分子生物学课后习题改.docx

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分子生物学课后习题改

1.基于晶体结构，简图显示RNA聚合酶核心酶的大致结构，指出亚基、催化活性中心和利福平结合位点的位置。

根据结构，提出利福平抑制转录的可能机制。

答：

X射线晶体图像显示RNA聚合酶核心酶性状类似一个蟹螯，转录的过程中DNA被夹在中间的孔道中。

核心酶组成为两个α亚基，一个β亚基，一个β’亚基。

β亚基具有DNA结合和合成RNA磷酸二酯键的作用，为催化RNA合成的活性中心的一部分，同时也是利福平结合的位置。

利福平与RNA聚合酶的β亚基牢固结合，抑制细菌RNA的合成，从而阻断RNA转录过程。

（图略）

2.全酶的晶体结构中没有包括sigma1.1区。

推断sigma1.1区在全酶的位置，并说明支持的理由。

答：

sigma1.1区可能位于全酶“蟹螯”的孔道的位置，sigma1.1区使孔道撑开，保持了孔道的开放，使得DNA链有机会进入。

在DNA进入孔道后sigma1.1便被全酶所遗弃，孔道因此闭合。

所以在全酶晶体结构中没有观察到sigma1.1区。

Sigma亚基缺失前91个氨基酸（region1.1）后，全酶结构中有一个狭窄的裂隙，以至于不能接纳DNA模板，表明缺失结构域有可能帮助撬开酶的裂隙，以与DNA结合。

从而推断出sigma1.1区的存在。

3.如何理解sigma因子转换控制转录过程？

答：

sigma因子包含于RNA聚合酶全酶中，其与RNA聚合酶核心酶统称为RNA聚合酶全酶，它的存在决定着RNA聚合酶所转录的基因的特异性，不同的sigma因子识别特定的基因的启动子，从而使得不同的基因得到表达。

例如在噬菌体SPO1侵染枯草芽孢杆菌的过程中，再侵染的前5分钟内，SPO1的RNA聚合酶与宿主的sigma因子结合，表达早起基因，其中包括gp28,一种中期表达的sigma因子。

在5-10分钟的时候，RNA聚合酶与gp28结合，进行中期表达，表达出gp33,gp34，这两种蛋白则是SPO1晚期表达所需的sigma因子的两个亚基。

在10分钟以后的阶段，RNA聚合酶结合以上的sigma因子，从而进行晚期表达。

这种sigma因子的转换控制转录的过程也在细菌孢子形成，细菌应对热激和饥饿时，表达不同基因以应对环境压力方面起到很重要的作用。

4.解释N和NusA在转录终止和抗终止中的作用。

答：

在延伸复合物EC通过TL和TR1区合成U串时，第7个U后暂停，持续2s.如发夹形成则终止。

当没有N和NusA存在时，准发夹上游部分与核心聚合酶上游结合位点UBS结合,蛋白质-RNA键断裂，发夹迅速形成，转录终止。

当只有NusA存在时，NusA帮助打开UBS和准发夹上游部分的结合，加速发夹在暂停结束前形成，促使终止发生，当只有N存在时，N蛋白与准发夹上游部分结合，减缓发夹形成，使终止不易发生。

当N和NusA同时存在时,N蛋白不仅与准发夹的上游结合，也使NusA容易与邻近位置结合，使发夹形成更慢，终止更不易发生。

5.利用模型解释lambda噬菌体感染的大肠杆菌中cI和cro的竞争是如何导致溶源态或裂解态的建立？

答:

