免疫组化070524-25-student.ppt

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细胞生物学研究方法与技术细胞生物学研究方法与技术细胞生物学研究方法与技术细胞生物学研究方法与技术北京大学医学部北京大学医学部北京大学医学部北京大学医学部基础医学院基础医学院基础医学院基础医学院细胞生物学系细胞生物学系细胞生物学系细胞生物学系刘羿男刘羿男刘羿男刘羿男免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术一、免疫细胞化学技术的概述一、免疫细胞化学技术的概述一、免疫细胞化学技术的概述一、免疫细胞化学技术的概述二、组织和细胞标本的制备二、组织和细胞标本的制备二、组织和细胞标本的制备二、组织和细胞标本的制备三、免疫组化常用的染色方法三、免疫组化常用的染色方法三、免疫组化常用的染色方法三、免疫组化常用的染色方法免免免免疫疫疫疫细细细细胞胞胞胞化化化化学学学学（ImmunocytochemistryImmunocytochemistry,ICC）ICC）又又又又称称称称为为为为免免免免疫疫疫疫组组组组化化化化（ImmunohistochemistryImmunohistochemistry，IHC）IHC）是是是是是是利利利利利利用用用用用用抗抗抗抗抗抗原原原原原原与与与与与与抗抗抗抗抗抗体体体体体体特特特特特特异异异异异异性性性性性性结结结结结结合合合合合合的的的的的的原原原原原原理理理理理理，通通通通通通过过过过过过化化化化化化学学学学学学反反反反反反应应应应应应使使使使使使标标标标标标记记记记记记抗抗抗抗抗抗体体体体体体的的的的的的显显显显显显色色色色色色剂剂剂剂剂剂（荧荧荧荧荧荧光光光光光光素素素素素素、酶酶酶酶酶酶、金金金金金金属属属属属属离离离离离离子子子子子子、同同同同同同位位位位位位素素素素素素）显显显显显显色色色色色色来来来来来来确确确确确确定定定定定定细细细细细细胞胞胞胞胞胞内内内内内内抗抗抗抗抗抗原原原原原原的的的的的的成成成成成成分分分分分分（主主主主主主要要要要要要是是是是是是多多多多多多肽肽肽肽肽肽和和和和和和蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白质质质质质质），对对对对对对其其其其其其进进进进进进行行行行行行定定定定定定位位位位位位、定定定定定定性性性性性性及及及及及及定定定定定定量的研究，称为量的研究，称为量的研究，称为量的研究，称为量的研究，称为量的研究，称为。

一、免疫细胞化学技术的概述一、免疫细胞化学技术的概述一、免疫细胞化学技术的概述一、免疫细胞化学技术的概述对抗体的要求：

纯度高、比活性强；对抗体的要求：

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纯度高、比活性强；具具具具有有有有特特特特异异异异性性性性高高高高和和和和亲亲亲亲和和和和力力力力强强强强的的的的抗抗抗抗体体体体是是是是实实实实验验验验成成成成功的首要条件。

功的首要条件。

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对对对对抗抗抗抗原原原原的的的的要要要要求求求求：

纯纯纯纯度度度度高高高高，免免免免疫疫疫疫原原原原性性性性强强强强，稳稳稳稳定定定定无变化。

无变化。

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高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。

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（一一一一）对抗原和抗体的要求对抗原和抗体的要求对抗原和抗体的要求对抗原和抗体的要求（二二二二）抗原抗原抗原抗原（antigen,Ag）（antigen,Ag）能能能能刺刺刺刺激激激激机机机机体体体体产产产产生生生生免免免免疫疫疫疫应应应应答答答答，并并并并能能能能与与与与免免免免疫疫疫疫应应应应答答答答产物特异性结合的物质称为抗原。

产物特异性结合的物质称为抗原。

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抗原具有两个特性，即免疫原性和反应原性。

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免免免免免免疫疫疫疫疫疫原原原原原原性性性性性性：

引引引引引引起起起起起起机机机机机机体体体体体体产产产产产产生生生生生生抗抗抗抗抗抗体体体体体体和和和和和和（或或或或或或）致致致致致致敏敏敏敏敏敏淋淋淋淋淋淋细细细细细细胞的特性；胞的特性；胞的特性；胞的特性；胞的特性；胞的特性；免免免免免免疫疫疫疫疫疫反反反反反反应应应应应应性性性性性性：

能能能能能能与与与与与与相相相相相相应应应应应应的的的的的的抗抗抗抗抗抗体体体体体体及及及及及及致致致致致致敏敏敏敏敏敏淋淋淋淋淋淋巴巴巴巴巴巴细细细细细细胞胞胞胞胞胞发生特异的结合或反应的特性。

发生特异的结合或反应的特性。

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根据抗原是否显示免疫原性分为：

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完完完完完完全全全全全全抗抗抗抗抗抗原原原原原原：

分分分分分分子子子子子子量量量量量量较较较较较较大大大大大大，一一一一一一般般般般般般在在在在在在10kDa10kDa10kDa10kDa10kDa10kDa以以以以以以上上上上上上，并并并并并并具有较复杂的化学组成。

