变更场地的可比性研究以注射用重组人生长激素为例范文.docx
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变更场地的可比性研究以注射用重组人生长激素为例范文
摘要
研究背景：
在研发过程中或正式批准后生物制品的生产商经常会发生一些变更。
变更的原因为改进生产工艺、增大规模、扩建/新建车间、提高产品稳定性和符合法规规定。
当发生这些变更时，生产商通常需要评价产品的相关质量指标，以证明变更没有对药品的安全和有效性产生不利的影响。
研究目的：
通过新建车间和老车间生产的注射用重组人生长激素比较研究，分析两个车间注射用重组人生长激素产品质量是否有差异，证明新车间产品是安全性和有效性。
研究方法：
1、工艺的研究：
根据老车间的历史数据，从被变更的工艺参数和关键质量属性的关系出发，在确定关键工艺参数和关键物料属性的基础上，研究是否由于变更而导致终产品质量的改变。
2、所涉及厂房的评估：
根据工艺研究结果对涉及到的变更进行风险评估，对变更的潜在影响进行分析。
3、产品安全性和有效性研究：
用产品放行标准为依据，通过比较两个车间原液、半成品和成品的关键质量属性，评价两个产品的一致性。
研究结果：
用产品放行标准为依据，我们以新车间生产的20批原液和老车间原液历史上数据为比较的基础，进行了生物学活性、免疫化学性质，原液纯度、杂质和污染情况比较，证明两个车间的产品没有显著差异。
强制降解试验对比表明没有发现两个车间原液的降解产物的降解产物种类和降解速率有显著差异。
两个车间3批原液的长期稳定性没有显著差异。
结构确证研究表明两个车间的一级和二级没有差异。
大鼠体内生物学活性符合要求，没有显著差异。
加速和长期稳定性研究表明，两者从杂质分布和降解速率上没有显著差异。
产品质量的相似性主要是由于新车间的在满足产品的工艺要求的基础上，并没有关键工艺参数的变更。
发酵和冻干规模的放大没有对关键工艺参数的控制产生影响。
这些证据表明新车间厂房和设备的验证表明其达到了设计要求，并可以满足注射用重组人生长激素的工艺要求。
研究结论：
由于市场对于产品需求增大经常导致了厂房变更。
用生产注射用重组人生长激素厂房变更为案例清楚表明：
如果设计合理，在符合cGMP原则的理念的指导下，通过产品质量放行标准进行严格的比较学研究证明了在中国厂房变更的可实现性。
关键词：
重组人生长激素；可比性研究；场地变更，新建车间
ComparabilityStudyofInjectableRecombinantHumanGrowthHormoneProducedfromOriginalFacilityandNewlyBuiltFacility
Abstract
Background:
Duetomarketincreaseddemandofbiologicaltherapeutics,anewfacilityisrequiredtomeetthemarketneed.Acriticalsystemicevaluationusingproductqualityspecificationforlotreleaseisdesignedandimplementedfortheproductsproducedfrombothoforiginalfacilityandnewlybuiltfacility.ThishasbeendemonstratedaverysuccessfulapproachforthecasestudyofrecombinanttherapeuticproteinhumangrowthhormoneinShanghai,CHINA.
ResearchObjective:
ByanalysisandcomparisonoftheCQAoftheproductsproducedfromoriginalfacilityandnewlybuiltfacility,wewouldtoconvinceourselfandChinesedrugapprovalagenciesthatthefacilitychangenotonlymeetourmarketdemand,butmostimportantlyalsomeettherequirementofdrugquality.
Methods:
Themethodsusedweretheriskanalysisandcontrolforallthepossiblechangesinbio-processduetofacilitychange,andtheeffectsofdifferencesbetweenoriginalfacilityandnewfacilityonthequalityofdrugproduct.Finally,bioassaysandregularanalyticalassayswereusedtoshowthequalitysimilarityofDrugSubstancesandDrugProduct.
Results:
Ouranalyticaldatausing20lotsofdrugsubstancesfromnewlybuiltfacilitytocomparethedatageneratedforthedrugsubstancesfromtheoriginalfacilityforbiologicalpotency,in-vivoactivity,immunochemicalproperties,purityandimpurityshowsgreatsimilarity.Degradationoftheproductsunderstressconditionsdisplayedsimilarprofilesfordegradationproductsanddegradationrates.Inaddition,ourstructuralanalysisindicatedthesimilarityofprimaryandsecondarystructuresofthefinalproductsfromthebothfacility.AlltheevidencesdeterminedthefacilitychangehasNOnoticeableorveryminimalconcernstomanufactureourcurrentproductoncethecorrectdesignandstrategywereused.