cI的大量表达可以阻止早期基因的表达，从而使lambda噬菌体保持溶源态，而cro和N的大量表达则使之进入裂解态。

Cro和N的基因的操纵子OR和OL可细化分为3个部分，cI可以二聚体的形式，以OR1、OR2、OR3的顺序依次结合于OR和OL,导致Cro和N基因转录的抑制。

并激活PRm，进一步增加cI的表达，抑制早期基因的表达，使得lambda噬菌体维持溶源态。

而Cro则可以二聚体的形式，以OR3、OR2、OR1的顺序依次结合于OR，抑制cI以及其自身的表达。

这样Cro便使阻止溶原化的“维持”循环不能实现。

从而使lambda噬菌体进入溶菌周期。

6.100%引起裂解态的lambda噬菌体中，什么可能发生了突变？

100%引起溶源态的lambda噬菌体？

如果N基因突变失活，期望得到什么样的细菌？

答：

100%引起裂解态的lambda噬菌体中，cI,cII,cIII基因其中之一或全部可能发生了突变或缺失，因为cI是使lambda噬菌体保持溶源态的主要基因，而cI的表达需要cII的诱导，而cII在没有cIII结合的情况下很快就会被HflA蛋白所降解。

因此，这三种基因对于lambda噬菌体维持溶源态都至关重要。

而100%引起溶源态的lambda噬菌体可能是Cro基因发生了突变或缺失，因为Cro蛋白与cI蛋白竞争结合于OR是引发lambda噬菌体进入溶菌态的主要原因。

N基因的作用是转录抗终止，如果N基因突变失活，使得RNA聚合酶无法越过TL和TR1而继续表达延迟早期基因，导致lambda噬菌体负责整合自身DNA于宿主基因组上的整合酶以及裂解宿主菌的裂解酶等都无法表达，致使宿主菌既不进入溶源周期也不进入溶菌周期。

然而其仍然可以利用宿主菌的RNA聚合酶和营养持续表达Ｎ蛋白和Cro蛋白，而这两种蛋白对宿主菌是无用的。

因此，其对宿主菌的影响除了施加一定的生长压力外无太大影响。

7.在蛋白质-DNA相互作用中，氢键网络有何作用？

答:

氢键网络的作用主要还是加强蛋白质与DNA的结合能力，使蛋白以正确的空间位置嵌入DNA双链的大沟或小沟中，从而充当转录调控原件，调控DNA的转录。

8.谷氨酰胺和精氨酸侧链与DNA之间倾向于何种作用？

答：

这二者之间倾向于氢键作用。

9.氨基酸的亚甲基和甲基基团与DNA之间倾向于产生何种作用？

答：

氨基酸的亚甲基和甲基基团与DNA之间倾向于疏水相互作用，如甲硫氨酸的侧链甲基如DNA的疏水部位之间的相互作用。

10.色氨酸加入trp阻遏蛋白后引起蛋白质构象的怎样变化？

答：

色氨酸加入后，识别螺旋E的位置发生移动，由下向上，进入操纵基因大沟，与该位置上的DNA完美结合，Sigler称之为阅读头（readinghead）,类似录音机加载或退盘的情况。

