第二章 发酵原理 01pptConvertor.docx
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第二章发酵原理
请带着以下问题听课：
1.为什么说微生物是工业发酵的灵魂？
2.微生物生命活动的3个假说；
3.发酵原理的研究内容；
4.发酵学的基本理论框架。
微生物的特点：
体积小；种类多；分布广；
繁殖快；
便于培养；
容易发生变异；
人工培养不受季节、地域的限制。
自主生存
独立存在
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工业发酵过程是微生物群体生命活动的动态过程，这个过程是五花八门、千变万化的。
具体表现为种种多样性，譬如微生物种群的多样性、微生物营养类型的多样性、微生物培养条件的多样性、目的产物的多样性、微生物生长与目的产物生成的偶联方式的多样性等等。
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细胞
单细胞蛋白（白色食品，蓝色食品）
生物转化
结构复杂的有机产品（譬如甾醇的生物转化）
细胞的产物
酶（如葡萄糖异构酶等）
次级代谢产物（如抗生素）
初级代谢产物（如氨基酸）
能量代谢副产物（如乙醇）
中心代谢产物（如柠檬酸）
直接面向环境
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微生物细胞能自主生活和独立存在，因此微生物生物机器也就是微生物细胞机器，简称细胞机器。
“生物机器”是从机器衍生的新概念，生物机器是指由代谢能驱动的机器。
现代发酵工程依靠微生物活细胞来完成发酵工厂生产线上不可缺少的加工（或转化）步骤，在这个意义上，微生物活细胞就是工业发酵生产线上不可缺少的微生物生物机器（或称细胞机器），是发酵工厂里关键的生产机器。
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工业发酵中的活细胞是储存了生物信息的自动化的细胞机器。
细胞机器与普通意义上的机器不同，主要表现在以下三个方面：
① 细胞机器必须由其自供的代谢能（metabolicenergy）直接驱动；
② 在发酵工厂的生产线上的细胞机器，必须完成微生物细胞机器自身的“在线制造”（细胞增殖）和“生产运行”（目的产物的合成和输出）的双重任务；
③工业发酵的细胞机器来源于自然界的细胞（生产菌种从野生菌株育成），其细胞的构造原理和运行机制尚未完全掌握；而普通意义上的机器则完全是由人设计和制造的，因此是知根知底的。
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细胞机器与微生物细胞不同，
主要表现在以下方面：
①细胞机器是经过人改造或引导的、体现人的意志的细胞，而天然的微生物细胞则是经过自然竞争考验的；
②细胞机器一般要求有配套的环境条件才能实现其功能，而天然的微生物细胞相比之下对环境有较强的适应性；
③人对细胞机器的代谢调节机制已有一定的了解，而对天然的微生物细胞一般没有专一的了解；
④微生物细胞是生物学的概念，细胞机器是工程学的概念。
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根据工业发酵的现状，把依靠化能异养型微生物合成某种最终被分泌到胞外的初级代谢产物的工业发酵，作为工业发酵的典型过程来研究，并把代谢研究的重点放在碳的代谢上，从而建立了细胞机器（发酵工厂里微生物生物机器）的工作的基本模式。
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模型各部分的含义：
＊椭圆：
细胞机器的界面
＊带箭头的曲线：
载流路径及代谢主流
1.载流路径：
由跨膜进入、向心途径、中心途径、离心途径、跨膜逸出五段途径依次首尾衔接而成。
2.物质代谢流：
从原料到产品的物质流动轨迹。
也可分成跨代谢网络的三大板块的相应的五段代谢流。
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从不同的角度研究微生物的生命活动，把现代生物学关于伴随能量形式的转换而发生的电子流动、物质流动以及信息流动这三种流动的观点引入发酵工程，提出了反映微生物生命运动客观规律的三个基本假说：
代谢能支撑假说、代谢网络假说和细胞经济假说。
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微生物生命活动的三个基本假说：
①代谢能支撑假说：
微生物细胞生命活动的驱动原理（微生物能学）
②代谢网络假说：
代谢网络与代谢物流图（微生物第二解剖学）
③细胞经济假说：
细胞经济运行与生存保障原理（细胞经济学）。
