjectedtoPCR，andqRT-PCRanalyses．Fivetransgenicwheatlineswereobtained．
（2）Westernblotanalysisshowedthatfivetransgenicwheatlinesc—MYC—TaCADl2fusionproteinswereexpressed．（3）SharpeyespotseverityassessmentsanalysisshowedthatthetransgenicwheatplantsexpressingTaCADl2displayedsignificantlyenhancedresistancetosharpeyespotcomparedwithnon-transgenicwheatWT．
ThemainresultsofTaPK-R1transgenicwheatlinesareasfollows：
（1）AnalysesofthetransgenicwheatplantsinTo—T4generationswithPCR，RT-PCRandqRT-PCR，andthreetransgenicwheatlineswereobtained．
（2）Westernblotanalysisshowedthatfivetransgenicwheatlinesc-MYC—TaPK—R1fusionproteinswereexpressed．（3）Wewere
III
万方数据
statisticalitssurvivalrate，observationalofprolinecomemandelectrolyteleakagerateafterfreezingthetransgenicwheatplantsinT4generations，theresultsshowedthatTaPK-R1overexpressiontransgenicwheatlinesadaptabilitytocoldenvironment．（4）After
inoculation丽thR．cereal&virulent-isolationsR0301andWK207，thesharpeyespot
resistancetestsshowedthatthetransgenicwheatplantsexpressingTaPK-R1displayedsignificantlyenhancedresistancetosharpeyespotcomparedwithnon-transgenicwheatWT．（5）AfterinoculationwithR．cerealisandfreezingstress，threeTaPK-RItransgenicwheatlinesdefensesharpeyespotandfreezingtolerancewereobtained．
Keywords：
Transgenicwheat；wheatsharpeyespot；TaCADl2；TaPK-R1
IV
万方数据
1前言．．1
1．1概述．1
1．2植物抗病机理的主要研究进展．．1
1．2．1小麦纹枯病研究进展一3
1．2．2冻害研究进展一5
1．3研究纹枯病的重要性．7
1．4本研究的目标．7
1．5技术路线．9
2转TaCADl2基因小麦的分子检测与功能分析．10
2．1材料与方法．11
2．1．1材料．11
2．1．2方法12
2．2结果与分析19
2．2．1转TaCADl2基因小麦的获得19
2．2．2转TaCADl2基因小麦的PCR检测19
2．2．3TaCADl2在转基因小麦株系叶鞘中的转录分析20
2．2．4转基因植株的Westernblot分析．21
2．2．5转基因小麦的纹枯病抗性鉴定．22
2．3讨{仑23
2．4结{仑24
3转TaPK-R1基因小麦的分子检测与功能分析．25
V
万方数据
3．1材料与方法26
