肌糖元的酵解作用实验报告.docx

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肌糖元的酵解作用实验报告

肌糖元的酵解作用

一）目的要求

1、学习鉴定糖酵解作用的原理和方法。

2、了解酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。

3、了解有关组织代谢实验应注意的一些问题。

二）实验原理

在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。

本实验以动物肌肉组织中肌糖元的酵解过程为例。

肌糖元的酵解作用，即肌糖元在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应，最后转变成乳酸的过程。

肌肉组织中的肌糖元首先磷酸化，经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯、丙酮酸等一系列中间产物，最后生成乳酸。

该过程可综合成下列反应式：

（1/n）（C6H10O5）n+H2O  2CH3CHOHCOOH

肌糖元的酵解作用是糖类供给能量的一种方式。

当机体突然需要大量的能量，而又供氧不足（如剧烈运动时），则糖元的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要。

在有氧条件下，组织内糖元的酵解作用受到抑制，而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。

糖元酵解作用的实验，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。

在用肌肉糜时，必须在无氧条件下进行；而用肌肉提取液，则可在有氧条件下进行。

因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三羧酸循环和氧化呼吸链）的酶系统，则集中在线粒体中。

糖元或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观测。

在除去蛋白质与糖后，乳酸可以与硫酸共热便成乙醛，后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质，根据颜色的显现加以鉴定。

该法比较灵敏，每毫升溶液含1——5ug乳酸即给出明显的颜色反应。

若有大量糖类和蛋白质等杂质存在，则严重干扰测定，因此实验中应尽量除尽这些物质。

另外，测定时所用的仪器应严格地洗干净。

三）试剂和器材

1、材料：

鸡或兔的肌肉糜

2、试剂：

1）1／15mol/L磷酸缓冲液（pH7．4）：

2）对羟基联苯试剂：

称取对羟基联苯1．5g溶于100ml0.5％NaOH中，配成1．5％的溶液。

若对经基联苯颜色较深，应用丙酮或无水乙醇重结晶，放置时间较长后，会出现针状结晶，应摇匀后使用。

3）淀粉溶液：

0.5%

4）液体石蜡

5）CuSO4饱和溶液

6）Ca（OH）2粉末：

7）20%三氯乙酸

8）浓硫酸

3、器材

试管及试管架；移液管：

5m1、2m1、1ml、0.5ml；电子天平；滴管；玻璃棒；恒温水浴；沸水浴；漏斗；冰浴；滤纸；量筒；旋涡搅拌器

四）操作方法

1、肌肉糜的糖酵解

取4支试管，编号后各加入新鲜肌肉糜0.5克。

1，2号管为样品管，3，4号管为空白管。

向3，4号空白管内加入20%三氯乙酸4mL,用玻璃棒将肌肉糜充分打散，搅匀，以沉淀蛋白质和终止酶的反应。

然后分别向4支试管内加入4mL磷酸缓冲液和1mL0.5%淀粉溶液。

3，4管用玻璃棒充分搅匀，加液体石蜡以隔绝空气，并将4支试管同时放入37℃恒温水浴中保温。

1h后，取出试管，立即向1，2号试管内各加入20%三氯乙酸4mL，充分混匀，过滤。

然后向每管（一次性试管）内加入饱和硫酸铜溶液1mL，混匀，再加入0.4克氢氧化钙粉末，充分搅匀2min，放置10min，使还原糖沉淀完全，过滤，保留滤液。

2、乳酸的测定

取4支洁净、干燥试管，编号，各加入浓硫酸2mL，将试管置于冰水浴中冷却，分别取每个样品的滤液2滴，直接加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中，随加随摇动试管，避免试管内的溶液局部过热。

