质粒DNA的提取、定量、PCR鉴定.ppt
《质粒DNA的提取、定量、PCR鉴定.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒DNA的提取、定量、PCR鉴定.ppt（66页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
质粒质粒质粒质粒DNADNA的提取、定量、的提取、定量、的提取、定量、的提取、定量、与与与与PCRPCR鉴定鉴定鉴定鉴定王妮莎王妮莎一、实验流程一、实验流程简述实验内容流程，简述实验内容流程，PCR操作步骤操作步骤煮菌，煮菌，PCR（PCR程序最后设程序最后设4保温）保温）约约2小时收集小时收集PCR产物产物学习学习PCR原理原理质粒质粒DNA提取提取（约（约1小时）小时）紫外检测定量知识（计算方法），步骤紫外检测定量知识（计算方法），步骤紫外检测紫外检测定量定量琼脂糖电泳原理琼脂糖电泳原理电泳电泳（样品：
质粒（样品：
质粒DNA，PCR产物，酶切产物，产物，酶切产物，Marker）约约30分钟分钟观察电泳结果、观察电泳结果、记录、拍照、保存记录、拍照、保存二、实验目的二、实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握碱裂解法提取质粒的方法了解和掌握紫外吸收检测了解和掌握紫外吸收检测DNADNA浓度与纯度的原浓度与纯度的原理和测定方法理和测定方法学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNADNA的的构型、分子量的大小构型、分子量的大小掌握掌握PCRPCR基因扩增的原理和操作方法基因扩增的原理和操作方法聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）（PCR）PolymeraseChainReactionPolymeraseChainReactionPolymeraseChainReaction仪器仪器仪器仪器:
PCR:
PCR仪仪仪仪（BioRadBioRadMJmini）MJmini）台式离心机台式离心机台式离心机台式离心机灭菌的薄壁离心管灭菌的薄壁离心管灭菌的薄壁离心管灭菌的薄壁离心管微量加样枪微量加样枪微量加样枪微量加样枪凝胶电泳系统等凝胶电泳系统等凝胶电泳系统等凝胶电泳系统等凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统一、实验仪器11、菌液：
菌液：
菌液：
菌液：
DNADNA模板模板模板模板大肠杆菌大肠杆菌DH5a菌株菌株（含靶基因含靶基因含靶基因含靶基因CHD5CHD5片段的片段的片段的片段的pMD19-T）二、实验材料22、引物：
、引物：
、引物：
、引物：
正向引物：
正向引物：
正向引物：
正向引物：
5GTA5GTAAAAAAACGACGACGGCGGCCACCAGT3GT3反向引物反向引物反向引物反向引物:
5CAG:
5CAGGAAGAAACAACAGCTGCTATGATGAC3AC333、2Premix2Premix：
TaqTaq酶：
酶：
酶：
酶：
5U/l5U/l4dNTP:
10mMeach4dNTP:
10mMeach10buffer:
500mM10buffer:
500mMKClKCl,100mM,100mMTris-HClTris-HCl（pH8.3）（pH8.3）MgCl2:
25mMMgCl2:
25mM44、灭菌去离子水、灭菌去离子水、灭菌去离子水、灭菌去离子水二、实验材料9494预变性预变性预变性预变性22分钟后开始以下循环分钟后开始以下循环分钟后开始以下循环分钟后开始以下循环94309430秒秒秒秒55305530秒秒秒秒3030循环循环循环循环72607260秒秒秒秒728728分钟；分钟；分钟；分钟；44保温。
保温。
保温。
保温。
实验过程约实验过程约实验过程约实验过程约11小时小时小时小时3030分钟分钟分钟分钟三、实验步骤温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727250509494变性变性变性变性（30s30s）5050退火退火退火退火（30s30s）7272延伸延伸延伸延伸（60s60s）循环循环循环循环11循环循环循环循环22循环循环循环循环33PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCRPCRPCRPCR反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNADNADNA变性、引物退火和变性、引物退火和变性、引物退火和变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。
图中设定的反应参数是反应延伸三个步骤完成的。
图中设定的反应参数是反应延伸三个步骤完成的。
图中设定的反应参数是反应延伸三个步骤完成的。
图中设定的反应参数是94949494变性变性变性变性30s30s30s30s，50505050退火退火退火退火30s30s30s30s，72727272延伸延伸延伸延伸60s60s60s60s。
如此周而复始，重复进。
如此周而复始，重复进。
如此周而复始，重复进。
如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
DNA变性形成2条单链DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍灭菌去离子水灭菌去离子水11ll2*PremixPremix25ll正向引物正向引物-SO100（10M）22ll反向引物反向引物-SO101（10M）22ll菌液：
菌液：
菌液：
菌液：
1010ll总体积总体积50ll1.菌液煮沸菌液煮沸10min2、取、取0.2mlPCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂试剂（注意每换一种试剂换一个新吸头注意每换一种试剂换一个新吸头,且且PCR反应管标记在侧面反应管标记在侧面）：
如配好的反应液较多沾到管壁上，可将如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖上反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖上盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪（PCR仪仪）上。
