整理第三章转录课件.docx
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整理第三章转录课件
概述
●基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。
●RNA分子来自DNA。
储存于DNA双链中的遗传信息通过转录酶促反应按照碱基互补配对的原则被转化成为单链RNA分子。
RNA转录合成的特点
☐1、转录的不对称性
☐2、转录的连续性
☐3、转录的单向性
☐4、有特定的起始和终止位点
RNA转录合成的特点
1、转录的不对称性
●双链DNA分子中只有一条链作为RNA模板。
如果DNA的两条链均作为RNA模板，则每个基因必将产生两条互补的RNA。
而遗传学证明每个基因只合成了一条RNA链。
即使合成两条RNA链，其中也只有一条有功能。
事实上，在活体内只存在这两条RNA链中的一条。
●如将双链DNA加热使之变性，再加入以此DNA为模板所合成的单链RNA，进行退火。
结果除复性的DNA双螺旋外，还形成了DNA-RNA杂种分子。
结果表明只有一条DNA链被转录。
在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。
2、转录的连续性
●RNA转录合成时，以DNA作为模板，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。
●合成的RNA中，如只含一个基因的遗传信息，称为单顺反子；如含有几个基因的遗传信息，则称为多顺反子。
3、转录的单向性
●RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为3'→5'，而RNA链的合成方向为5'→3'。
4、有特定的起始和终止位点
●RNA转录合成时，只能以DNA分子中的某一段作为模板，故存在特定的起始位点和特定的终止位点，特定起始点和特定终止点之间的DNA链构成一个转录单位，通常由转录区和有关的调节顺序构成。
复制和转录的区别
第二节原核生物RNA转录的起始
（RNATranscriptionpromotioninprokaryots）
●无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括:
模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。
●在原核生物中，模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。
转录起始前，启动子附近的DNA双键分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。
转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。
●转录起始后直到形成9个核酸苷短链是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。
一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进人正常的延伸阶段。
所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。
一般说来，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。
●当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。
●以DNA序列为模板的RNA聚合酶主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作为活性前体，并以Mg2＋/Mn2＋为辅助因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，它不需要任何引物，催化生成的产物是与DNA模板链互补的RNA。
RNA或RNA-DNA双链杂合体不能作为模板。
●由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心。
β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。
●α亚基与核心酶的组装及启动子识别有关，并参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用。
●σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，它使酶专一性识别模板上的启动子。
σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍，酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时。
