医学微生物学实验课件.ppt

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医学微生物学实验医学微生物学实验内内容容提提要要一一.实验室生物安全实验室生物安全二二.细菌的接种方法细菌的接种方法三三.革兰染色革兰染色1.1.通过介绍实验室生物安全方面的相关知通过介绍实验室生物安全方面的相关知识，树立识，树立“有菌的意识，无菌操作的观念有菌的意识，无菌操作的观念”。

2.2.掌握革兰染色方法和细菌接种技术。

掌握革兰染色方法和细菌接种技术。

3.3.观察细菌的特殊结构。

观察细菌的特殊结构。

实验目的实验目的v生物危害源生物危害源v化学危害源化学危害源v物理危害源物理危害源后两者的特性：

后两者的特性：

11、可感知，易避免、可感知，易避免22、危害范围有限、危害范围有限33、危害持续时间短、危害持续时间短一.实验室生物安全医学实验室的主要危害源包括哪些医学实验室的主要危害源包括哪些?

v惨痛的历史教训惨痛的历史教训例一：

例一：

19561956年，前苏联的一个实验室曾有年，前苏联的一个实验室曾有99支支装有感染了装有感染了委内瑞拉马脑炎病毒委内瑞拉马脑炎病毒的鼠脑的安瓿的鼠脑的安瓿被打破。

由于被打破。

由于没采取必要的措施没采取必要的措施，结果在几天，结果在几天内造成内造成2424名名工作人员感染。

工作人员感染。

一.实验室生物安全例二：

例二：

20042004年年44月，中国疾病预防控制中心月，中国疾病预防控制中心科研人员，采用未经论证的非典病毒灭活科研人员，采用未经论证的非典病毒灭活方法，方法，在不符合防护要求的普通实验室内在不符合防护要求的普通实验室内操作非典感染材料，造成北京、安徽发生操作非典感染材料，造成北京、安徽发生非典疫情。

非典疫情。

一.实验室生物安全例三例三：

20102010年年1212月东北农业大学月东北农业大学“羊活体解剖学实羊活体解剖学实验验”，共，共55个班级个班级2828人感染人感染布鲁氏菌病布鲁氏菌病。

采购人均未。

采购人均未要求养殖场出具检疫合格证明，断定未经检验的这要求养殖场出具检疫合格证明，断定未经检验的这44只山羊带有布鲁氏菌。

此外，导致此次感染的原因只山羊带有布鲁氏菌。

此外，导致此次感染的原因还有还有:

未能切实按照实验规范，严格要求学生遵守操未能切实按照实验规范，严格要求学生遵守操作章程，进行有效防护。

作章程，进行有效防护。

一.实验室生物安全v实验室感染的事件曾多次发生，实实验室感染的事件曾多次发生，实验室人员曾为此付出了沉重的代价。

验室人员曾为此付出了沉重的代价。

这些感染的这些感染的主要原因是：

防护意识主要原因是：

防护意识不强，操作失误，防护条件不足。

不强，操作失误，防护条件不足。

一.实验室生物安全医学微生物学实验室规则医学微生物学实验室规则v学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折，要学生进微生物实验室必须穿好工作服，离室需脱下反折，要经常清洗消毒。

经常清洗消毒。

v进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定进实验室时随带书包、衣物等与实验无关物品一律存放指定的储物柜内。

的储物柜内。

v严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。

严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。

v手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；手拿培养物后或出实验室前要洗手，必要时用消毒液泡手；避免有菌材料溅出；避免有菌材料溅出；破损器材及时处理并报告破损器材及时处理并报告。

v实验过程中避免一切不良的个人习惯；实验过程中避免一切不良的个人习惯；操作中产生的废料要操作中产生的废料要扔在指定容器内扔在指定容器内；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫；实验完毕清理台面，值日生严格认真打扫卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。

卫生，关闭水电，门窗，洗手后离开实验室。

实验室意外紧急处理办法实验室意外紧急处理办法v11皮肤破损：

去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后皮肤破损：

去除异物，生理盐水或蒸馏水洗净后2%2%碘酊碘酊或或2%2%红汞涂抹。

红汞涂抹。

v22烧伤：

局部涂凡士林，烧伤：

局部涂凡士林，2%2%鞣酸或鞣酸或2%2%苦味酸。

苦味酸。

v33化学药品腐蚀伤：

若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸化学药品腐蚀伤：

若强酸则先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用氢钠溶液洗涤中和；若强碱则先用大量清水冲洗，再用2%2%硼硼酸洗涤中和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡酸洗涤中和（若伤处为眼部加用橄榄油或者液体石蜡1122滴滴滴眼）。