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代谢能支撑假设挑明了微生物生命活动的前提，即微生物细胞代谢能的持续供应问题；
代谢网络假设梳理了微生物生命活动的内容，具体了微生物细胞的能量、物质转化的关系；
细胞经济假设揭示微生物生命活动的经济管理原则，这些原则是人和微生物合作成功的基础。
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（一）发酵学第一假说·代谢能支撑假说
微生物是工业发酵的灵魂，没有微生物就没有工业发酵；微生物细胞的生命活动必须由代谢能来支撑（持续地供应代谢能），工业发酵必须由活的微生物细胞来支撑。
因此，代谢能支撑假说确定了工业发酵的生物学属性。
代谢能支撑假说：
能直接推动生命活动（做细胞功）的能量形式叫做代谢能。
微生物细胞依靠其自备的能量转换机构，把化学能或光能持续地转化成代谢能，并直接用来支撑其自身的生命活动。
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因为微生物细胞独立存在自主生存，微生物细胞的生命活动需要的代谢能要靠微生物细胞自己解决，其解决的办法就是用它自备的能量转换机构把其他形式的能量转化成代谢能。
工业发酵的过程是依靠微生物细胞生命活动获得目的产物的过程，从根本上区别于化学合成工业和生化工业。
代谢能支撑假说提示：
工业发酵成功的底线是要有微生物的生命活动。
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学习、讨论要点：
①什么是“代谢能”？
②什么是“细胞功”？
③什么是“自备的能量转换机构”？
④支撑的含义是什么？
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（二）、发酵学第二假说·代谢网络假说
代谢网络假说描述了代谢网络的存在方式和代谢的双重功能，对碳架物质在微生物细胞内的有序流动的现象做出了解释。
代谢网络假说：
代谢途径与输送系统在蛋白质水平上整合、在辅因子水平上协调而形成的横跨微生物活细胞内外的代谢网络，是可调节的、无尺度的网络，代谢网络作为一个整体来承担微生物细胞的物质代谢和能量代谢。
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由生化反应网络和跨膜输送系统组成的代谢网络既没有绝对的起点，也没有绝对的终点，可以认为代谢网络是类似于互联网的无尺度网络。
对于工业发酵来说，代谢网络假设把代谢形象化为一个虚拟的网络——新原料和新产品开发的蓝图。
代谢网络假说提示：
工业发酵是可以操作的，开拓新产品和新原料是有理论根据的。
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讨论要点：
①什么是代谢网络？
它有什么特点？
②为什么代谢网络是一个整体？
③代谢网络承担什么任务？
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（三）、发酵学第三假说·细胞经济假说
细胞经济假说阐述了微生物细胞为了生存和竞争而进行自身调整的保障机制。
微生物是自然界长期进化的产物，它之所以能生存至今，自然有它的独特的优越性。
在我们对微生物改造之前，它们自身已经形成了完整的细胞经济体系。
细胞经济假说：
微生物细胞是个远离平衡状态的不平衡的开放体系，是在物竞天择的基础上形成的细胞经济体系。
细胞经济体系是微生物细胞生存的保障体系，它为细胞的适应性、经济性和代谢的持续性提供保障。
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细胞经济假说是建立在代谢能支撑假说和代谢网络假说基础上，又是为代谢能支撑假说和代谢网络假说服务的。
细胞经济假说为代谢能的开支、代谢网络中各种代谢物库的大小，以及代谢流中碳架物质的流量大小和分支处的流量分配提供了解释的依据。
细胞经济假说提示：
人的主观能动性的发挥是建立在对微生物代谢的充分了解的基础之上的。
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讨论要点：
①什么是细胞经济体系？
②为什么说细胞经济体系是微生物细胞生存的保障体系？
③为什么说细胞经济运行状况可以改变，管理原则不会改变？
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基本假说之间的关系：
微生物活细胞是远离平衡状态的、不平衡的开放体系，又是个实现能量形式转换和支配有限资源的经济实体，它的生命过程就是在代谢能支撑下的经代谢网络进行能量代谢和物质代谢的过程，即细胞的经济运行过程。
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与其他细胞生物相比较微生物的生命活动有何特点？