Conclusions:
Ourcasestudyusinginjectablerecombinanthumangrowthhormoneclearlyindicatedthat,inChina,asuccessfulfacilitychangeforbiologicaltherapeuticswithsimilardrugqualityprofileincomparisonwiththeoriginalfacilitycanbeachievedifalogicaldesignandcGMPconceptiscorrectlyimplemented.
Keywords:
recombinanthumangrowthhormone,comparableresearch,facilitychange,newfacility
目 录
第1章概述1
1.1重组人生长激素的发展历史1
1.2场地变更的原因2
1.3注射用重组人生长激素工艺流程2
第2章研究目的与意义2
第3章注射用重组人生长激素产品介绍2
3.1原液的研究方法和质量标准2
3.1.1重组人生长激素的结构2
3.1.2放行标准2
3.2原液的研究方法和质量标准2
3.2.1重组人生长激素的结构2
3.2.2放行标准2
3.2.3生物学活性2
3.2.4免疫化学性质2
3.2.5强制降解试验和长期稳定性2
3.3半成品的研究方法和质量标准2
3.4成品的研究方法和质量标准2
第4章初步风险评估2
4.1输入物料的变更分析和风险评估2
4.2工艺的变更分析和风险评估2
第5章对比研究结果2
5.1原液的对比研究结果2
5.1.1结构确证2
5.1.2生物学活性2
5.1.3免疫化学性质2
5.1.4纯度、杂质和污染2
5.1.5强制降解试验结果2
5.1.6长期稳定性2
5.1.7工艺验证结果和讨论2
5.2成品的对比研究结果2
5.2.1放行检验结果2
5.2.2生物学活性2
5.2.3稳定性2
5.2.4半成品的对比研究结果2
第6章可比性研究讨论2
第7章结论2
第1章概述
1.1重组人生长激素的发展历史
人生长激素（hGH）是由脑垂体前叶，含有嗜酸性颗粒的生长激素（GH）分泌细胞所分泌，为191个氨基酸构成的肽类激素。
正常情况下，生长激素hGH呈脉冲式分泌，生长激素（HGH）的分泌受下丘脑产生的生长激素释放素（GHRH）的调节，还受性别、年龄和昼夜节律的影响，睡眠状态下分泌明显增加。
生长激素的主要生理功能是促进神经组织以外的所有其他组织生长；促进机体合成代谢和蛋白质合成；促进脂肪分解；对胰岛素有拮抗作用；抑制葡萄糖利用而使血糖升高等作用。
生长激素主要生理作用是对人体各种组织尤其是蛋白质有促进合成作用，能刺激骨关节软骨和骨骺软骨生长，因而能增高。
人体一旦缺乏生长激素就导致生长停滞。
1886年PierreMarie第一次在临床上观察到脑下垂体的功能，发现在肢端肥大病人中脑下垂体增大。
20世纪约翰霍普金斯医院的HarveyCushing第一次试验发现垂体前叶在人、小鼠和狗中具有促生长作用[1~4]。
1921年，Evans和Long牛垂体前叶的提取物可以刺激正常大鼠的生长[5]，很快又发现此提取物可以使去垂体的大鼠保持生长[6]。
促进生长的提取物发现可以刺激合成代谢效应，降低尿中氮、钙和磷的排泄[7,8]。
尿中这些元素的测定提供了一个简便的生物活性检测方法，并用于在垂体提取物中分离活性组分。
1944年Li和Evans第一次从牛垂体中分离现在已知为生长激素的多肽激素[9]。
由于牛生长激素没有成功的促进人的长高[10]，因此人们开始从尸体或去除垂体的乳腺按患者的垂体中提取人生长激素[11-13]。
在临床试验中，人和猴子的生长激素产生了合成代谢，并刺激了长高[14-15]。
猿和非猿的生长激素的的生物化学差异被鉴别出来，同时解释了生理效应的物种特异性[14]。
在1957和1985年之间，从尸体垂体提取的人生长激素被用于很多生长激素缺乏儿童的激素替代治疗中[16]。
在此期间，生长激素治疗发现是有效并没有什么副反应。