滴眼）。

v44菌液入口：

立即吐入消毒容器内，菌液入口：

立即吐入消毒容器内，11：

10001000高锰酸钾或高锰酸钾或3%3%双氧水漱口，根据菌种服用抗菌药物。

双氧水漱口，根据菌种服用抗菌药物。

v55菌液污染台面：

菌液污染台面：

2%3%来苏尔或来苏尔或0.1%0.1%新洁尔灭覆盖新洁尔灭覆盖3030分分钟后抹去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡钟后抹去，皮肤手指沾染活菌应用上述液体浸泡33分后肥皂分后肥皂和清水洗净。

和清水洗净。

v66火警：

勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。

若酒精乙醇乙醚等火警：

勿慌，立即关闭电闸和煤气闸。

若酒精乙醇乙醚等有机溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。

有机溶剂起火切不可用水扑救，可用沙土等物扑灭。

二二.无菌操作技术无菌操作技术实验目的实验目的1.1.掌握常用的细菌接种方法掌握常用的细菌接种方法2.2.熟悉细菌生长现象的观察方法熟悉细菌生长现象的观察方法概念：

概念：

是人工配制的专供微生物生长繁殖的混是人工配制的专供微生物生长繁殖的混合营养物制品。

合营养物制品。

成分：

成分：

充足的营养物质（水分、碳源、氮源、充足的营养物质（水分、碳源、氮源、无机盐）；合适的无机盐）；合适的PHPH；适宜的温度；适宜的气体环；适宜的温度；适宜的气体环境。

境。

用途：

用途：

用于微生物的繁殖及分离接种，传代或用于微生物的繁殖及分离接种，传代或保存，鉴别微生物的类属，研究微生物的生理及生保存，鉴别微生物的类属，研究微生物的生理及生化特性等。

化特性等。

一、培养基一、培养基二、培养基分类二、培养基分类按按用途用途分分营养营养培养基：

培养基：

血液血液琼脂培养基琼脂培养基基础基础培养基：

培养基：

普通普通琼脂培养基琼脂培养基选择选择培养基：

培养基：

S-SS-S培养基培养基鉴别鉴别培养基：

培养基：

双糖铁双糖铁培养基培养基厌氧厌氧培养基：

培养基：

庖肉培养基庖肉培养基二、培养基分类二、培养基分类按按物理性状物理性状分分液体液体培养基：

培养基：

大量大量繁殖繁殖细菌细菌固体固体培养基：

培养基：

分离鉴定分离鉴定细菌细菌半固体半固体培养基：

培养基：

观察动力观察动力及保存菌种及保存菌种v普通固体琼脂培养基接种法普通固体琼脂培养基接种法1.平板分区划线平板分区划线接种法：

分离培养细菌。

接种法：

分离培养细菌。

2.斜面固体培养基斜面固体培养基接种法：

纯菌的移种，接种法：

纯菌的移种，短时间保存菌种。

短时间保存菌种。

v半固体琼脂培养基半固体琼脂培养基穿刺穿刺接种法接种法保存菌种或观察细菌的动力保存菌种或观察细菌的动力v液体培养基接种法液体培养基接种法用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等。

用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等。

三、细菌的接种方法三、细菌的接种方法1.1.平板分区划线接种平板分区划线接种-得单个菌落得单个菌落分区划线分区划线注意事项注意事项v划线时接种环与平皿约成划线时接种环与平皿约成30304040度角度角,轻轻接触轻轻接触,以以腕力腕力在琼脂在琼脂表面表面轻快滑动轻快滑动,不能划破琼脂。

不能划破琼脂。

v第一次划线应占平皿面积的第一次划线应占平皿面积的1/10,1/10,以后每次划线以后每次划线约占面积的约占面积的1/41/41/51/5。

v划线为划线为连续划线连续划线,不能间断。

应不能间断。

应占满平皿。

占满平皿。

划线划线不能交叉重复不能交叉重复。

v每次划完后应每次划完后应灭菌灭菌。

2.2.斜面接种法斜面接种法3.3.液体培养基接种法液体培养基接种法4.4.半固体培养基半固体培养基穿刺穿刺接种法接种法四、细菌生长现象的观察四、细菌生长现象的观察1.1.固体培养基固体培养基-菌落菌落单个单个细菌分裂繁殖形成一堆肉眼可见的细菌集团。