本原理部分为什么要界定“典型工业发酵”的范畴？
如何认识“三个基本假说”？
天然的微生物细胞与发酵工厂的微生物生物机器在价值取向上是否一致？
怎样理解人类与微生物的合作？
如何认识研究发酵原理任重而道远？
小结
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第二节发酵学第一假说
----代谢能支撑假说
能直接推动生命活动（做细胞功）的能量形式叫做代谢能。
微生物细胞依靠其自备的能量转换机构，把化学能或光能持续地转化成代谢能，并直接用来支撑其自身的生命活动。
试图说明三个问题：
①什么叫代谢能？
②微生物细胞怎样获得代谢能？
③代谢能与微生物的生命活动有什么关系？
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生命活动是生物体高度有序的序列反应的总和，是耗能的、不可逆的过程。
尽管不同的生物可以使用不同的能源，然而，实际上吸能的生物化学反应只能接受代谢能（metabolicenergy），即可供细胞新陈代谢直接利用的能量形式。
因此所有的生物体内都存在把其他形式的能量转化成代谢能的过程，以及代谢能支撑的问题。
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在细胞中，能直接驱动吸能过程的自由能有两类供体：
在细胞内流通的能量货币（以ATP为代表）和能化了的生物膜（以Δp为代表，质子运动势，能库），是代谢能最常见的供体。
腺苷酸和可以被能量化的生物膜是最常见的代谢能载体，它们一般在代谢过程中形成，在代谢过程中使用，特别是它们作为细胞的组成成分，在细胞的代谢中再生和周转。
我们把这两类特殊能量形式叫做代谢能。
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微生物细胞直接面向环境而独立存在的处境，以及微生物细胞自主应对环境变化的生存方式，要求微生物细胞必须自己解决能量形式转换等生死攸关的问题。
也就是说微生物细胞必须自备与能源相对应的能量形式转换机构，并具备把能源提供的能量形式持续不断地转化成代谢能的能力，最终实现代谢能对微生物细胞生命活动的支撑。
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代谢能支撑假说是发酵学最基本的假说，它规定了工业发酵的生物学属性。
微生物细胞进行持续的能量代谢是微生物细胞的生命线，也是工业发酵成立的最起码的条件。
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这里说的营养既可指营养物质（nutrients），也可指提供营养的过程（nutrition）。
作为营养物质必须能直接地或者经过降解后可以跨膜进入微生物细胞，并至少能为正常生命活动提供以下三者之一：
①能量；②细胞结构的原材料；③代谢调节物质。
微生物的营养
一、微生物细胞内外的物质交换
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可把营养物质大致分为元素营养和能源营养。
元素营养中研究得最透彻的是碳源，能源营养可以是化学物质，也可以是非化学物质如光能。
为模块分子（buildingblock）生物合成提供碳骨架（carbonskeletons）的基质，通常被称为碳源；而为生命活动提供吉布斯自由能（其中只有一部分能被微生物细胞转化成代谢能）和还原力的基质称为能源。
关于微生物的营养，微生物学已有介绍，可回顾。
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微生物的营养类型：
按同化作用（生物合成）方式的不同，可以把微生物分为自养型和异养型；
按异化作用（生物氧化）方式的不同，可把微生物分为需氧型和厌氧型。
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化能有机异养型微生物简称化能异养型微生物（chemoorganoheterotroph，COH），目前已被广泛地用作工业发酵的生产菌种，其它营养类型的微生物也正在环保、食品、化工等领域得到开发和应用。
“化能异养型微生物作为目的产物的生产者”------典型发酵工业
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二、化学物质的跨膜过程
化学物质跨过细胞质膜的机制
真核微生物细胞内化学物质的跨膜传递
代谢中间产物排出细胞的机制
跨膜过程中代谢能的消耗
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所有的活细胞都要与环境进行物质交换。
在工业发酵中微生物细胞要将进入细胞的营养物质经代谢转化为目的产物，一般还要将代谢产物排放出细胞。