上。
四、结果分析1、用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定;2、加5uLPCR产物进行电泳;3、预期PCR产物大小约400500bp;*由由由由1985198519851985年穆里斯（年穆里斯（年穆里斯（年穆里斯（K.MullisK.MullisK.MullisK.Mullis）发明，他也因此获得了）发明，他也因此获得了）发明，他也因此获得了）发明，他也因此获得了1993199319931993年的诺贝尔化学奖。
年的诺贝尔化学奖。
年的诺贝尔化学奖。
年的诺贝尔化学奖。
PCRPCR（PolymeraseChainReactionPolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，）即聚合酶链式反应，）即聚合酶链式反应，）即聚合酶链式反应，是指在是指在是指在是指在DNADNA聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以DNADNA为模板，特定引物为为模板，特定引物为为模板，特定引物为为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制体外复制体外复制体外复制DNADNA的过程。
的过程。
的过程。
的过程。
五、实验原理五、实验原理PCR反应系统的组成反应系统的组成ll模板模板DNAll引物引物lldNTPll耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶ll缓冲液缓冲液（一一一一）模板模板模板模板DNADNAPCR可以以可以以DNA或或RNA为模板进行核酸的体为模板进行核酸的体外扩增。
外扩增。
模板的浓度要适当模板的浓度要适当基因组基因组基因组基因组DNADNA：
50-10050-100ngng质粒质粒质粒质粒DNA:
5-10DNA:
5-10ngng95模板DNA（二二二二）引物引物引物引物与摸板与摸板DNADNA链互补的小片段链互补的小片段DNADNA分子；分子；作为作为DNADNA复制的起始点，复制的起始点，即与目的片段即与目的片段互补的一段寡核苷酸链。
互补的一段寡核苷酸链。
PCRPCR特异性反应的关键；特异性反应的关键；引物引物11引物引物2255引物的特异性：
引物的特异性：
引物的设计与合成对引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定的成功与否起着决定性的作用性的作用引物的浓度：
引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性引物的浓度：
引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成加引物二聚体的形成一般认为一般认为PCR反应中引物的终浓度为反应中引物的终浓度为0.21mol/L为宜为宜引物的设计：
使用引物设计软件引物的设计：
使用引物设计软件Oligo6,Primerpremier,NTI9.0,Omiga,Dnastar等等引物的设计原则：
引物的设计原则：
1.长度一般为1530bp2.GC含量一般为40603.引物二聚体
（1）不应有自身互补序列
（2）两个引物之间不应有多于4个碱基的互补4.引物修饰5端可修饰，3端不能进行修饰5.同源性与非特异结合区同源性不超过706、Tm值高于55（三）（三）Taq酶酶从水生栖热菌从水生栖热菌ThermusAquaticus（Taq）中分离出）中分离出的热稳定性的热稳定性DNA聚合酶聚合酶酶浓度：
酶浓度：
酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增酶的浓度太高则会出现非特异性扩增每每100l反应液中含反应液中含1-2.5UTaqDNA聚合酶为佳聚合酶为佳保存：
保存：
-20引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus）酶酶酶酶活活活活性性性性（%）温度温度温度温度（）40506070809010080604020（四）（四）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度四种四种dNTP浓度应相等浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与可与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。
聚合酶的活性。
（五）（五）Mg2+Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂。
聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
反应体系。
Mg2+浓度过低会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产量下降；产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。
过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的等的浓度影响反应中游离的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
浓度。
变性温度与时间变性温度与时间变性充分：
变性温度越高，时间越长变性就越充分。
变性充分：
变性温度越高，时间越长变性就越充分。
变性温度、时间要适应：
温度过高、时间过长又会影响变性温度、时间要适应：
温度过高、时间过长又会影响TaqTaqDNADNA聚合聚合酶的活性，酶的活性，变性温度变性温度90-9590-95为宜。
为宜。
退火温度与时间：
退火温度与时间：
复性温度决定着复性温度决定着PCRPCR的特异性。
温度越低复性越好，的特异性。
温度越低复性越好，升高复性温度可以增加非特异性结合，大多数升高复性温度可以增加非特异性结合，大多数PCRPCR反应的反应的复性温度在复性温度在353570,70,一般低于引物一般低于引物TmTm值的值的55左右。
左右。
复性时间并不是关键因素。
但复性时间太长会增加非特异的复性。
复性时间并不是关键因素。
但复性时间太长会增加非特异的复性。
引物延伸温度一般
升级会员 