细菌分裂繁殖形成一堆肉眼可见的细菌集团。

观察菌落的形态、大小、表面、边缘、湿度、透明度；观察菌落的形态、大小、表面、边缘、湿度、透明度；在血平板上还要观察溶血情况和色素等。

在血平板上还要观察溶血情况和色素等。

2.2.半固体培养基半固体培养基-鞭毛鞭毛观察细菌的动力观察细菌的动力3.3.液体培养基液体培养基混浊生长混浊生长（大多数细菌）（大多数细菌）沉淀生长沉淀生长（链球菌）（链球菌）膜样生长膜样生长（专性需氧菌，（专性需氧菌，如结核分枝杆菌）如结核分枝杆菌）操作内容操作内容1.平板分区划线法。

平板分区划线法。

2.斜面培养基的接种方法。

斜面培养基的接种方法。

3.半固体培养基穿刺接种法。

半固体培养基穿刺接种法。

4.液体培养基的接种方法。

液体培养基的接种方法。

三三.细菌的形态学检查细菌的形态学检查染色标本检查染色标本检查单染法单染法：

简单染色，一种染料：

简单染色，一种染料（美蓝染色）（美蓝染色）复染法复染法：

复杂染色，两种以上染料（革兰染色、：

复杂染色，两种以上染料（革兰染色、抗酸染色）抗酸染色）革兰染色革兰染色（Gramstain）（Gramstain）v18841884年由丹麦细菌学家年由丹麦细菌学家GramGram创立。

创立。

v革兰染色是最常用的一种染色方法，可以革兰染色是最常用的一种染色方法，可以将细菌初步分为将细菌初步分为革兰染色阳性菌革兰染色阳性菌和和革兰染色革兰染色阴性菌阴性菌，在临床上具有非常重要的意义。

，在临床上具有非常重要的意义。

一、目的一、目的1.1.掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法。

掌握细菌涂片的制备及革兰染色的方法。

2.2.熟悉革兰染色的原理和临床意义。

熟悉革兰染色的原理和临床意义。

一一半半结结晶晶紫紫卢卢戈戈氏氏碘碘液液9955%乙乙醇醇石石碳碳酸酸复复红红初染媒染脱色复染凡能保留第一种染料结晶紫的凡能保留第一种染料结晶紫的蓝紫色蓝紫色的细菌叫的细菌叫G+菌菌，凡能被酒精脱色之后染上复染液石碳酸复红，凡能被酒精脱色之后染上复染液石碳酸复红的的红色红色的细菌叫的细菌叫G-菌菌。

G+G-二、原理二、原理通透性学说通透性学说G+菌菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联细胞壁结构致密，肽聚糖层厚且交联度高，脂质含量少，乙醇不易渗入。

度高，脂质含量少，乙醇不易渗入。

G-菌菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄且交联度低，含大量脂质，乙醇易渗入。

低，含大量脂质，乙醇易渗入。

等电点学说等电点学说vG+菌菌等电点等电点（pI23）G-菌菌等电点等电点（pI45）v在相同在相同pH条件下条件下G+菌菌所带负电荷比所带负电荷比G-菌菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。

牢固，不易脱色。

三、器材和试剂三、器材和试剂1.1.菌种：

菌种：

白色葡萄球菌白色葡萄球菌大肠杆菌大肠杆菌2.2.试剂：

试剂：

革兰染色液革兰染色液初染液初染液结晶紫结晶紫媒染液媒染液卢戈氏碘液卢戈氏碘液脱色液脱色液95%95%乙醇乙醇复染液复染液稀释石碳酸复红稀释石碳酸复红3.3.其它：

其它：

接种环接种环载玻片载玻片染色盘染色盘洗液瓶洗液瓶酒精灯等酒精灯等冲洗冲洗3、使用油镜观察实验结果、使用油镜观察实验结果四、四、方法与步骤方法与步骤1、细菌涂片的制备、细菌涂片的制备涂片涂片干燥干燥固定固定2、染色、染色初染初染（结晶紫）（结晶紫）媒染媒染（卢戈氏碘液）（卢戈氏碘液）脱色脱色（95%乙醇）乙醇）复染复染（稀释石碳酸复红）（稀释石碳酸复红）吸水纸吸干吸水纸吸干1min1min30s30s冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗冲洗一一半半G+菌菌G-菌菌结结晶晶紫紫卢卢戈戈氏氏碘碘液液9955%乙乙醇醇石石