工业发酵生产大多均兼有营养物质进入和发酵目的产物排放出细胞的过程。
即使在以细胞为目的产物的情况下，也有营养物质进入和代谢中间产物（代谢“废物”）排放出细胞。
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跨膜机制分成以下两类四种：
第一类：
细胞不提供帮助
⑴简单扩散
第二类：
细胞提供帮助
⑵促进扩散：
提供载体蛋白
⑶简单主动输送：
提供载体蛋白
和代谢能
⑷基团转移：
提供载体蛋白、代
谢能和酶（蛋白质因子）
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代谢中间产物排出细胞的机制：
从化学平衡的观点来看，分泌可以促进合成；从生物学的角度来看，分泌又是对过量合成的代谢中间产物的解毒机制，是微生物细胞生存策略的一个方面。
代谢产物的释放也是跨膜输送的过程，但强调的是从细胞释放或排出。
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三、化能异养型微生物的生物氧化
氧化还原反应；
微生物进行生物氧化的细胞器及ATP合成酶；
生物氧化过程中辅酶的关键作用；
化能异养型微生物生物氧化的方式。
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化能异养型微生物将有机营养物质储存的化学能，转化成可以被自身直接利用的能量形式（ATP或质子运动势Δp等）的代谢过程，叫做化能异养型微生物的产能代谢。
生物氧化是按一定顺序进行的、酶催化的、受到严密控制的逐级释放能量的过程，以这种方式释放的能量中的一部分可直接用来支撑生命活动。
因此，没有生物氧化就没有代谢能，没有代谢能的支撑就没有生命活动。
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1.微生物进行生物氧化的细胞器
及ATP合成酶
线粒体的膜与原核细胞的质膜：
微生物的呼吸和发酵作用在细胞特定部位或特定的细胞器里进行。
在这些细胞部位和细胞器里包含着各种氧化还原酶（包括它们的辅酶和辅基）、电子传递链、输送蛋白和ATP合成酶。
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与呼吸关系最密切的细胞器是线粒体，对于原核细胞则是细胞质膜。
线粒体内膜和原核细胞的质膜包含电子传递链、ATP酶，以及与呼吸有关的输送蛋白。
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与代谢有关的底物、产物以及还原力在细胞质和线粒体基质之间的传递，对真核微生物的代谢是非常重要的。
这主要是因为酵解和PP环（磷酸戊糖循环）发生在细胞质，而脂肪酸的β-氧化（脂肪酸的降解）以及乙酰基的降解（TCA环的氧化过程）发生在线粒体的基质中。
由胞质中的酵解作用产生的丙酮酸，如果要经TCA环氧化，则必须首先进入线粒体。
电子传递磷酸化作用要求将磷酸根（Pi）和ADP送入线粒体，而线粒体中通过电子传递磷酸化生成的ATP，又必须被送出线粒体，才能参与细胞质中进行的需要ATP的反应。
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根据对原核细胞的研究，得知原核细胞的质膜是不对称的。
NADH和分子氧与膜发生作用的位置只能在膜的内侧，同样，与膜结合的以FAD为辅酶的脱氢酶也在膜内侧，这些都是由电子传递链多肽成员在膜上的定位决定的。
因为原核细胞的糖酵解和TCA环均在同一细胞空间进行，所以在原核细胞中NADH的释放电子和氧分子的接受电子不存在什么空间障碍。
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ATP合成酶
ATP合成酶镶嵌在真核细胞的线粒体内膜，及细菌的细胞质膜，膜上的ATP合成酶呈球状突起，伸向线粒体基质或细菌细胞质。
ATP合成酶实际上是多个多肽组成的复合体。
这复合体由两部分构成，在电镜下看到的球状突起体是ATP合成酶的催化部分，在线粒体中称为F1。
ATP合成酶复合体的其余部分F0埋在膜里，作为向F1运送质子的跨膜通道（又有“质子阱”之称）。
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头部（F1）：
为水溶性球蛋白，从线粒体内膜突出于基质内，较易从膜上脱落。
由3α、3β、γ、δ、ε等9个亚基组成。
α和β亚基上均有核苷酸结合位点，其中β亚基的结合位点具有催化ATP合成或水解的活性。
γ和ε亚基有很强的亲和力，结合在一起形成“转子”，共同旋转以调节三个β亚基的催化位点的开放和关闭。
基部（F0）：
是嵌于膜内的疏水蛋白复合体，形成一个跨膜质子通道。
由a、b、c三种亚基构成。