具有较复杂的化学组成。

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免免免免免免疫疫疫疫疫疫原原原原原原性性性性性性最最最最最最强强强强强强的的的的的的是是是是是是蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白质质质质质质抗抗抗抗抗抗原原原原原原，多多多多多多糖糖糖糖糖糖次次次次次次之之之之之之；脂脂脂脂脂脂类类类类类类和和和和和和核核核核核核酸酸酸酸酸酸必必必必必必需需需需需需和和和和和和蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白质质质质质质及及及及及及多多多多多多糖糖糖糖糖糖形形形形形形成成成成成成复复复复复复合合合合合合物物物物物物才才才才才才具具具具具具有良好的免疫原性。

有良好的免疫原性。

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半半半半半半抗抗抗抗抗抗原原原原原原：

又又又又又又称称称称称称为为为为为为不不不不不不完完完完完完全全全全全全抗抗抗抗抗抗原原原原原原，分分分分分分子子子子子子量量量量量量较较较较较较小小小小小小。

例例例例例例如如如如如如：

某些短肽、多糖、类脂和药物等。

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半抗原必需与半抗原必需与半抗原必需与半抗原必需与半抗原必需与半抗原必需与载体载体载体载体载体载体结合，才能获得免疫原性。

结合，才能获得免疫原性。

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载载载载体体体体是是是是具具具具有有有有高高高高度度度度免免免免疫疫疫疫原原原原性性性性的的的的大大大大分分分分子子子子物物物物质质质质，具具具具有有有有将将将将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。

免疫原性传递给耦联的半抗原能力。

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常常常常常常用用用用用用的的的的的的载载载载载载体体体体体体有有有有有有钥钥钥钥钥钥孔孔孔孔孔孔血血血血血血蓝蓝蓝蓝蓝蓝蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白（keyhole（keyhole（keyholelimpetlimpetlimpethemocyaninhemocyaninhemocyanin，KLH）KLH）KLH）、牛牛牛牛牛牛血血血血血血清清清清清清白白白白白白蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白（bovine（bovine（bovineserumserumserumalbumin,albumin,albumin,BSA）BSA）BSA）、卵卵卵卵卵卵白白白白白白蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白（OvalbuminOvalbumin，OVA）OVA）OVA）等。

等。

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结合比例为结合比例为结合比例为结合比例为结合比例为结合比例为5kDa5kDa5kDa结合结合结合结合结合结合555252525个分子的小肽。

个分子的小肽。

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实实实实例例例例周柔丽老师实验室的工作周柔丽老师实验室的工作周柔丽老师实验室的工作周柔丽老师实验室的工作针对针对针对针对EC2EC2的一段的一段的一段的一段1010肽序列制备了肽序列制备了肽序列制备了肽序列制备了pAbpAb（三）抗体（三）抗体（三）抗体（三）抗体（antibody,（antibody,AbAb）11、抗体：

、抗体：

、抗体：

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机机机机体体体体受受受受到到到到抗抗抗抗原原原原刺刺刺刺激激激激后后后后，由由由由浆浆浆浆细细细细胞胞胞胞合合合合成成成成并并并并分分分分泌泌泌泌出出出出一一一一类类类类具具具具有有有有与与与与抗抗抗抗原原原原发发发发生生生生特特特特异异异异性性性性结结结结合合合合的的的的球球球球蛋蛋蛋蛋白白白白，被称为抗体。

被称为抗体。

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抗体主要存在于血清内；抗体主要存在于血清内；抗体主要存在于血清内；抗体主要存在于血清内；抗体主要存在于血清内；抗体主要存在于血清内；抗抗抗抗抗抗体体体体体体都都都都都都是是是是是是免免免免免免疫疫疫疫疫疫球球球球球球蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白，但但但但但但免免免免免免疫疫疫疫疫疫球球球球球球蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白并并并并并并不不不不不不一一一一一一定定定定定定都都都都都都是抗体。

是抗体。

是抗体。

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免免免免免免疫疫疫疫疫疫球球球球球球蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白根根根根根根据据据据据据重重重重重重链链链链链链的的的的的的结结结结结结构构构构构构及及及及及及抗抗抗抗抗抗原原原原原原特特特特特特异异异异异异性性性性性性不不不不不不同同同同同同分分分分分分为五种，既为五种，既为五种，既为五种，既为五种，既为五种，既IgGIgGIgG、IgDIgDIgD、IgEIgEIgE、IgAIgAIgA、IgMIgMIgM。

IgGIgGIgG、IgDIgDIgD、IgEIgEIgE及血清型及血清型及血清型及血清型及血清型及血清型IgAIgAIgA分子均为单体分子；分子均为单体分子；分子均为单体分子；分子均为单体分子；分子均为单体分子；分子均为单体分子；分泌型分泌型分泌型分泌型分泌型分泌型IgAIgAIgA为双聚体，为双聚体，为双聚体，为双聚体，为双聚体，为双聚体，IgMIgMIgM为五聚体，呈星型。

为五聚体，呈星型。

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人人人人人人的的的的的的各各各各各各种种种种种种IgIgIg结结结结结结构构构构构构的的的的的的模模模模模模式式式式式式图图图图图图22、免免免免疫疫疫疫组组组组化化化化实实实实验验验验中中中中常常常常用用用用的的的的抗抗抗抗体体体体：

单单单单克克克克隆隆隆隆抗抗抗抗体体体体和多克隆抗体。

和多克隆抗体。

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单单单单单单克克克克克克隆隆隆隆隆隆抗抗抗抗抗抗体体体体体体：

是是是是是是一一一一一一个个个个个个BBBBBB淋淋淋淋淋淋巴巴巴巴巴巴细细细细细细胞胞胞胞胞胞克克克克克克隆隆隆隆隆隆分分分分分分泌泌