3．1．1材料．26
3．1．2方法27
3．2结果与分析32
3．2．1TaPK-R1转基因小麦的获得．32
3．2．2转TaPK-R1基因小麦的PCR检测．32
3．2．3TaPK-RI在转基因小麦株系中的转录分析33
3．2．4低温胁迫条件下TaPK-R1基因的表达特征分析34
3．2．5电解质渗漏率（相对电导率）的测定．35
3．2．6脯氨酸含量的测定．36
3．2．7转基因植株的Westernblot分析．37
3．2．8低温胁迫表型鉴定与存活率统计．37
3．2．9转基因小麦的纹枯病抗性鉴定．39
3．3讨论40
3．4结论、42
4全文结论．．42
4．1转TaCADl2基因小麦的分子检测与功能分析．．42
4．2转TaPK-R1基因小麦的分子检测与功能分析43
致谢．．44
参考文献46
VI
万方数据
英文缩略表
英文缩写英文全称中文名称
bpbasepair碱基对
CTABcetyltrimethylammoniumbromide十六烷基三甲基溴化铵CADcinnamylalcoholdehydrogenase肉桂醇脱氢酶DEPCdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯
oI江openreadingframes开放阅读框
IU’-PCRReversetranscriptionPCR半定量反转录PCRqRT-PCRQuantitativereversetranscriptionPCR定量反转录PCRWT、Ⅳild．锣pe野生型
VII
万方数据
亡堕盔堂塑主苎垡鲨壅丝堡趔星塑丝旦生丝塾量壅整整叁垦尘童垫坌至笪丝量盈整坌堑
1前言
1．1概述
小麦是世界重要的粮食作物。
小麦纹枯病是我国乃至世界小麦主产区的主要土传病害，主要由腐生型真菌禾谷丝核菌（尺办fzDc幻甩肠cerealis）引起。
禾谷丝核菌能感染小麦的茎、鞘，导致运输小麦生长所必需的营养物质受阻。
小麦纹枯病严重影响中国小麦的品质和产量。
自2005年一2015年，我国每年均有1．O—1．2亿亩小麦遭受纹枯病的侵害，导致小麦减产，所造成的经济损失年均在10亿以上（Chenetal，2008；Liuetal，2009a）。
冻害是影响小麦生长最主要的自然灾害之一，特别是近年气候变化和
“倒春寒"的时常发生，严重影响春性较强小麦的生产，造成减产，甚至颗粒无收（梁宜策等，2003）。
植物细胞之间的信号分子的释放、信号识别、信号传递等主要通过蛋白激酶催化蛋白质的可逆磷酸化来完成。
Chenk和Stone等人的研究表明，细胞的信号识别与转导主要依赖蛋白质磷酸化和去磷酸化，磷酸化和去磷酸化涉及植物体内的呼吸与代谢、细胞生长、细胞分裂过程中染色体的移动和收缩环的产生、植物组织分化、基因转录、蛋白翻译表达、神经递质的合成与释放、癌变等诸多生理和病理过程，是生物体中广泛存在的调节机制之一（Chenketal，1999；Stoneetal，1995）。
蛋白质的磷酸化是一个耗能过程，需要消耗ATP，其原理是ATP或GTP上的y位点的磷酸基团被蛋白激酶转移到底物氨基酸残基上；蛋白激酶的催化区域一般含250～300个氨基酸，11个保守的亚区（Chenketal，1999；Stoneetal，1995）。
根据其底物蛋白的种类，可将在真核生物中己知的蛋白激酶分为丝氨酸／苏氨酸（Ser／Thr）、酪氨酸（Tyr）、组氨酸、色氨酸、天冬氨酰基／谷氨酰基5类蛋白激酶。
植物中发现的蛋白激酶以丝氨酸／苏氨酸（Ser／Thr）、
酪氨酸（Tyr）、组氨酸3类为主，根据蛋白激酶催化区域氨基酸序列的相似性，可分
为：
AGC组、CaMK组、CMGC组、PTK组和其它组5大组（Stoneetal，1995）。
1．2植物抗病机理的主要研究进展
真菌、细菌、病毒和线虫是植物病害（Plantdisease）的主要病原，植物病害主要指病原物侵染植物体后通过影响植物生理生化反应，最终导致生长发育受到阻碍等一系列传染性危害。