σ因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异性位点的结合常数降低104倍，使酶底复合物的半衰期小于1s。
因此，加入σ因子以后，RNA聚合酶全酶识别启动子序列的特异性总共提高了107倍。
E.coliRNApolymerase
RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别
上节课内容回顾
●基本概念:
转录翻译有义链反义链转录单位
●1.转录的基本特征
●2.RNA转录合成的特点
●3.复制和转录的区别
●4.原核生物转录的大致过程
●5.原核生物的RNApolymerase（亚基组成，各亚基的功能）
足迹法确定启动子序列
●基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，所以，RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录起始过程中首先要解决的问题。
有实验表明，对许多启动子来说，RNA聚合酶与之相结合的速率至少比布朗运动中的随机碰撞高100倍。
●Pribnow设计了一个实验，他把RNA聚合酶全酶与模板DNA结合后，用DNaseI水解DNA，然后用酚抽提，沉淀纯化DNA后得到一个被RNA聚合酶保护的DNA片段，约有41~44个核苷酸对。
●他分离了fd噬菌体等被酶保护的区域，并进行了序列分析，以后又有人做了50多个启动子的序列分析后发现，在被保护区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区（Pribnowbox），这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为－10区（goldberg-hognessbox）。
●不久后又从噬菌体的左、右启动子PL及PR和SV40启动子的－35bp附近找到了另一段共同序列:
TTGACA。
经过数年的努力，分析了46个大肠杆菌启动子的序列以后，确证绝大部分启动子都存在这两段共同序列，即位于－10bp处的TATA区和－35bp处的TTGACA区。
●-10位的TATA区和-35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力。
● SV40（Simianvacuolatingvirus40orSimianvirus40）是猴空泡病毒40，猿猴病毒40或猴病毒40的缩写，多瘤病毒科，这是在人类和猴子都发现的致瘤病毒。
1960年，科学家首次在猴子体内发现了SV40。
随后，科学家又在脊髓灰质炎试剂中发现了SV40，其原因是实验室在培养疫苗时使用了从猴子体内分离出的肾脏细胞。
SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，基因组5.2kb，病毒的直径45nm，病毒成熟部位于细胞核，无被膜，62个核壳粒亚单位，这种大小很适于基因操作。
同时它也是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒。
由于SV40结构简单，被首先应用于真核生物复制的研究。
增强子首先发现于SV40基因组内。
● SV40病毒的生命周期 根据SV40病毒感染作用的不同效应，可将其寄主细胞分成三种不同的类型。
SV40病毒在感染了CV-1和AGMK猿猴细胞之后，便产生感染性的病毒颗粒，并使寄主细胞裂解。
我们称这种感染效应为裂解感染（lyticinfection），而猿猴细胞则叫做受纳细胞（permissivecell）。
但如果感染的是啮齿动物（通常是仓鼠和小鼠）的细胞，就不会产生感染性颗粒，此时病毒基因组整合到寄生细胞的染色体上，于是细胞便被转化，也就是说发生了癌变。
我们称这种啮齿动物细胞为SV40病毒的非受纳细胞（non-permissivecell）。
人体细胞是SV40的半受纳细胞（semi-permissivecell），因为同SV40病毒接触的人体细胞中，只有1%～2%会产生出感染性的病毒。
● SV40病毒对猿猴细胞的裂解感染可分成三个不同的时相。
在感染了寄主细胞之后，有一段长达8～12小时的潜伏期，在这个期间，病毒颗粒脱去蛋白质外壳，同时DNA逐渐地转移到寄主细胞核内；紧接着4小时为早期时相，此时发生早期mRNA和早期蛋白质的合成，并出现病毒诱导寄主细胞DNA合成的激发作用；在这以后的36小时称为晚期时相。
进行病毒DNA、晚期mRNA和晚期蛋白质的合成，并在高潮时发生病毒颗粒组装。
大约在感染的第三天，细胞裂解，平均每个细胞可释放出105个的病毒颗粒。
●SV40病毒是一种小型的20面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA。