a亚基、b亚基的二聚体与F1的δ亚基一起组成了“定子”。
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2.生物氧化过程中辅酶的关键作用
生物氧化本质上是氧化还原反应，因为发生了电子从一个分子到另一个分子转移。
但又不同于一般的氧化还原反应，主要表现在：
①生物氧化是按一定顺序进行的、由酶催化的逐级放能的过程；
②还原性化合物（还原剂）首先把电子交给一级电子载体，而不是直接交给最终电子受体（氧化剂），而在普通的氧化还原反应中还原剂直接向氧化剂移交电子。
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在化能异养型微生物细胞的生物氧化过程中，除了脱氢酶和氧化酶以外，它们的辅酶和辅基的作用也是不可替代的。
脱氢酶的辅酶包括NAD和NADP：
NAD主要在供能途径的氧化还原反应（生物氧化）中起作用，NADP通常是在生物合成反应中起作用。
在供能反应中，NAD+（氧化型的NAD）是反应物，而在合成反应中，NADPH（还原型的NADP）是反应物。
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微生物以不同的方式进行生物氧化，在生物氧化的过程中，还原剂放出的电子“搭乘”电子载体，还原剂放出的电子首次搭乘的电子载体叫做一级电子载体，接下来搭乘的电子载体叫做二级电子载体……，依此类推。
最后一级的电子载体将电子交给最终电子受体，完成这一轮生物氧化过程。
生物氧化的一级电子载体主要包括：
①脱氢酶的辅酶：
烟酰胺酰腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺酰腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）；
②氧化酶（黄素蛋白）的辅基：
腺嘌呤黄素二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN）。
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对于化能异养型微生物细胞来说，作为还原剂的有机化合物不论以何种方式进行生物氧化，其释放的电子，经各级电子载体逐级传递，直到这些电子被它们的最终电子受体接受的全过程中，只有一个步骤是有共性的，而且均是必不可少的，这就是：
还原剂释放的电子首先要被生物氧化过程的一级电子载体接受。
在脱氢反应的过程中，能源化合物（还原剂）首先将电子交给一级电子载体——脱氢酶的辅酶，即NAD的氧化形式NAD+，使它转化为其还原形式NADH。
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NAD和NADP是脱氢酶的辅酶，FAD和FMN是氧化酶的辅基，ATP是激酶的辅酶。
辅酶的再生和回用
NAD是以NAD+的形式参加脱氢反应的，它作为一级电子受体直接从脱氢酶的底物（还原剂）接受一对电子被还原成NADH。
NADH中的“H”实际上是氢负离子（hydrideion），也就是一个氢离子和一对电子（H++2e-）。
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在有外源电子受体的情况下，负载电子的NADH将电子交给电子传递链而再生为空载的电子载体NAD+，卸载电子后，空载的电子载体NAD+将继续投入下一轮的电子运载工作（作为脱氢酶的辅酶接受能源化合物或其还原性降解物分子释放的电子）；NADH交给电子传递链的电子经电子传递链传到最终电子受体，完成生物氧化。
在微生物细胞的产能代谢中，还原型辅酶NADH上的一对电子主要以两种不同的方式卸载：
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在没有外源电子受体的情况下，NADH将电子直接交给内源电子受体（代谢中间化合物，结果生成各类发酵产物），在完成还原反应的同时NADH被再生（被氧化）为空载的电子载体NAD+。
卸载电子后，空载的电子载体NAD+将继续投入下一轮的电子的运载工作。
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因此，在化能异养型微生物进行生物氧化（不论是发酵还是呼吸）的过程中，脱氢酶的辅酶作为一级电子载体，起到了从脱氢酶的底物（能源化合物或其还原性降解物分子）直接接受电子的关键作用。
细胞或细胞器的空间内NAD+是有限的，如果作为电子载体的辅酶NAD+不能得到再生，就不能被回用，有效的电子载体就会愈来愈少，脱氢反应就不能持续进行下去了。
因此辅酶的再生必须及时，使有限的辅酶分子得到正常的周转，以保证生物氧化作用的持续进行。