色氨酸与阻遏物离开，留下的空隙允许阅读头离开大沟匹配位置。

Trp阻遏物中色氨酸的邻近分子，上方Arg84,下方Arg54.形成三明治结构。

Arg54位于阻遏蛋白二聚体中心，Arg84位于阅读头的结合面上，因此插入色氨酸使阅读头推向大沟。

无色氨酸时，两个精氨酸连在一起，填补空位。

11.E.colisigma54如何发挥增强子作用？

答：

大肠杆菌sigma54（sigmaN），氮源缺乏时，可以从另一个启动子转录glnA基因。

Sigma54可引起全酶稳定结合到glnA启动子，但本身不能形成开放复合物。

而是由另一个蛋白NtrC结合到增强子上帮助形成开放复合体。

即使增强子与启动子不在同一个DNA环上，如能形成连体环，也能发挥作用。

12.描述表位附加法（EpitopeTagging）从酵母中纯化RNA聚合酶II的原理和过程。

答：

原理：

通过基因工程方法，将一外源功能域重组到酵母RNA聚合酶II的Rpb3亚基上，其它正常亚基仍能够与改变了的Rpb3亚基组装成有活性的聚合酶。

从而通过免疫共沉淀反应可以将与Rpb3结合的RNA聚合酶II其他组分一同分离出来。

过程：

在含有放射性标记氨基酸的培养基中培养酵母细胞，使该聚合酶被标记。

将添加识别表位的酵母RNA聚合酶II与其抗体进行免疫共沉淀反应，使RNA聚合酶与其它杂质蛋白分离，一步获得高纯度的酶。

加入强去污剂SDS使聚合酶中各个亚基分离变性。

凝胶电泳检测变性的聚合酶亚基，获得电泳图。

13.在RNA聚合酶II的催化活性中心有多少个Mg离子参与催化反应？

为什么在酵母RNA聚合酶II的晶体中只检测到一个Mg离子的存在？

答：

RNA聚合酶II的催化活性中心结合两个Mg离子，一个信号较弱。

信号强的Mg离子与活性中心结合紧密；弱的离子结合松散，可能参与结合核苷酸底物，因此酶晶体中检测不到。

14.RNA聚合酶的盖、舵及叉环（forkloop）的功能？

答：

Rpb1的盖结构与DNA-RNA杂交分子作用，使新形成的8个碱基杂交分子之前的DNA-RNA杂交分子发生解离。

然后保持RNA单链的解离状态。

Rpb1的舵结构与盖配合作用，通过与-9和-10碱基相互作用而保持杂交分子的解离。

Rpb2的环结构通过与 RNA的-5,-6, 和-7位相互作用而保持DNA-RNA的杂交状态。

15.RNA聚合酶II的A位点和E位点有何功能？

答：

E位点是核糖核苷酸的进入位点，A位点是磷酸二酯键的形成位点。

16.接头扫描突变的原理和过程。

答：

原理：

在DNA上用已知无启动子活性的短DNA片段替换原有片段，根据其转录活性变化与否来判断启动子的位置。

过程：

在DNA上进行单一位点限制酶切割，造成缺口并消化缺口两端，使酶切位点附近缺失10bp左右的核苷酸，然后用已知无启动子活性的10bp的接头接入切割为点，观察其转录活性，从而判断所切位点是否具有启动子活性。

17.分别说明I类、II类和III类启动子的特点。

答：

I类启动子的特点：

其在物种之间的保守性不高，但基本结构比较保守，具有两个元件：

核心启动子（位于转录起始位点附近）和上游启动元件，这二者之间隔距离对于起始转录效率的影响很大，而序列的删除比插入更易影响启动子的起始转录效率。

I类启动子为一双元启动子，UBF结合于上游的UPE 增加了核心结合因子于核心启动子的结合，从而使RNA聚合酶I定位于转录起始点。

这些元件在转录起始过程中的作用都是至关重要的。

II类启动子的特点：

主要分两大部分，核心启动子和上游启动原件，其中核心启动子又可分为4大部分，BRE（TFIIB识别元件），TATAbox，起始子和下有启动子元件；这四部分中即使缺失一个或几个，其仍具有正常的功能。