同其它病毒不同，SV40DNA是同除了H1之外的所有寄主细胞组蛋白（H4、H2a、H2b和H3）相结合。
这些组蛋白使病毒DNA分子紧缩成真核染色质所特有的念珠状核小体，这种结构特称为微型染色体（minichromosome）。
感染之后的SV40基因组，输送到细胞核内进行转录和复制。
SV40病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的，据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区。
围绕在SV40DNA复制起点周围约400bp的DNA区段，是十分引人注意的。
现在已经弄清紧挨这个起点的DNA序列，是调节早期和晚期初级转录本合成的控制信号。
早期转录本的合成，就是由位于这个区段内的由一对72核苷酸序列串联而成的强化因子序列激活的。
●SV40病毒基因组表达的一个重要特点是，它的RNA剪辑模式非常复杂。
通过不同的剪辑途径，早期初级转录本加工成2种不同的早期mRNA（多瘤病毒的早期初级转录本加工成3种不同的早期mRNA）；而晚期的初级转录本加工成3种不同的晚期mRNA。
● 这2种早期mRNA分别编码大T抗原的小t抗原（即肿瘤蛋白质或抗原）。
晚期转录本按照其特定的沉降系数，可区分为16S、18S和19S三种mRNA，它们分别编码Vp1、Vp3和Vp2病毒蛋白质。
Vp1编码区同Vp2和Vp3的编码区是以不同的转译结构形式彼此交叠的。
在SV40病毒基因组中存在着一个增强子序列。
其长度为72bp，以串联重复的形式位于基因组DNA复制起点的附近，它的主要功能是促进病毒DNA发生有效的早期转录，而且具有一般增强子所共有的基本特性。
外源的基因可以融合在SV40DNA的早期转录区段内，而SV40的增强子又能够有效地激活SV40早期转录单位的转录活性。
因此显而易见，SV40增强子在哺乳动物的基因操作中是相当有用的。
此外，SV40增强子还可以增强由细胞启动子启动的基因转录作用。
1、启动子的两个组成部分
2、RNA聚合酶的进入位点
3、RNApol在DNA上结合位点的鉴定
●（基因表达调控的正控制位点）
●CAP（catabolitegeneActivatorProtein）降解物基因活化蛋白环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白
●这是一种二聚体蛋白质，每个亚基含209个氨基酸残基，可起转录起始因子的作用，在有cAMP时，能使操纵子有效地进行转录。
Ø一些物理化学的研究表明，CAP结构变化与cAMP的结合有关。
采用保护降解法的分析，可知在lacP区上游-72~-52核苷酸对处有一个CAP结合位点，但只有在有cAMP时，CAP才能结合于此位点。
CAP结合位点中有一段对称反向重复序列：
这一序列的第3位和倒数第3位的G／C对之一突变成A／T对后，也影响cAMP-CAP与它的结合，而成为启动子下降突变。
●启动子有两个CAP结合位点：
●a、位点Ⅰ：
在-70到-50，包含一个反向重复序列，这似乎是大多数强结合位点的特征；
●b、位点Ⅱ：
在-50到-40，很弱的结合位点，但是当cAMP-CAP复合物结合于位点Ⅰ时，位点Ⅱ结合cAMP—CAP复合物的能力显著提高。
这也就是所谓协同效应。
●c、一旦位点Ⅱ被占据，RNA聚合酶就很快与-35序列结合，然后再与-10序列结合。
●CAP位点功能：
●a、如果缺少CAP位点，-35和-10序列存在并能保持完整，但是-35序列不能很好地结合RNA聚合酶；而-10序列确实能结合RNA聚合酶，但是得到的是一个闭合的启动子复合物，DNA双螺旋不能打开，转录不能进行。
●b、CAP—cAMP复合物的结合，使CAP位点Ⅱ附近的富含G·C区域双螺旋结构稳定性降低，因而使Pribnow框（-10）的熔解温度降低，从而促进了开放性启动子复合物的形成。
●关于乳糖操纵元的启动子突变体lac—UV—5的研究支持上面的观点。
●cAMP-CAP复合物与DNA结合改变了这一区段DNA次级结构，促进了RNA聚合酶结合区的解链。
cAMP-CAP先通过与RNA聚合酶结合，再与DNA结合，因而促进了RNA聚合酶与启动子的结合，从而增强了转录。
● cAMP-CAP复合物的形成取决于细胞内cAMP的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于其抑制腺苷酸环化酶的活性，ATP不能转化为cAMP，细胞内cAMP浓度降低，形不成CAP-cAMP复合物，因而乳糖结构基因不被转录。
原核启动子：
约55bp，分为起始点（startsite）、结合部位、识别部位
起始点：
转录起始部位以+1表示，转录的第1个核苷酸常为嘌呤---G，A
结合部位：
约6bp组成，是高度保守区，共有序列为5‘-TATAAT-3’，位于起始点上游-10。