抗病基l习（Resistancegenes，R．genes）系统是植物与病原物相互作用的长期进化过程中逐渐产生，抗病基因的表达调控使植物对病原物的侵染表现出一系列的
万方数据
￡堕查堂亟圭堂垡鲨塞丝曼趔星塑丝旦止笪塾量表达转基因小麦的分子特性与功能分析
防御反应（Dewitpetal，1997）。
植物抗病性是植物与病原相互作用的结果，当病原与植物表面接触后，植物抗病
基因通过一系列的表达调控，吞噬细胞将病原吞噬或产生有功能的产物使病原失活的过程。
植物抗性分为非寄主抗性和寄主抗性两大类，前者包括物理和化学抗性，是植物抗性的重要组成部分，属于基础抗性。
物理抗性包括由微管与各种微纤丝组成的细胞骨架、细胞壁的完整性、细胞质膜的通透性等。
Kobayashi等的研究表明，用细胞松弛素处理大麦细胞，大麦细胞的通透性增大，大麦细胞被豌豆白粉病菌（Erisiphepisi）
等侵染，非寄主抗性丧失（Kobayashietal，1997）；无独有偶，Yun等的研究表明，在拟南芥对小麦禾布氏白粉菌（Blumeriagraminisf．sp．tritici）抗性研究中，诱导肌动蛋白合成基因突变，拟南芥对该病菌的非寄主抗性丧失（Yunetal，2003）。
张晓媛等的研究表明，病原微生物与植物接触后，通过一系列的信号识别、转导，突破植物的基础
抗性后，诱导植物防御反应（张晓媛等，2009）。
王磊等研究表明，病原微生物与植物之间的信号识别，分别来源于“基因对基因”互作模式和协同进化，分别是广谱的抗病性模式、R基因和Av基因相互识别（王磊，2010）。
抗病基因的作用机理是近一个世纪的研究热点。
（1）1942年，HaroldH．Flor在研究亚麻锈病时发现，具有无毒力基因（aⅥgene）的病原菌与有抗病基因（R-gene）的植物相互作用导致不亲和反应，植物未遭受到病害；而携带毒力基I习（virgene）的病原菌与
具有感病基因（r．gene）的植物相互作用导致亲和反应，引起病害。
HaroldH．Flor根据该研究结果提出了基因对基因学假说（gene．for．genetheory）（王友红等，2005）。
（2）基因对基因假说提出后，激发子／受体模型（Elicitor．receptormodel）随之发展而来，其主要内容是：
病原体avr基因与抗病基因分别编码产物配体（激发子）和受体，配体（激发子）与受体相互作用，通过细胞信号转导，最终激活防卫基因的表达，产生超敏反应。
如病
原体无毒基因avrRps2编码的蛋白（激发子）与拟南芥抗病基因Rps2编码的受体蛋白相互识别与信号传递，通过活性氧中间体的聚集，激活防卫基因的表达，使植物获得抗性（卢志国等，2002）。
（3）VanderBiezen和Jones研究发现病原物侵染植物体时，植物体内的一种蛋白一一卫兵（guardee）被作为靶子而导致其蛋白构象改变以作为植物受到病原体侵害的信号，植物抗病基因蛋I刍（guard）可能通过检测植物卫兵蛋白与病原体毒蛋白形成复合体来检测到该信号，从而触发抗病性反应。
VanderBiezen和Jones根据该研究结果提出了防卫假说（Guardhypothesis）（韩德俊等，2005）。
（4）非R／avr基因互作的植物抗病模式：
植物中存在促进亲和反应的感病基因，通过DNA甲基化、
2
万方数据
组蛋白乙酰化等方式对感病基因的修饰或诱发隐形突变，赋予植物对病原菌的广谱抗性。
如大麦抗白粉菌（E巧siphegraminisfsp．Hordei）基Nmlo是植物负向调控的广谱抗病基因，编码蛋白MLO抗病作用的发挥类似于G蛋白偶联受体（GPRs），一类新型的钙调素（CAM）结合蛋白，通过信号转导作用，打开Ca2+通道，使细胞质Ca2+浓度增加，
激发寄主的防御反应，促进亲和性互作，达到抗病的目的（Johalgsetal，1992）。