然而，人垂体生长激素是稀缺和昂贵的。
其他治疗的应用开发，或人生长激素的细胞作用机理的研究时不可能的。
科学的进步改变了人生长激素领域的发展。
人生长激素的DNA被克隆到了细菌质粒上[17]，从此开辟了基因工程人生长激素商业化的道路。
1985年被报道[18]发现儿童期使用人生长激素的儿童，成年后发现罹患致命的神经退行性疾病-克雅病，因此美国食品药品监督管理局（FDA）在上世纪80年代命令停止一切提取自死人脑垂体的hGH，并不准应用于人体上。
这一事件促发了重组人生长激素在临床上商业化使用。
随着在细菌中大规模生产人生长激素，人生长激素的供应不再成为人体或实验室进行各种治疗研究的限制。
20世纪80年代，基因工程兴起。
1981年Genentech公司利用大肠杆菌（E.Coli）包涵体技术研制出含192氨基酸的基因重组人生长激素——Met-rhGH。
与天然hGH相比，在N-末端多了一个蛋氨酸残基，又称为somatrem（Protropin®）。
随着基因工程技术的发展，1986年通过基因重组技术合成出含天然序列的重组人生长激素。
上世纪90年代人们纯化了人生长激素受体蛋白，并克隆了基因[19,20]。
通过X射线晶体衍射解析了人生长激素受体蛋白和人生长激素的相互作用的三维结构[21]。
生长激素受体结构的知识对生长激素信号传导机理的研究提供了新的视野和方向。
直接单位点突变技术被用于对生长激素配体-受体相互作用的研究[22]，分子方法也被用于生长激素受体激动剂的设计。
人生长激素基因簇大约有66,500个碱基，位于第17染色体的长臂上[23]。
由GH-N（正常生长激素基因），CS-L（类绒毛膜生长激素），CS-A（绒毛膜生长激素A），GH-V（生长激素变体基因，也是胎盘生长激素）和CS-B（绒毛膜生长激素B）5个基因家族组成。
GH-N和GH-V有时也称为GH-1和GH-2。
绒毛膜生长激素也是胎盘催乳素基因。
这5个基因的DNA序列高度同源。
因此猜测生长激素基因家族通过基因复制而产生的。
只有GH-N是正常健康必须的。
切除或突变GH-N基因引起IA型生长激素缺乏，这是最严重的生长激素缺乏。
具有这个缺陷的个体不能产生内源性生长激素。
在出生或出生3~6个月引起有明显的重度低血糖和生长延缓[24]。
这些患者初始对生长激素替代有响应，但治疗1年内由于生长激素抗体产生而抑制了生长。
GH-N基因在垂体前叶表达，是在儿童和成年人中循环的主要形式[25]。
生长激素是分泌蛋白，它的合成是一个含26个氨基酸的激素前体。
当生长激素跨过内质网膜转运到贮藏粒中时信号肽被切除。
GH-N表达的生长激素是一个22kDa，191个氨基酸的单链多肽。
生长激素生物活性构象含有两个二硫键桥。
22kDaGH-N基因产物在人的肝脏和受体结合，并刺激IGF-1的产生和长高。
所有的人生长激素都是采用注射的方式给药。
皮下和肌内注射时等价的[26]。
因为有较小的疼痛感，皮下注射更好。
腹部的皮下注射比大腿的皮下注射有更高的生长激素血清浓度，然而刺激IGF-1的水平相当[27]。
在循环系统内生长激素和高亲和的生长激素结合蛋白（GHBP）结合，和这个蛋白结合延长了生长激素在循环系统的半衰期。
给药的时间不影响血清中生长激素的水平，晚上给药模拟了生理的生长激素峰值[28]。
生长激素的清除半衰期大约在2到3小时之间。
通过在肝脏和肾脏的代谢而清除的，成年人比儿童清除速率更快[29]。
人生长激素是非糖基化的，因此目前国际上已经批准上市的重组人生长激素主要是由细菌（E.Coli）生产的，如Genentech的Nutropin®，EliLilly的Humatrope®，NovoNordisk的Norditrope®等。
也有用哺乳动物细胞生产的，如Serono的Saizen®；以及由酵母生产的，如LG的Valtropin®。
表1列出了目前主要重组人生长激素的生产商和在美国和中国批准上市的时间。
我国内已上市产品均是由大肠杆菌（E.Coli）生产的。
表1主要重组人生长激素的生产商