将每个试管混合均匀后，放入沸水浴中煮5min，加入对羟联苯试剂2滴，混匀试管内容物，比较和记录各管溶液的颜色深浅，并加以解释。

表一 实验过程

试管编号

1

2

3

4

肌肉糜

0.5g

三氯乙酸

3mL

淀粉溶液

各加1mL

磷酸盐缓冲液

3mL

加液体石蜡封口，37℃水浴保温1h

吸出液体石蜡，取4支试管过滤，分别取滤液5毫升

三氯乙酸

3ml

饱和CuSO4

各加1.0ml

Ca（OH）2粉末

各加0.4克

充分搅拌，振荡2min，静置10min，过滤

另取4支洁净干燥的10ml试管，各加2ml浓H2SO4置于冰浴中，分别加入溶液2滴，边加边摇，混匀，放入沸水浴中5min，加入显色液2滴，取出冷却，比较颜色，分析结果

5）实验结果：

表二 实验结果与分析

试管编号

实验结果

结果分析

一号样品

呈现紫罗兰色

乳酸可以与硫酸共热便成乙醛，后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质

二号样品

呈现紫罗兰色，但颜色较浅

乳酸可以与硫酸共热便成乙醛，后者再与对羟基联苯反应生成紫罗兰色物质,可能因淀粉或蛋白质处理不彻底，影响了其显色效果。

一号空白

呈现浅红色

在加入三氯乙酸后，没有完全震荡，肌肉糜中的酶没有与三氯乙酸完全反应，导致其后加入的淀粉发生酵解反应，最终生成少量乙醛与显色液发生反应；另外在肌肉糜中本身含有糖类，在未加入三氯乙酸之前反映了一部分，生成部分乳酸。

二号空白

呈现浅红色

在加入三氯乙酸后，没有完全震荡，肌肉糜中的酶没有与三氯乙酸完全反应，导致其后加入的淀粉发生酵解反应，最终生成少量乙醛与显色液发生反应；另外在肌肉糜中本身含有糖类，在未加入三氯乙酸之前反映了一部分，生成部分乳酸。

图:

二号样品

一号样品

二号空白

一号空白

六）注意事项：

1、对羟基联苯试剂一定要经过纯化，使成白色。

2、在乳酸测定中，试管必须洁净、干燥，防止污染，影响结果。

所用滴管大小尽可能一致，减少误差。

若显色较慢，可将试管放入37℃恒温水浴中保温10min，再比较各管颜色。

3、加Ca（OH）2和CuSO4去除糖类对显色的影响；加三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白质，去

除蛋白质对显色的影响，反应要彻底。

4、在空白组的第二个步骤中，加入三氯乙酸的反应要彻底，让酶类完全失活，

以增强最终显色的比照效果。

5、在加入石蜡时，要避免倾斜，以免进入空气，或者多加一些石蜡。

6、最终滴加显色液时，要避免其滴到壁上，减弱显色效果。

七）思考题

1、人体和动植物体中糖的储存形式是什么？

实验中如果用淀粉或糖元代替葡萄糖能否证明一定是糖酵解的酶失活吗？

答:

人体中糖的储存形式为肌糖原与肝糖原，植物体中为淀粉。

不能证明。

因

肌肉糜中含有可以酵解淀粉与糖原的酶类，最终在无氧条件下分解生成乳酸，

参与显色反应。

2、试述糖酵解作用的生理意义。

答：

糖酵解是生物界普遍存在的供能途径，但其释放的能量不多，而且在一般生理情况下，大多数组织有足够的氧以供有氧氧化之需，很少进行糖酵解，因此这一代谢途径供能意义不大，但少数组织，如视网膜、睾丸、肾髓质和红细胞等组织细胞，即使在有氧条件下，仍需从糖酵解获得能量。

在某些情况下，糖酵解有特殊的生理意义。

例如剧烈运动时，能量需求增加，糖分解加速，此时即使呼吸和循环加快以增加氧的供应量，仍不能满足体内糖完全氧化所需要的能量，这时肌肉处于相对缺氧状态，必须通过糖酵解过程，以补充所需的能量。