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3.化能异养型微生物生物氧化的方式
目前发酵工业上使用的工业微生物绝大多数是化能异养型微生物。
根据化能异养型微生物在生物氧化时有没有外源的最终电子受体，以及最终的外源电子受体是不是分子氧，可将化能营养型微生物的生物氧化分成发酵、有氧呼吸和无氧呼吸三类，它们在本质上都是氧化还原反应。
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发酵：
在没有外源最终电子受体的条件下，化能异养型微生物的能源有机化合物或其还原性降解物，通过将一个内源的（已经经过该细胞代谢的）有机化合物还原而自身被氧化的生物学过程称为发酵。
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发酵过程中的碳架流与电子流
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葡萄糖
糖酵解作用
丙酮酸
发酵
有氧
无氧
各种发酵产物
三羧酸循环
被彻底氧化生成CO2和水，释放大量能量。
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生成能量代谢副产物的亚网络（“R”标注还原反应）
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比较了解的发酵大致有以下几种，大多与传统的发酵工业生产有关：
①酵母菌的酒精发酵，
②酵母菌的甘油发酵（添加NaHSO3），
③酵母菌的甘油发酵（歧化反应），
④细菌的酒精发酵，
⑤细菌的同型乳酸发酵，
⑥细菌的异型乳酸发酵，
⑦双歧发酵途径。
以上7种发酵有一个共同的特点，那就是发酵中被氧化的和被还原的有机化合物均为葡萄糖的降解产物。
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有氧呼吸：
在有氧条件下，一级电子载体NADH上的电子经电子传递链一直传到末级电子载体（电子传递链最后一个成员细胞色素氧化酶），然后，末级电子载体把电子交给最终电子受体分子氧，把分子氧还原成水，这就是有氧呼吸。
在有分子氧的条件下，化能异养型微生物可经EMP途径、不完全的HMP途径ED途径、PK途径首先将葡萄糖降解为PYR，同时生成代谢能、NADH和NADPH；继而这些还原性化合物和还原型辅酶在有分子氧的条件下进行下述反应：
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原始底物
再生底物
⑴PYR通过TCA环被进一步氧化：
PYR在进入TCA环前，先要被转化成乙酰辅酶A（AcCoA）。
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可把AcCoA看作是TCA环的原始底物，把OAA看作再生底物。
再生底物不足，势必影响TCA环的正常运转，进而影响AcCoA中乙酰基的降解。
细胞（真核微生物的线粒体）内OAA最初的生成及其量的维持，与TCA环的再生底物的回补及乙醛酸循环密切相关。
微生物的需氧生长往往会导致TCA环的再生底物或其前体的外流（参与氨基酸等的合成），从而威胁到乙酰基的降解。
为维持再生底物的量，必须进行回补。
除了细胞内转氨基酶所催化的反应能直接或间接提供OAA等，也可使TCA环得到回补外，TCA环再生底物的回补主要来自二氧化碳固定和乙醛酸环。
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二氧化碳固定有以下3个反应，它们分别由丙酮酸羧化酶（PC），磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）及苹果酸酶（ME）催化：
PYR+CO2→OAA
PEP+CO2→OAA
PYR+CO2→MLA（→OAA）
化能异养型微生物要在己糖或EMP途径的中间代谢物上进行需氧生长，至少需具备以上3个反应之一，以获得TCA环的再生底物。
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乙醛酸环可看作是AcCoA的另一个去向，一个借助于TCA环的某些反应而实现按合成方向进行的循环。
因为乙醛酸是该循环中的“2C”中间物，故称为乙醛酸环（glyoxylatecycle，简称GOA环）。
通过乙醛酸环，可把“2C”水平的AcCoA合成“4C”水平的化合物SCA，从而对TCA环进行回补。
乙醛酸环对生长在“2C”底物如乙酸或乙醇上的细菌、真菌、藻类和原生动物来说是必须具备的代谢途径。
乙酸或乙醇经下列反应先转变成AcCoA，以参与乙醛酸环代谢：
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