下有启动子元件可以取代TATAbox，这两个元件很少同时出现在同一个启动子中。

上游启动子元件具有方向非依赖性而位置依赖性。

III类启动子的特点：

其主要存在于5srRNA和tRNA编码基因的上游。

其拥有两种启动子，上游启动子和下游启动子。

上游启动子包含3个短的共有序列，可以被转录因子结合。

下有启动子又称内部启动子，位于转录区的内部，可以诱发上游一定距离的转录起始。

18.试说明II类前起始复合物中，聚合酶、启动子、TBP及TFIIB,TFIIE,TFIIF,TFIIH的相互作用关系。

答：

TBP和8-10个拷贝的TAFIIs组成TFIID,TFIID在TFIIA的帮助下结合于TATAbox，形成DA复合体。

紧接着TFIIB结合于之上形成DAB复合体，TFIIF帮助RNA聚合酶结合于DNA链上的-34到+17之间，形成DABPolF复合体。

最后TFIIE,TFIIH依次结合形成完整的转录起始前复合体DABPolFEH。

19.说明前起始复合物与三类无TATA盒启动子的结合，区分每种情况的组装因子。

答：

三类无TATA盒启动子，其组装因子的区别主要是利用的TAFII不同：

第一种，启动子区只包含起始子，启动子的识别除TBP外还需要TAFII250和TAFII150，来帮助TBP识别并结合起始子。

第二种，启动子区只包含起始子和DPE，启动子的识别除TBP外同样也还需要TAFII250和TAFII150，来帮助TBP识别并结合起始子和DPE。

第三种，只有上游启动元件GC区，与以上两种不同的是除了前两种TAFII多了一个TAFII110，TAFII110识别GC区，而TAFII110通过TAFII250和TAFII150与TBP结合。

20.如何知道TFIIIA对5SrRNA基因而非tRNA基因的转录是必需的？

答：

TFIIIA含有9个锌指排成一行，可以插入5SrRNA启动子任一边的大沟内，形成紧密的蛋白质-DNA复合物，从结构上说明了TFIIIA对5SrRNA启动子会产生影响。

另根据电泳分析，利用抗TFIIIA的抗体对聚合酶III转录的影响进行分析。

加入抗体前可以清楚的观察到细胞提取物中tRNA和5SrRNA的特征条带，说明二者皆正常表达；然而当加入抗体后仍然有tRNA的条带，说明tRNA仍然可以被正常转录，而5SrRNA的条带消失了，由此说明TFIIIA对5SrRNA基因而非tRNA基因的转录是必需的。

21.分析题：

已知蛋白质X和Y相互作用，如何定位蛋白质X与Y作用的具体区域？

答：

当你确定了两个蛋白质分子之间有相互作用后，利用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白质分子中那些结构起结合调节作用。

你可以先把一个蛋白进行随机缺失，制备一系列缺失体，然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力的大小，直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用的氨基酸序列（称为结构域或motif）。

如果一个蛋白分子中具有已知的结构域或motif，也一样进行缺失，看是否这些已知的结构域或motif参与结合调节作用。

然而，某些氨基酸序列的缺失可能导致其空间结构的改变，而导致二者无法结合，即虽然缺失的氨基酸不是二者相互作用的区域，但由于这些氨基酸的缺失导致蛋白空间结构发生改变，使活性区域被包埋或无法形成促进结合的空间构象，从而出现假阳性。

为了克服以上弊端，我们可以用计算机对缺失突变后的序列进行空间构象的模拟预测，并把它与蛋白的天然构想进行比对，进一步验证缺失突变的结果。

22.列举真核激活因子3类不同的DNA结合域和3类不同的转录激活域

答：

DNA结合域：

（1）螺旋-转折-螺旋结构，这一类蛋白质分子中有至少两个α螺旋，中间由短侧链氨基酸残基形成“转折”，近羧基端的α螺旋中氨基酸残基的替换会影响该蛋白质在DNA双螺旋大沟中的结合。

（2）锌指结构，其特有的半胱氨酸和组氨酸残基之间氨基酸残基数基本恒定，有锌参与时才具备转录调控活性。

重复的锌指样结构都是一个α螺旋与一个反向平行的β片层的基部以锌原子为中心，通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成配位键相连接，锌指环上突出的赖氨酸、精氨酸参与DNA的结合。

（3）碱性亮氨酸拉链，一般在蛋白的羧基端35个氨基酸残基具有能形成α螺旋的特点，其中每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，这就导致第7个亮氨酸残基都在螺旋的同一方向出现，这是其形成二聚体的基础。

通过形成二聚体，其使肽链氨基端20-30个富含碱性氨基酸的结构域与DNA结合。

在没有形成二聚体的情况下这20-30个氨基酸与DNA的结合能力很低。

转录激活结构域：

（1）带负电荷的螺旋结构，这种酸性螺旋结构特异性诱导转录起始的活性并不是很强，他们可能与TFIID复合物中某个通用因子或RNA聚合酶II本身结合，并有稳定转录起始复合物的作用。