在剧烈运动后，可见血中乳酸浓度成倍地升高，这是糖酵解加强的结果。

又如人们从平原地区进入高原的初期，由于缺氧，组织细胞也往往通过增强糖酵解获得能量。

在某些病理情况下，如严重贫血、大量失血、呼吸障碍、肿瘤组织等，组织细胞也需通过糖酵解来获取能量。

倘若糖酵解过度，可因乳酸产生过多，而导致酸中毒。

3、本实验的关键环节是什么，应采取什么措施，为什么？

答：

关键步骤分别为：

1）空白组第二步骤加入三滤乙酸。

此步骤是沉淀肌肉中的蛋白质，以完全阻断后续反应的进行，以使最终显色呈现无色，作为对照。

故此步骤，可加入一些三氯乙酸，并完全震荡反应，以让蛋白质完全降解。

2）加入氢氧化铜与饱和硫酸化铜步骤中，目的是为了消除糖类与蛋白质对显色的影响，故此反应要彻底，以排除干扰。

4、研究组织代谢实验应注意一些什么问题？

答：

1）要尽量排除组织中未知物质的干扰作用；

2）排除空气中氧气、二氧化碳及环境中其他因素的影响；

3）注意一些金属离子、PH、温度等对组织中酶类的影响作用。

5、如果样品管在加入葡萄糖后和空气充分接触，然后再加石蜡封口，实验结果会有不同吗？

为什么？

答：

会。

最终反应会呈现无色或颜色较浅。

在空气中糖类被酶类完全催化氧化生成CO2、H2O，没有生成乙酸，故没有显色效果或者显色很差。

6、糖酵解作用的关键酶是什么？

机体中该酶的活性会受到高能荷的抑制，在本实验中这种情况会发生吗？

你怎样证明？

答：

糖酵解反应共有10个步骤如下:

1、糖酵解十步反应我这里列的第五步大概就是你们不看的吧葡萄糖[glucose]+ATP——（葡萄糖激酶glucokinase）ADP+6磷酸葡萄糖[glucose-6-phosphate,G6P]

2、6-磷酸葡萄糖——（葡萄糖异构酶glucoseisomerase）6-磷酸果糖[fructose-6-phosphate,F6P]6-磷酸果糖+ATP——（磷酸果糖激酶fructophposphatekinase）

3、1，6二磷酸果糖[fructose-1,6-biphosphate,F1,6BP]+ATP

4、1，6二磷酸果糖——（醛缩酶aldolase）三磷酸甘油醛[glyceraldehyde-3-phosphate,G3P]+磷酸二羟丙酮[dihydroxyacetonephosphate,DAP]

5、磷酸二羟丙酮——三磷酸甘油醛

6、三磷酸甘油醛+NAD+Pi——（三磷酸甘油醛脱氢酶,G3Pdehydrogenase）1，3二磷酸甘油酸[1,3biphosphateglycerate,BPG]+NADH

7、1，3二磷酸甘油酸+ADP——（磷酸甘油酸激酶[BPGkinase]）3-磷酸甘油酸[3-phosphoglucerate,3PG]+ATP

8、3-磷酸甘油酸——（磷酸甘油酸变位酶,3PGmutase）2-磷酸甘油酸[2-phosphoglucerate.2PG]

9、2-磷酸甘油酸——（enolase，烯醇化酶）磷酸烯醇式丙酮酸[PEP,phosphoenol-pyruvate]

10、磷酸烯醇式丙酮酸——（丙酮酸激酶pyruvatekinase）丙酮酸[pyruvate]

在上述反应中第一步中己糖激酶、第三步中的磷酸果糖激酶还有第九步骤的丙酮酸激酶催化的均为不可逆的步骤，因此这三种酶具有调节糖酵解途径的作用。

糖酵解的作用是为了生成ATP，所以这三种酶的活性必受最终产物ATP，即高能荷的抑制。