生产商
商品名
美国批准日期
中国批准日期
美国礼来制药
Humatrope
1987年3月
2009年6月
美国基因技术公司
Nutropin
1993年11月
/
辉瑞制药
Genotropin
1995年8月
2009年7月
默克雪兰诺
Saizen
1996年10月
2008年4月
诺和诺德制药有限公司
NorditropinFlexpro
2000年6月
2008年6月
山德士制药有限公司
Omnitrope
2006年5月
/
上海联合赛生物工程有限公司
珍怡
/
1999年7月
长春金赛药业有限责任公司
赛增
/
1998年
安徽安科生物工程股份有限公司
安苏萌
/
1999年
*met-hGH已下市
重组人生长激素在大肠杆菌中的表达有两种形式，第一种形式是甲硫氨酸生长激素m-hGH，他和天然生长激素有一个氨基酸的差异，在N端多了一个甲硫氨酸，美国基因技术公司和诺和诺德最初的产品就是m-hGH，目前这种形式的重组人生长激素已经下市。
第二种形式是真实的人生长激素。
一些研究表明甲硫氨酸生长激素比真实的人生长激素产生较高的抗体[30]，美国礼来公司的Humatrope是第一个批准的和天然序列一致的重组人生长激素[31]。
甲硫氨酸残基和细菌蛋白结合的痕量的人生长激素比单纯的甲硫氨酸人生长激素产生更高的免疫原性，这个问题可以通过纯化而缓解。
抗体的产生很少干扰人生长激素的生物活性，因为抗体的亲和性和浓度均较低[31]。
生长激素抗体水平使得市场不再追随甲硫氨酸人生长激素。
哺乳动物细胞的人生长激素有非常低的免疫原性[32]。
目前主要的重组人生长激素的生产商均提供的是和天然人生长激素一致的重组人生长激素。
大多数生产商采用的是大肠杆菌系统，因为目前批准上市的产品证明大肠杆菌系统表达的人生长激素的免疫原性并未对产品的有效性和安全性产生不利的影响采用大肠杆菌系统是最经济的，而且大肠杆菌系统已经是比较成熟的基因工程技术，上游构建和下游纯化均有比较成熟的技术，工艺控制比较稳定。
重组人生长激素是一个单链多肽激素，通常以生物活性的单体存在，但正像大家所知的他易聚集为二聚体，并在热和机械应力下（如制备过程中的摇动等）转化为多聚体而失去活性。
生长激素的药物配方趋向于不稳定，尤其在溶液中，生长激素容易生成降解产物，如脱氨和氧化产物。
主要的降解反应是1）直接水解脱氨或通过环状琥珀酰亚胺中间体而形成L-asp-hGH，L-iso-asp-hGH，D-asp-hGH以及D-iso-asp-hGH；2）在14和125位上甲硫氨酸残基的氧化；3）聚集；4）肽骨架的截断。
冻干状态以及溶液状态的生长激素的主要降解产物是脱氨组分。
脱氨发生在149的Asn天冬酰胺上，在152的天冬酰胺残基上也会产生少量的脱氨。
在溶液中人生长激素在14和125位上的甲硫氨酸极易氧化。
溶液中hGH氧化形成亚砜主要原因是配方中的溶解氧。
蒸馏水中氧气的溶解度大约是200uM，而对于4IU/ml的生长激素来说，其浓度相当于60nM。
在正常的储存条件下，溶解氧的量超过了3000倍生长激素的化学计量，所以是不能通过塞盖或包装前对缓冲溶液除气来解决溶解氧的问题。
很多降解反应多可以通过冻干从蛋白质中移走水分而显著降低，所以现在生长激素通常都是冻干的，在4℃以冻干形式储存的冻干剂型，使用前再重新溶解，大部分的商品重组人生长激素是冻干形式的。
除了常见的冻干形式制剂外，考虑到使用方便和患者的依从性，人生长激素的溶液制剂和缓释制剂的研究也很多。
目前国际上诺和诺德和美国基因技术公司均有溶液剂型的生长激素上市，但由于人生长激素在溶液中很不稳定，因此货架期要比冻干剂型短很多，而且对运输的要求也比较高，溶液剂型对温度的敏感性比冻干剂型高很多。
从二十世纪八九十年代至今，普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质的变性。
Dean[33]认为在冷冻过程中缺少保护剂的情况下，蛋白质将失去活性；而脱水过程本身能使蛋白质损伤，从而复水后蛋白失去活性。