（2）富含谷氨酰胺的结构，如SP1是启动子GC盒的结合蛋白，除结合DNA的锌指结构以外，SP1共有4个参与转录活化的区域，其中最强的转录活化域很少有极性氨基酸，却富含谷氨酰胺，达该区氨基酸总数的25%左右。

（3）富含脯氨酸的结构域，如CTF-NF1因子，其羧基端富含脯氨酸，达20%-30%左右。

23.染色体结构、组成与基因表达

答：

结构：

所谓染色体,DNA与组蛋白H2A,H2B,H3,H4各两个组成的八聚体核心以一定规律盘绕后形成核小体，众多核小体组成染色质细丝，进一步压缩形成螺线管状结构，再进一步压缩成超螺旋，最后一步压缩形成染色体，总压缩倍数接近1万倍。

大量非组蛋白亦结合于染色体上，功能各异。

组成：

染色体包括DNA和蛋白质两大部分。

蛋白质部分又可分为组蛋白和非组蛋白，组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。

经过多级盘绕形成紧凑的染色体结构。

非组蛋白则包括如下几种：

高速泳动蛋白，其作用可能与DNA的超螺旋结构有关；DNA结合蛋白，它们可能是一些与DNA复制或转录有关的酶或调节物质；A24非组蛋白，其功能不详。

基因表达：

进行基因表达时，核小体组蛋白的N端经乙酰化等修饰，使得DNA暂时脱离组蛋白的束缚，从而在RNA聚合酶和转录因子组成的复合物的作用下进行基因表达，之后组蛋白去乙酰化，DNA与组蛋白重新形成核小体。

染色体上存在一些异染色区，这些区域高度压缩，其中的DNA已经失去了基因表达的活性，无法表达基因产物。

24.绝缘子的结构与功能

答：

结构特点：

绝缘子含有12个与Su（hw）蛋白结合的序列（26bp）Su（hw）蛋白结合DNA后，再结合mod蛋白，产生对启动子激活的单向阻断。

绝缘子一般位于增强子或沉默子与启动子之间，阻断二者对启动子的影响。

绝缘子的功能：

首先，绝缘子可以顺式作用于启动子，阻断增强子或沉默子对启动子的激活或沉默作用。

当绝缘子处于活性基因和异染色质之间时，可提供一道屏障，保护基因，防止染色质延伸所带来的失活效应。

异染色质是染色之上的失活区域，失活是由于高级结构引起的。

绝缘子可以防止异染色质的延伸而保持基因的活性。

25.染色质重塑的步骤与模式

答：

染色质重塑的步骤：

组蛋白乙酰化酶将局部组蛋白乙酰化，致使缠绕于核小体上的DNA解开（此过程也可由ATP依赖的染色质重塑因子介导），在mediator以及各种转录调控因子的协助下RNA聚合酶识别DNA启动子，进行基因的转录。

转录完毕RNA聚合酶脱离DNA双链，在组蛋白去乙酰化酶的作用下DNA重新缠绕于核小体上。

DNA重新缠绕于核小体的位置可能发生变化。

染色质重塑的模式：

（1）滑动模式，激活因子与核小体争夺DNA特定位点，导致DNA链发生局部滑动，使目标DNA序列暴露于相邻两核小体之间位置。

当激活因子脱离此DNA结合位点后，DNA又重新盘绕于核小体上。

（2）重建模式，核小体与DNA完全解离，然后重新结合。

（3）分离模式，H2A和H2B形成的两个二聚体发生解离，然后重新结合。

（4）置换模式，H2A和H2B形成的两个二聚体发生解离，之后置换成另外两个H2A、H2B二聚体。

（此题纯属瞎蒙）

26.组蛋白密码

答：

所谓组蛋白密码假说，即DNA编码的遗传信息的转录一定程度上受到组蛋白不同化学修饰的调节。

答：

a-+

b-+

c-+

d--

e++

f-+

g++

答：

A=LacI,C=O,B=Z4.LacI-O+Z+/LacIsO+Z+5.LacI-O+Z+/LacI+O+Z+