因Tm低，DNA易解开双链，为RNA聚合酶提供场所
识别部位：
约6bp组成，在-35处，为高度保守区，序列5'-TTGACA-3'
●a、这一序列的核苷酸结构在很大程度上决定了启动子的强度:
RNA聚合酶对强启动子容易识别，对弱启动子识别比较差。
●b、-35序列的碱基序列通过影响开放型启动子复合物的形成速度而控制转录。
●c、-35序列、-10序列是决定启动子强度的重要因素，细胞可以由此来调节单位时间内所转录的mRNA分子数量，进而控制蛋白质合成的速度。
●RNA聚合酶是通过氢键互补的方式识别启动子的。
在启动子区DNA双螺旋结构中，腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶上的某些基团是氢键供体，而4种碱基中的某些基团是氢键受体。
由于它们分别处于DNA双螺旋的大沟或小沟内，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有处于特定空间构象的氢键受体与供体，当它们与启动子中对应的分子在一定距离内互补时，就形成氢键，相互结合。
☐在RNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物。
解链区一般在-9～+13之间，而酶与启动子结合的主要区域在其上游。
启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closedcomplex）。
伴随着DNA构象上的重大变化，封闭复合物转变成开放复合物（opencomplex），聚合酶全酶所结合的DNA序列中有一小段双链被解开。
●4、启动子各位点与转录效率的关系
●
（1）－35序列与－10序列与转录效率的关系
●标准启动子－35TTGACA
●－10TATAAT
●在原核生物中，-35区与-10区之间的距离大约是16～19bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。
保持启动子这二段序列以及它们之间的距离都是重要的，否则就会改变它所控制基因的表达水平。
●原因:
因为增减bp，-35区相对于-10区旋转（增减一个bp会使两者之间的夹角发生360的变化）所产生的超螺旋会发生改变。
若要使酶与DNA在这个区域内保持正确的取向，就必须使二者之一发生扭曲，需要增加结合自由能。
●在细菌中常见两种启动子突变，一种叫下降突变（downmutation），如果把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平;另一类突变叫上升突变（upmutation），即增加Pribnow区共同序列的同一性。
例如，在乳糖操纵子的启动子中，将其Pribnow区从TATGTT变成TATATT，就会提高启动子的效率，提高乳糖操纵子基因的转录水平。
E.Coli各σ识别的启动子的序列
本节内容
●一、真核生物的RNApol
二、真核生物的启动子
三、真核生物转录的起始
●真核生物中共有3类RNA聚合酶，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同。
真核生物RNA聚合酶一般有8～14个亚基所组成，相对分子质量超过5×105。
一、真核生物的RNApol
●真核生物线粒体和叶绿体中还存在着不同的RNA聚合酶。
线粒体RNA聚合酶只有一条多肽链，相对分子质量小于7x104，是已知最小的RNA聚合酶之一，与T7噬菌体RNA聚合酶有同源性。
叶绿体RNA聚合酶比较大，结构上与细菌中的聚合酶相似，由多个亚基组成，部分亚基由叶绿体基因组编码。
●二、真核生物的启动子
●三种RNApol→三种转录方式
●三种启动子→三类基因，Ⅰ类Ⅱ类Ⅲ类
●
（1）帽子位点（capsite）：
转录起始位点
●与Prok.的“CAT模式”相似
●
●原核和真核基因转录起始位点上游区的结构存在很大的差别。
原核基因启动区范围较小，TATAAT（Pribnow区）的中心位于-10，上游只有TTGACA区（-35区）作为RNA聚合酶的主要结合位点，参与转录调控;
●真核基因的调控区较大，TATAA/TA区位于-20～-30，而-40～-110区为上游激活区。
真核基因除了含有可与原核基因启动子相对应的CAAT区（－70～78区）之外，大多数基因还拥有GC区和增强子区。
●CAAT框（CAATbox）
●•位于－75bp处
●•一致序列为GGC/TCAATCT
●•前两个G的作用十分重要（转录效率）
●•控制转录起始的效率、频率，基本不参加起始位点的确定，不影响启动子的特异性
●☻以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在
不同元件的组合情况
数目、位置和排列方向均有差异
●尽管3种UPE序列都有重要功能，但并非所有基因的启动子区都包含这三个序列。
●例：