保护剂的作用一般认为是通过与蛋白的氢键作用而保护了蛋白由于失去水分而裸露的基团。
保护剂的浓度和冻干速率相关，由于对于药物制剂来说保护剂的浓度不能过高，所以要有较大的冻干速率。
人生长激素制剂的稳定性是和水分以及氧有密切的关系，在低的水分含量以及最小氧的存在下制剂的稳定性最好[34]。
但是在不加保护剂的情况下，如果单纯降低水分含量可能适得其反，因为蛋白如果失去最后一层水分的保护，将因为基团的暴露而聚集变性。
有报道[35]人生长激素在含水量4.6%时完全变性，而在含水量7.6%时没有变性。
所以冻干过程应该加入合适的保护剂以及其他辅料，并且含水量不是越低越好。
较少氧对蛋白的氧化，可以通过充氮气来保护[36]。
冷冻干燥过程中的降温速率的选择与保护剂的浓度有关，如果保护剂浓度很高，以不太大的降温速率就能使溶液以玻璃态固化。
很多人认为快速冷冻有益于生物活性，因为快速冷冻可以减少缓冲液结晶引起的pH变化，减低蛋白质局部高离子强度的接触时间，减少变性可能发生的时间。
但是很多证据表明冻融和冷冻干燥后，快速冷冻对蛋白的活性回收不利，并对贮藏期冻干产品的稳定性也有影响[37]。
用磷酸缓冲液和甘露醇作为赋形剂体系，在pH7.4~7.8时，冷冻速率对人生长激素的可溶性聚合物形成的影响检测不到，可是对不溶性聚合物形成的影响是显著的，冷冻速率越高聚合物越多。
不溶性聚合物的形成被冷冻前的低pH加速。
冻干溶液的pH很重要，对脱氨的影响较大。
选用不同的缓冲溶液对pH的要求也不一样。
当选用磷酸盐作为缓冲液时，在较低的pH（6.0）下，有较少的脱氨组分，但在此pH下较易产生聚集[38]。
人生长激素溶液剂型就是选用较低的pH，添加非离子表面活性剂防止聚集。
人生长激素最常用的冻干保护剂是甘氨酸和甘露醇。
两种配方比很重要，根据剂量的不同两种物质加入的比例是不同一样的。
甘露醇作为保护剂和甘氨酸一起起到稳定冻干制剂的作用。
为了保证重新溶解后人生长激素的稳定，也有在溶解水中加入非离子表面活性剂来增加溶液的物理稳定性，如诺和诺德的NorditropinSimpleXx，在溶解水中加入泊洛沙姆188以增加物理稳定性。
表2列出了价格典型的商品化重组人生长激素的配方。
表2常见商品化重组人生长激素的冻干配方*
商品名
剂型
规格
赋形剂
缓冲盐
rhGH
甘氨酸
甘露醇
蔗糖
NaH2PO4
Na2HPO4
pH
Genotropin
冻干剂型
4.5IU
1.5
27.6
0
/
0.30
0.30
6.7
17.4
5.8
2.2
1.8
/
0.32
0.32
6.7
Humatrope
15
5
5
25
/
0
1.13
7.5
18
6
6
18
/
0
1.36
7.5
Nutropin
15
5
1.7
45
/
0.45
1.3
7.4
Saizen
15
5
/
/
34.2
6.5-8.5
*来源于FDA网站相关产品的说明书
表2中可以看到大多数上市产品采用的甘氨酸和甘露醇配方系统。
本文讨论的产品就是采用冷冻干燥技术制备的冻干粉针剂型，也采用和上市产品同样的甘氨酸和甘露醇体系，配方均得到批准，长期稳定性研究发现，冻干剂型和溶液剂型相比较在货架期要稳定的很多，这也是目前市场上还是主要以冻干剂型为主的原因。
1.2场地变更的原因
注射用重组人生长激素是上海联合赛生物工程有限公司已上市十多年的老产品，随着市场的扩大，原生产车间已不能满足市场需求，为此在原址上新建了注射用重组人生长激素生产车间，用于注射用重组人生长激素的生产。
由于在原址上新建，原质量检测、原辅材料采购和储存，以及质量保证系统均采用原来的系统，检测、原辅材料和质量保证系统的风险较低。
本次是在原厂址增建了一个注射用重组人生长激素的生产线，包括了原液生产车间和制剂生产车间，对于本次新建车间经历了下面几个阶段。
表3新增车间经历的阶段流程
阶段
要求
设计前
根据历史研究和生产数据分析和评估原液和制剂的关键工艺参数，
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