地球上万物相克相生，漫长的进化历程中，植物形成诸多抵御病原微生物的防御机制以保护机体的完整性。
某些植物内源抗病信号分子通过激发特定抗病基因的表达，使植物获得相应的系统获得性抗性（陈士云，2003）。
科研工作者们研究较多的植物抗病信号分子是：
乙烯（ethylene，ET）、水杨酸（salicylicacid，SA）和茉莉酸（jasmonicacid，JA）（Durneretal，1997）。
植物抗病机理及抗病信号转导研究是国际研究热点。
Maleck等在报道中指出，通过诱导突变及筛选、人工克隆抗病基因、基因组学等分离克隆抗性相关基N（Malecketal，2000），抗病信号分子间的作用、新抗病相关信号分子的寻找（Kunkeletal，2002），
是目前植物抗病领域的研究有两个新的发展趋势。
植物的抗病反应过程复杂，目前普
遍认为可能存在除水杨酸（SA），茉莉酸（JA）和乙烯（ET）以外的植物内源抗病信号分子（Dongetal，2001），而只有SA被证实在植物中调节其合成，能提高植物对不同病原物的抗。
l生（Verbemeetal，2000；Mauchetal2001）。
寻找新的诱导植物抗病的化合物是目前抗病机理研究的目标，有助于阐明植物复杂的抗病信号传导途径，通过分子生物学研究技术手段，提高植物抗性，并应用于实际生产中（Oostendorpetal，2001）。
1．2．1小麦纹枯病研究进展
小麦纹枯病，是小麦生产上普遍发生的由禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）和立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）引起的一种土传性真菌病害。
禾谷丝核菌在高盐、碱、低温等逆境中，以菌丝或菌核形式存在，能在土壤中越冬；禾谷丝核菌侵染小麦后，，在小麦的不同生长生育时期引起不同的程度的伤害，使小麦的产量、品质受到严重影响，是限制我国各产区小麦高产、稳产的重要因素之一。
小麦纹枯病病情逐年加重，其原因可能是小麦品种、栽培方式、施肥量、灌溉条件等的改变，也可能与全球气候的变化有关。
小麦纹枯病在我国华北、华中、华东及西南等小麦主产区近20个省（市）都有不同程度的发生（檀根甲等，1999），直接威胁各产区小麦的产量和品质（孙爱根，1992；孟祥启，1990），轻者减产5％．10％，重者减产20％．40％，再者造成枯孕（白）穗，颗粒无收（石明旺等，2000；王玉正等，1997）。
毋庸置疑，小
万方数据
塑区理笾星塑2缝三旦塾!
壅垫整叁囤小麦的分子特性与功能分析
麦纹枯病己成为影响我国各产区小麦高产、稳产的主要因素之一。
立枯丝核菌和禾谷丝核菌是小麦纹枯病的主要病原物，立枯丝核菌多核，菌核比
禾谷丝核菌大，菌丝较粗，生长速度较快；禾谷丝核菌细胞为双核，生长情况与立枯丝核菌相反，主要包括4个菌丝融合群：
CAG．1、CAG．3、CAG．6和AGCl（陈延熙等，1986）。
沈素文、方正等的研究表明26．32℃是最适合立枯丝核菌菌丝体生
长的温度；20．25℃，pH=6，是最适合禾谷丝核菌菌丝体生长的温度（沈素文等，
1997；方正，2003）。
小麦纹枯病是土传性真菌病害，土壤中病原菌的多寡与病害的轻重呈正相关。
小麦正常生长周期中纹枯病的发生呈现双／S0曲线，苗期和拔节孕穗期分别为发病高峰，病害情况常受温度、湿度和病原菌数量的影响。
居为民等的研究表明小麦纹枯病的发病程度受诸多因素的影响，小麦生长环境中土壤中病原菌群体数量是主要的影响因素之一，也存在两个高峰，病原菌含量的两个高峰约比小麦被病菌侵染后纹枯病发病高峰早20．25d（居为民等，2000）。
石明旺等的研究表明，小麦纹枯病的发生受温度、湿度、栽培制度、品种抗性的影响，纹枯病发病越早，小麦的病害越重，产量损失越大，小麦纹枯病的病级每提高一级，产量损失增加约10％．20％，二者之间存在显著的线性相关（石明旺等，2000；石明旺，1997）。