SV40的早期基因，无TATA和CAAT区
替代序列：
6个串联在-40~-110位点的GC区
组蛋白H2B：
无GC区
有两个CAAT区，一个TATA区
●真核细胞中存在着大量特异性或组成型表达的、能够与不同基因启动子区UPE相结合的转录调控因子。
基因转录实际上是RNA聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。
（4）增强子（enhancer）
●定义
●增强子的发现
●分类
●作用特点
增强子的分类
●增强子可分为细胞专一性增强子和诱导性增强子两类：
●①组织和细胞专一性增强子。
许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性，只有在特定的转录因子（蛋白质）参与下，才能发挥其功能。
●②诱导性增强子。
这种增强子的活性通常要有特定的启动子参与。
●例：
金属硫蛋白基因可以在多种组织细胞中转录，又可受类固醇激素、锌、镉和生长因子等的诱导而提高转录水平。
实验证明增强子的作用
●将β-珠蛋白基因置于带有上述72bp序列的DNA分子上，发现它在体内的转录水平提高了200倍。
●插入部位：
上游1400bp
下游3300bp
●⑤无物种和基因特异性可以在异源基因上发挥作用。
●⑥顺式调节只调节位于同一染色体上的靶基因。
●⑦相位性其作用与DNA的构象有关。
●所有的增强子中均有一段由交替的嘧啶-嘌呤残基组成的DNA，这种DNA极易形成Z-DNA型；故有人认为在形成一小段Z-DNA后，增强子才有功能。
第五节原核生物与真核生物mRNA的特征比较
一原核生物mRNA的特征
●1·原核生物mRNA的半衰期短：
细菌基因的转录与翻译是紧密相联的，基因转录一旦开始，核糖体就结合到新生mRNA链的5’端，启动蛋白质合成，而此时该mRNA的3’端还远远没有转录完全。
在电子显微镜下，我们可以看到一连串核糖体紧紧跟在RNA聚合酶后面。
二真核生物mRNA的特征
●凡是编码功能蛋白的真核基因都通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录。
●真核基因几乎都是单顺反子，只包含一个蛋白质的信息，其长度在几百到几千个核苷酸之间。
●一个完整的基因，不但包括编码区（codingregion），还包括不编码氨基酸的5’和3’端的特异性序列。
1、真核生物mRNA的5’端的"帽子"
●真核生物的mRNA（不包括叶绿体和线粒体）5’端都是经过修饰的，基因转录一般从嘌呤起始，第一个核苷酸保留了5’端的三磷酸基团并能通过其3'-OH位与下一个核苷酸的5’磷酸基团形成二酯键，转录产物的起始序列为pppApNpNp……
●mRNA5'加帽的功能主要表现在4个方面：
●1）保护mRNA5’端不被降解细胞内存在许多RNA酶（RNase），它们可攻击游离的RNA分子。
RNA酶的降解从5'端起始，当在mRNA的5'端加上m7GpppG帽子后，带有3个连接磷酸的5'帽可阻止RNase切割。
5‘端加帽RNA的第一个加工过程
●5‘端加帽由3个酶反应步骤生成。
●步骤一：
一个磷酸盐基团从转录物的5‘端去除；
●步骤二：
GMP部分加上；
●步骤三：
给核苷酸添加一个甲基。
2、多数真核生物mRNA有poly（A）尾巴
●除组蛋白基因外，真核生物mRNA的3’末端都有poly（A）序列，其长度因mRNA种类不同而变化，一般为40～200个。
●poly（A）序列是在转录后加上去的，是在细胞核中的不均一核RNA阶段加上的。
poly（A）的加工过程
●分为四个事件：
●1、mRNA切割
●2、许多腺嘌呤残基被添加到其3‘端
●3、由5’到3‘核酸酶进行的对换与RNA聚合酶结合着的RNA的降解
●4、由聚合酶进行的转录终止
●在聚合酶接近基因的末端时，CPSF（切割和聚腺苷酸化特异性分子）和CstF（切割刺激因子）两个蛋白质复合体由聚合酶的CTD运载，一旦poly-A信号转录到RNA中，CPSF和CstF便结合到RNA上，并募集其他蛋白质，先引起RNA的切割，然后再多聚腺苷酸化。
●1，切割及多聚腺苷酸化特异因子（CPSF）及切割活化因子（CstF）两个蛋白质复合物会开始与末端的RNA聚合酶Ⅱ结合。
●2，当RNA聚合酶Ⅱ前进时经过多聚腺苷酸化信号序列的CPSF，及CstF转移至新的mRNA前体，CPSF会与AAUAAA序列结合，而CstF会与其后3的GU序列或充满U的序列结合。
● 4，CPSF及CstF会在约AAUAAA序列后35个核苷启动切割。
多聚腺苷酸聚合酶（PAP）会立即展开编写多聚腺苷酸尾。
细胞核内的多聚腺苷酸结合蛋白（PABPN1）会立即与新的多聚腺苷酸序列结合。
● 5，CPSF会开始游离，而PAP会继续多聚腺苷酸化及编写约50-250个核苷（视乎生物的品种）的腺苷尾。
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