1999年至今，有关小麦纹枯病抗性遗传的报道层出不穷，李斯深等研究表明纹枯病抗性遗传不符合加性．显性模型，表明小麦对纹枯病的抗性遗传可能存在多基因互作效应。
研究者采用植物数量性状QTL体系检测，检测结果表明，小麦纹枯病的抗性基因位点存在不同染色体上，推测小麦纹枯病的抗病性可能受主基因和微效多基因共同控制（张怀琼等，1999；刘朝晖等，1999；李斯深等，2001；张小村等，2004；张小村等，2005；吴纪中等，2005；任丽娟等，2004；汤颈等，2004；霍纳新，2002）。
我国小麦纹枯病抗性育种尚在初始阶段，对纹枯病高抗的种质匮乏，陈荣振、李强、杨立军等的研究表明，一些远缘后代如簇毛麦、野生二粒麦及中四等纹枯病抗性较好（陈荣振等，1999；李强等，2000；杨立军等，2001）。
Chen等采用小麦纹枯病菌诱导表达等方法，从中间偃麦草中分离克隆ERF转录因子基因TiERFl，将TiERFl基因转入小麦中，在小麦中过量表达TiERFl基因，小麦对纹枯病的抗性增强（Chenet
a1．2008）。
Dong等利用同源克隆技术，从被小麦赤霉菌诱导的小麦中分离克隆TaPIEPl基因，利用基因枪转化法获得抗根腐病的转TaPIEPl基因小麦株系（Dongetal，2010）。
小麦纹枯病抗性基因存在互作效应，受多基因共同控制，常规有性杂交育种周期
4
万方数据
长且亲本数量少，可重组抗病基因有限，导致小麦抗病性育种难度增大。
采用轮回育种方法加大后代群体，为抗病基因提供更多的重组机会，累积优良基因，选育高抗材料。
用小麦纹枯病抗一tO-SSR对常规小麦品种的杂交后代进行标记及QTL分析，寻找与抗纹枯病相关的分子标记，进行抗病基因定位、分离以及抗性聚合育种等。
基因表达谱片（geneexpressionprofiling）是将几千个基因特异的探针或其eDNA片段固定在一块基因芯片上，以检测细胞内的mRNA或逆转录产物eDNA，这些mRNA和eDNA来源于不同的个体、组织、细胞周期、发育阶段、病变及不同刺激等，利于综合分析和判断基因表达的个体、组织、发育、分化阶段、病变、刺激特异
性等（徐伟文等，2001；Derisietal，1997）。
根据DNA微列阵上DNA碱基数量的多少，可将基因芯片分为eDNA微阵列和寡聚核苷酸微阵列，前者主要用于RNA表达分析，而
后者用于RNA表达分析，也可用于序列分析（李淼，2003）。
表达谱芯片可对多组不同来源mRNA转录杂交的差异进行分析，以获得差异表达基因的信息、整体水平研究代谢机制、基因相互之间的网络关系，以达到发现、挖掘重要基因的目的。
植物体在生长周期中，植物体内基因种类及其表达情况不断变化，植物基因表达图谱可通过特定的条件下的不同基因的变化而获得。
通过基因表达图谱，从mRNA水平定性、定量地特定细胞、组织或器官的基因表达模式，系统地描述和解释其特定的生理功能。
基因芯
片具有高通量平行监测基因的表达、筛选大量新基因并推断其功能、自动化程度高发现新基因速度快等优点。
利用正常环境和病害、冷冻等逆境条件下不同个体、同一个体的不同生长阶段基因表达谱差异，通过基因芯片寻找、发现和定位抗病、抗逆基因等目标基因，是目前研究的热点之一。
1．2．2冻害研究进展极端低温是植物分布的主要限制因素之一，是影响植物生长、发育的环境胁迫因
子之一，使植物产量降低、品质下降。
植物在长期的进化过程中逐渐建立起了适应和抗性机制，通过一系列的生理生化变化来适应低温胁迫环境（段俊枝等，2014）。
低温信号转导途径中，可根据功能将响应低温胁迫的基因分为调节基因和功能基因。
调节基因包括CBF／DREBl亚家族基因、调控CBF／DREBl的基因、蛋白激酶（CDPK、CIPK、MAPK）等。
功能基因表达产物对逆境中的植物直接起保护作用，功能基因包括抗氧
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